以下の名称は日本における東ソー株式会社の登録商標です バイオアシスト / B I O A S S I S T E n v i r o p a k / エンバイロパック Enviropak/ エンビロパック Lipopropak/ リポプロパック トヨパール / T O Y O P E A R L ト

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1 以下の名称は日本における東ソー株式会社の登録商標です バイオアシスト / B I O A S S I S T E n v i r o p a k / エンバイロパック Enviropak/ エンビロパック Lipopropak/ リポプロパック トヨパール / T O Y O P E A R L トヨパールパック / T O Y O P E A R L P A K マイショリディスク PStQuick TSKgel SuperOligo SuperOligo NPR 以下の名称は日本 米国 欧州共同体 中国等における東ソー株式会社の登録商標です TSKgel BioAssist Lipopropak TSKgel STAT TSKgel SuperMultipore TOYOPEARL TOYOPEARL GigaCap TOYOPEARL MegaCap ToyoScreen TOYOPAK HLC は日本 中国における東ソー株式会社の登録商標です 外観 仕様は予告なく変更することがあります 掲載写真と説明文 構成ユニットは異なる場合があります 製品の多くは毒性 安全性について検査されていません 特に警告 注意がなくても 無害 無毒であると保証されている訳ではありません 当社製品を使用して得られた分離精製物または精製溶液を 製品及び中間体として使用する場合は 十分にその安全性の確認を行ってご使用ください 記載されたデータは当社が取得した参考データで 保証するデータではありません お客様の使用環境 条件 判断基準に合わせてご確認もしくはデータの取得をお願い致します TOYOPEARL 総合カタログ バイオサイエンス事業部 海外でのお求めについて 東京本社営業部 1() FAX() 東京都港区芝 大阪支店バイオサイエンスG 1(6) FAX(6) 大阪市中央区高麗橋 名古屋支店バイオサイエンスG 1(52) FAX(52) 名古屋市中区栄 福岡支店 1(92) FAX(92) 福岡市中央区天神 仙台支店 1(22) FAX(22) 仙台市青葉区本町 山口営業所 1(84) FAX(84) 山口県周南市清水 カスタマーサポートセンター 1(467) FAX(467) 神奈川県綾瀬市早川 バイオサイエンス事業部ホームページ HPLC Applications Database お問い合せ 製品全般 カタログに関するお問い合せ hlc@tosoh.co.jp カラム 分離に関するお問い合せ tskgel@tosoh.co.jp 装置の技術相談に関するお問い合せ csc@tosoh.co.jp TSKgel TOYOPEARL は 海外でもご購入できます 海外でのお問い合せは下記までお願いいたします Tosoh Bioscience LLC Address:64 Horizon Drive Suite, King of Prussia, PA 1946, USA Telephone: Fax: Tosoh Bioscience GmbH Address:Im Leuschnerpark 4, 6447 Griesheim, Germany Telephone: Fax: Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd. Address:Room 1, Innov Tower, Block A, 181 Hong Mei Road, Xu Hui District, Shanghai 2, China Telephone: Fax: Tosoh Asia Pte., Ltd. Address:6 Market Street #- Singapore Telephone: Fax: TOYOPEARL Bulk Resin TSKgel Bulk Resin Product Guide 571GX- 品番 9944 D

2 はじめに 目次 はじめに 製品概要 4 サイズ排除クロマトグラフィー 5 製品の特長 6 製品一覧 イオン交換クロマトグラフィー 11 製品の特長 12 製品一覧 21 疎水クロマトグラフィー 25 製品の特長 26 製品一覧 2 ミックスモードクロマトグラフィー 5 製品の特長 6 製品一覧 8 TOYOPEARL 充塡剤 TOYOPEARL はラボスケールから生産スケールまでのクロマト グラフィーに適した親水性ポリマー充塡剤です 機械的強度の高い ポリマー骨格を持つため 市販されている多くの充塡剤よりも優れ た圧損 / 流速特性を示します 高い線速度で溶液を流せることから プロセスの生産性向上とサイクル時間の短縮に大きく寄与します TOYOPEARL は ph 2 12 の範囲で安定であり 更に洗浄の場 合では ph 1 1 の範囲まで使用することができます 平均粒子径 として 5μm( 一部 μm) μm( 一部 75μm) 及び μ m のタイプを用意しておりますので初期精製 中間精製 高分離能 分離工程などの目的に合わせてお使いいただけます また 細孔径 の異なる製品が用意されており サイズ排除 イオン交換 疎水 ア フィニティークロマトグラフィーなどの各種分離モードに対応可能 です 細孔径と表面積を最適化することにより目的成分の分子サイ ズによらず高い動的吸着量が得られます TSKgel 充塡剤と同じ化学組成で作られており TSKgelを使用して開発したメソッドをシームレスにスケールアップすることができます TSKgel 5PW 充塡剤 TSKgelカラムで使用されている粒子径 μm 及び μmの充塡剤が用意されており 生産スケールのイオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィーにご利用いただけます これらの製品は機械的強度と吸着性に優れ 高い分離性能と理論段数が必要とされる分取用やプロセス用の充塡剤としてご利用いただけます TSKgelカラムのさらに詳しい情報をご希望のお客様は当社の TSKgel / TOYOPEARL 総合カタログ をご請求ください スクリーニング プロセス開発用カラム ToyoScreen MiniChrom RoboColumn ToyoScreenは 各種 TOYOPEARLを充塡した簡易型のスクリーニング用カラムです 1 ml 5 mlのカートリッジカラムが用意されており 精製プロセス開発のための充塡剤スクリーニングや分離条件の初期検討が 汎用 LCシステム等に接続して容易に行えます MiniChromは カラムサイズ 8 mm I.D. cm( 容量 5 ml) で ToyoScreenカラムでのスクリーニング後 分離条件の至適化や小スケールでの分取精製用に設計されたカラムです RoboColumnは Tecan 社 Freedom EVO のような全自動分注システムとの組み合わせで使用するミニカラムでハイスループットでの充塡剤スクリーニングや条件検討が可能です MiniChrom RoboColumn は Atoll GmbH の登録商標です Freedom EVO は Tecan Group Ltd. の登録商標です 安全性データと保証すべてのバルク充塡剤の安全性データシート (SDS) が常にアップデートされています TOYOPEARLのGMP バリデーション支援データ 法規制関連資料医薬品などの製造にTOYOPEARLをご使用いただくため TOYOPEARLの各種基礎データの充実を図り GMPやバリデーション支援を行っています 法規制関連 化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律 ( 化審法 ) に関する届出 少量新規化学物質に関する届出 GMP バリデーション支援 試験データ バイオバーデン対応 ( 医薬品等の製造原料の微生物汚染に関する品質保証 ) 製品の長期放置安定性試験 製品溶液中の全有機炭素 (TOC) 定量試験 製品中の残留モノマー確認試験 有機溶媒洗浄における溶出物の定量試験 製品の安全性試験 ( 毒性試験 変異原性試験等 ) アルカリ溶液中での長期放置安定性試験 アルカリ溶液中での溶出物の同定試験 アルカリ溶液を用いたCIPにおける耐久性試験 TOYOPEARL CIPマニュアル 上記試験データの内容等の詳細につきましては 当社営業までお問い合せください 上記試験データは そのグレード 数値を保証するものではありません TOYOPEARL のバリデーションを含めたインハウスセミナーも行っております 詳細は 当社営業までお問い合せください アフィニティークロマトグラフィー 9 製品の特長 4 製品一覧 48 TOYOPEARL の使用法 充塡法

3 製品概要 サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) µm TOYOPEARL 4EC 75 µm TOYOPEARL 4C TOYOPEARL C TOYOPEARL 55C TOYOPEARL C 45 µm TOYOPEARL 4F TOYOPEARL F TOYOPEARL 55F TOYOPEARL F TOYOPEARL 75F µm TOYOPEARL 4S TOYOPEARL S TOYOPEARL 55S TOYOPEARL S TOYOPEARL 75S 4

4 サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) プロセス精製におけるサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の役割 サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) は 水溶液中の分子の大き さにより 充塡剤内での浸透性が異なることで分離されます 充塡カ ラムの中の充塡剤の最大細孔径よりも大きなサイズを持つ分子は充 塡剤粒子の細孔内部へ入り込むことができず 充塡剤粒子の間を素 通りして最初に溶出します より小さな分子は充塡剤粒子内の細孔 に入り込めるため溶出が遅くなります 従って分子量の大きい順に 溶出します SECは 目的とするたんぱく質を凝集体や大幅に分子量の異なる不純物から分離するための最終精製ステップとしても使用されます また 精製後のたんぱく質の脱塩処理にも利用されます TOYOPEARL HWタイプには種々の粒子径 細孔を有する充塡剤があります ( 表 1 参照 ) これらの SEC 用 TOYOPEARL HWシリーズにイオン交換基や疎水基 アフィニティーリガンドなどを導入して化学的に修飾した充塡剤も用意しています 充塡剤の化学構造 TOYOPEARLサイズ排除クロマトグラフィー充塡剤は水酸基が導入されたポリマー充塡剤です ( 図 1) 表面の水酸基がたんぱく質のSEC 分離に有効に機能します TOYOPEARLは 官能基を導入したタイプを含めて クロマトグラフィー用充塡剤の中でも非特異的吸着の低い製品です 例えば血液成分の分離では充塡剤と試料との相互作用が目的物質の回収率低下の原因となることから この非特異的吸着が低いことが特に重要です また 半硬質ゲルであるため アガロース系のような軟質充塡剤と比較して優れた圧損 / 通液特性を有しています グレード ー い 細孔径 SEC 用のTOYOPEARL HWタイプには5 段階の分画範囲に対応するグレード 細孔径が用意されています どのタイプが最適であるかは試料中に含まれる成分の分子量に依存します たんぱく質 デキストラン PEGポリマーを対象としたときの選択条件をまとめて表 1 表 2に示します ー ー の CH CH CH 2 C CH 2 C CO O O CO R 2 R 2 CH 2 C CH 2 CO り ( / の) の O R 1 O CO C CH CH R 1 Al g R 2 Hle l g 図 1 TOYOPEARL SEC 充塡剤の化学構造 ( ヒドロキシアクリル ) 表 1 TOYOPEARL HW タイプの特性と分子量分画範囲 TOYOPEARL レグ ー く (μm) (m) レド (を) 4S 4 5, 7,, 4F 6 4C S ,, 8, F 6 55S 4 1, 1,, 1, 7, 55F 6 S 4 1,,, 1,, 4, 5,, F 6 75S 4 4, 5,,,,,,,, 75F 6 表 2 TOYOPEARL HW タイプの適用分子量範囲 Lee m 12 ACTH l Cme C Rlee A -Cmge Olm Alm Hm-ll Alle Cle ee Tgll le e Hem Pl RA く 量 タ ード 業 カ での (. P) 55 の しても カ ド容量の い 75 (H 2 14) TSKgel HPLC (CP) にお カ での (4 6 ) 121での ー レー に TSKgel HPLC カ ー 4 55 レ グ ー レ ド

5 サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) TOYOPEARL HWタイプで分画可能な範囲はペプチドからたんぱく質まで 分子量として,,の範囲です 図 2 にTOYOPEARL HWタイプの球状たんぱく質に対する較正曲線を示します Lg W e / カ 22 mm.. m く.6 ml/l り (H 7.).6 ml/l KCl e el lme, lm lme (28 m) 図 2 TOYOPEARL HWタイプの球状たんぱく質に対する較正曲線 粒子径分離能は粒子径が小さくなるほど向上します ( 図 ) TOYOPEARL HWタイプには 種類の粒子径を有するグレードが用意されています : Sグレード : 4μm(Superfine) Fグレード : 6μm(Fine) Cグレード : μm(coarse) 高い分離能を必要とする場合は より粒子径の小さなSまたはF グレードが使用されます C-ge F-ge S-ge カTOYOPEARL 55, 26 mm.. 7 m. mml/l り(H 7.).2 ml/l C 6 ml/( m/) 25 (28 m) 1. ログロ(. ) 2. - グロ(. ). - グロ(. ) 4. ロ C(.1) 量 1mL El Tme 図 TOYOPEARL 55 の異なる粒子径における分離能の比較 溶離液の影響溶離液の組成もSECの分離に影響します 図 4にTOYOPEARL 55F 充塡カラムを使用し 塩濃度を変えた場合のたんぱく質の較正曲線を示します 塩濃度はたんぱく質の流体力学的半径を変化させる能力を持つため イオン強度の大小によって実効分子サイズが増大または減少し 溶出容量が変化します SEC 測定において目的物質は充塡剤と相互作用をしないというのが理想ですが 実際には分析種と充塡剤との二次的相互作用を最小にするような塩濃度を選択しなければなりません TOYOPEARL SEC 充塡剤の水系溶離液中での特性 優れた機械的強度 ゲルベッド容積がほとんど変化しない 化学的安定性 シャープなクロマトピーク 温度安定性 微生物耐性 TOYOPEARLは有機合成により作られた材料であり 微生物の作用による劣化に耐性があります TOYOPEARL SEC 充塡剤の有機溶媒系溶離液中での特性有機溶媒や有機溶媒と水との混合溶液でも使用することができます ただし 溶媒によっては 表 及び4に示すとおり 溶媒中の水分含量に応じてゲルベッドが収縮または膨潤を起こすことがあります オリゴ糖やポリエチレングリコールのSEC 分離用として DMSOの使用も可能です また DMFも使用できますので DMF を溶媒としてポリスチレンのような疎水性物質をSECで分離することもできます その他の応用 : TOYOPEARL HWタイプはサイズ排除クロマトグラフィーや脱塩用途で用いられますが それ以外にも次のような用途でも使用されています : 生体試料からTriton X-l 等の界面活性剤を疎水的吸着性を除去する 選択する溶媒系によっては逆相用充塡剤としてカテキンなど低分子化合物の分離も可能 Lg W ee l Pe Pe l1. Sl Cleg l 9.4 Sl P l 9.1 Cle l 5.5 -ll l 6.6 Ye AH l 5.4 Ae l 5.5 Hemgl l El lme ml Teml l 5.1 Cmge Al9.5 T l.5 Lme l 11. Re A l 9.5 Cme C l.6 カTOYOPEARL 55F, 22 mm.. m 25 mml/l.5 ml/l Cl(H 7.5)( ) 25 mml/l(h 7.5)( ) 1. ml/m(16 m/) 5- (28 m, 4 m eme e, m e m m ) 図 4 NaCl の添加の有無におけるたんぱく質の SEC 溶出容量の比較 表 TOYOPEARL 充塡剤の各種溶媒における膨潤収縮 TOYOPEARL H 2 O.2 ml/l KCl CH OH 5 C 2 H 5 OH 1 F Aee Tlee 表 4 TOYOPEARL 4の各種溶媒における水に対しての膨潤収縮 TOYOPEARL SO El Aee CHCl / eee CHCl CH OH(1/1)

6 サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) 製品一覧表 TOYOPEARL SEC 充塡剤 品番 品名 容量 粒子径 排除限界 ( デキストラン ) (ml) (μm) (Da) 7447 TOYOPEARL 4S , , 7448 TOYOPEARL 4F , , 7449 TOYOPEARL 4C , , 7452 TOYOPEARL S , 859 5, 745 TOYOPEARL F , 86 5, 7456 TOYOPEARL 55S , 862 5, 7457 TOYOPEARL 55F , 86 5, 7464 TOYOPEARL S , 868 5, 74 TOYOPEARL F , 869 5, 7468 TOYOPEARL 75S , 7469 TOYOPEARL 75F , 872 5, * 価格につきましては TSKgel / TOYOPEARL 総合カタログ をご覧ください * TOYOPEARL 4にはECグレード (-μm) もあります * 容量 1, ml 5, mlの製品の価格につきましては 当社営業までお問い合せください RoboColumn 品番 品名 容量 (μl) 粒子径 (μm) 471 TOYOPEARL 4F TOYOPEARL 4F イオン交換クロマトグラフィー (IEC) µm TOYOPEARL MegaCapSP-5EC µm TOYOPEARL SuperQ-6C TOYOPEARL SP-6C TOYOPEARL QAE-5C TOYOPEARL SP-5C TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL CM-6C TOYOPEARL DEAE-6C 75 µm TOYOPEARL GigaCap Q-6M TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M TOYOPEARL GigaCap CM-6M µm TOYOPEARL SuperQ-6M TOYOPEARL SP-6M TOYOPEARL DEAE-6M TOYOPEARL CM-6M 45 µm TOYOPEARL NH2-7F TOYOPEARL Sulfate-6F 5 µm TOYOPEARL GigaCap Q-6S TOYOPEARL GigaCap S-6S TOYOPEARLSuperQ-6S TOYOPEARL SP-6S TOYOPEARL DEAE-6S TOYOPEARL CM-6S µm TSKgel SuperQ-5PW TSKgel SP-5PW TSKgel DEAE-5PW TSKgel SP-PW µm TSKgel SuperQ-5PW TSKgel SP-5PW TSKgel DEAE-5PW

7 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) イオン交換クロマトグラフィー用 TOYOPEARL 充塡剤イオン交換クロマトグラフィー (IEC) は医薬用たんぱく質の精製などで広く使用されている分離モードです 多くの製薬メーカーがクロマトグラフィーによる成分の吸着や濃縮ステップとしてIECを選択する理由は 他の分離モードと比較して大きな動的吸着量を持つことによります ( 表 1) 充塡剤のイオン交換基 TOYOPEARL 及びTSKgelのIEC 充塡剤は 6 種類の異なるイオン交換基を持つタイプが用意されています ( 表 2 参照 ) 陰イオン交換体 種類 :Q(QAE) DEAE NH2 陽イオン交換体 種類 :SP(S) Sulfate CM これらのイオン交換基のpKa 値をまとめて図 1に示します また特長と用途をまとめて表 2に示します 充塡剤の細孔径基材となる充塡剤の細孔径を幅広い範囲で用意しており イオン交換体としては次の4 種類があります : nm 以上 nm 75 nm nm( 表 4) 表 2 イオン交換基と特長 用途 DEAE タイプ NH2 タイプ イオン交換基 Q( Q A E ) タイプ S P( S ) タイプ Sulfate タイプ CM タイプ 表 イオン交換体の特長 イオン交換 特長 用途 塩濃度が低い試料に適する 吸着が強すぎる試料や 巨大分子量試料に適する 塩濃度が高くても吸着しやすい 抗体の凝集体 巨大分子量試料の吸着に適する 吸着 保持力が強く 凝集体や DNA エンドトキシンなどの吸着除去に フロースルーモードでも利用 塩濃度が高くても吸着しやすい DNAや培養液中の色素や ph 指示薬などが吸着されにくい 初期精製に効果的に利用 塩濃度が高くても吸着しやすい ヘパリンアフィニティーゲルに似た挙動を示す SP(S) タイプと異なる分離選択性を示す (nm) 子 (m) TOYOPEARL GigaCap Q-6M TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M TOYOPEARL SuperQ-6M 4 9 TOYOPEARL DEAE-6M 4 9 TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL QAE-5C 55 1 TOYOPEARL NH2-7F 75 6 表 1 各種分離モードにおける吸着量の比較 容量 (e/l) 吸着量 DC (SA) (g/l) イオン交換 Decreaing rein pk a pk a Toyopearl GigaCap CM-6M.6 図 1 イオン交換基と pka 値 Q,SuperQ,QAE pk a 12.2 DEAE pk a 11.5 NH2 pk a 8 CM pk a 4.7 S,SP pk a ( ヒト免疫グロブリン ) 表 4 TOYOPEARL 及び TSKgel イオン交換体の細孔径 TOYOPEARL or TSKgel GPW TOYOPEARL 6 TOYOPEARL 55 nm 75 nm nm TOYOPEARL GigaCap S-6 TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL SP-5 TOYOPEARL GigaCap CM-6 TOYOPEARL MegaCapⅡSP-5 TOYOPEARL GigaCap Q-6 TOYOPEARL QAE-5 TOYOPEARL GigaCap DEAE-6 TOYOPEARL SuperQ-6 TOYOPEARL DEAE-6 TOYOPEARL SP-6 TOYOPEARL CM-6 TOYOPEARL Sulfate-6F TSKgel SP-5PW (TSKgel SP-PW) TSKgel SuperQ-5PW TSKgel SP-5PW TSKgel DEAE-5PW TOYOPEARL NH2-7F(75 nm) 細孔径の選択吸脱着クロマトグラフィー用 目的物質に適した 適切な細孔径の充塡剤を選択します 初期精製には 大きな粒子径の充塡剤を 中間精製や最終精製には より小さな粒子径の充塡剤を選択します フロースルークロマトグラフィー用 目的物質の大きさが 不純物成分よりも大きい場合は 目的物質を排除するような細孔径の充塡剤を選択することにより 効率の良い精製が可能になります ( この手法はkinetic exclusionとして知られており 吸着条件で目的物質が排除され わずか1% の充塡剤表面しか利用されず 吸着 回収率のロスが最小限である場合に使用されます ) 高分子量不純物の除去法 目的物質が 細孔内部に入り込め かつ不純物は 排除される細孔径の充塡剤を選択します スクリーニング用カラム ToyoScreen TOYOPEARLイオン交換体の全てのグレードで 充塡剤量 1 ml と5 mlカラムが用意されています ToyoScreenは スクリーニング ( 初期検討 ) における目的物質の吸着保持と回収率の検討に適したカラム製品です 複数のカラムを直列接続することで 更に分離を検討することも可能です 複数の粒子径でスケールアップまたはダウンが容易 TOYOPEARL とTSKgel GPWシリーズの製品は共通の化学的性質と選択性を持っていますので イオン交換体のスケールアップまたはスケールダウンが容易です 粒子径を小さくすると分離能は向上しますが 試料成分の溶出順序自体は変化しません イオン交換 (nm) TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL GigaCap CM-6M TOYOPEARL SP-6C ( リ ーム ) TOYOPEARL CM-6C ( リ ーム ) TOYOPEARL SP-5C ( リ ーム ) TOYOPEARL Sulfate-6F 動的吸着量 子 (m) 容量 (e/l) 吸着量 DC ( ヒト免疫グロブリン ) (g/l) 12 1

8 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) オリゴヌクレオチドの精製 オリゴヌクレオチドとペプチドの精製においては より粒子径の小さな充塡剤を用いて 高分離能で分離することが非常に有効です 表 5に異なる粒子径を持つSuperQタイプの陰イオン交換体の特長を示します 相対的な吸着量と分離能を 5 種類の粒子径の異なる充塡剤について 記号表示で示します 記号が多いほうが 相対的に優れていることを示します 製造プロセスが開発され さらに高い分離能が要求される場合は 適宜 粒子径の小さい充塡剤を選択することになります 同様に 分離能ではなく 高速処理が要求される場合は 大きな粒子径の充塡剤を選択することも可能です 表 5に示すようにTOYOPEARL GigaCap Q-6Mは 選択性はSuperQタイプの充塡剤とは少し異なりますが 非常に高い吸着量を示します TSKgel SuperQ-5PWは 他社製品と比べて高い吸着量を示し 試料負荷量が多い条件下でも高い分離能が維持されます 図 2にTSKgel SuperQ-5PW() と他社製品のオリゴヌクレオチド分離の試料負荷量依存性比較データを示します オリゴヌクレオチドの試料負荷量が.2 g/l 充塡剤の場合は 粒子径の小さい他社製品のほうが高い分離能を示しますが 試料負荷量が 4 g/l 充塡剤になると 他社充塡剤では 分離能が著しく低下しています TSKgel SuperQ-5PW() は オリゴヌクレオチドの試料負荷量が多い場合でも 優れた分離能を示します 表 5 各 IEC 充塡剤の特性 TSKgel SuperQ-5PW () TSKgel SuperQ-5PW () TOYOPEARL SuperQ-6S TOYOPEARL SuperQ-6M TOYOPEARL SuperQ-6C TOYOPEARL GigaCap Q-6M TOYOPEARL GigaCap Q-6S TSKgel SP-5PW () TSKgel SP-5PW () TSKgel SP-PW () TOYOPEARL SP-6S TOYOPEARL SP-6M TOYOPEARL SP-6C TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL GigaCap S-6S 子 (m) 子 (m) ペプチドの精製陽イオン交換クロマトグラフィーは ペプチド精製に広く使用されています 表 5に陽イオン交換基としてSPタイプを導入した TOYOPEARLと TSKgel PWタイプの充塡剤を示します 必要な吸着量と分離能に基づいて適切なSPタイプの充塡剤を選択します イオン交換基の導入法表 5に示すように 三世代のイオン交換基の導入法があります 伝統 法または 第一世代のイオン交換基の導入法は 基材表面へ直接イオン交換基をスペーサーとともに導入するものです 第一世代のTOYOPEARL 及びTSKgel PWタイプのイオン交換体には以下の充塡剤があります TOYOPEARL SP-6 TOYOPEARL SP-5 TSKgel SP-5PW TOYOPEARL CM-6 TOYOPEARL Q-5C TOYOPEARL DEAE-6 TSKgel DEAE-5PW TOYOPEARL MegaCapⅡSP-5EC 第二世代のイオン交換基導入法 ( 表 5 タイプA) は 基材表面でイオン交換基とスペーサーをネットワーク化し 吸着表面を増加させたんぱく質吸着量を増やすものです 以下の2 種類の充塡剤が該当します TOYOPEARL SuperQ-6 TSKgel SuperQ-5PW 吸着量 吸着量 分離 分離 イオン タイプA タイプA タイプA タイプA タイプA タイプ タイプ イオン タイプ タイプ 254 nm (ma) 254 nm (ma) 1 TSKgel SuperQ-5PW () in.66 cm I.D. 15 cm 4 C ( mg load) purified oligo 94 purity pea recoery 6 and 94 purity n-1 n1 1 TSKgel SuperQ-5PW () TSKgel SuperQ-5PW () in.66 cm I.D. 15 cm A (1 mg load) n-1 purified oligo 98 purity n Elution olume (ml) Elution olume (ml) 254 nm (ma) 254 nm (ma) A 社 Q タイプイオン 体 (15 m) IEC rein (15m) in.66 cm I.D. 15 cm (1 mg load) n-1 purified oligo 98 purity n Elution olume (ml) IEC rein (15m) in.66 cm I.D. 15 cm 4 D ( mg load) 1 n-1 purified oligo 9 purity pea recoery 45 and 9 purity n Elution olume (ml) カラム.66 cm I.D. 15 cm(5.1 ml)(rein a noted in figure) 試 料 DNA baed oligonucleotide ere loaded a folloed 1 mg/column panel A, mg/column panel C D 1.4 ml /m i n( 2 5 cm/h) 離液 A mmol/l トリス塩 塩 液 mmol/l EDTA(pH 9.) 離液 mmol/l トリス塩 塩 液 mmol/l EDTA 1. mol/l NaCl(pH 9.) 離 カラムを 離液 A で 5 C 試料 カラムを 離液 A で C リニアグラジエント 5-5 離液, 6 C. 離液, 5 C. ( nm) フラクシ ン.5 ml の 分を分 し TSKgel DNA-NPR で分 図 2 TSKgel SuperQ-5PW() を用いたオリゴヌクレオチドの分離 ( 高試料負荷量でも高分離能を維持 ) 第三世代のイオン交換基導入法 ( 表 5 タイプB) は イオン交換基の吸着場 ( 部位 ) を向上させたものです このタイプは 大きな細孔径の内部で たんぱく質が吸着できる空間にイオン交換基を立体的に化学結合させたものです この構造により 吸着量が著しく増加し かつ細孔内部での物質移動も向上しました 物質移動を向上させることで 目的物質の溶出容量を減少することができます ( 図 8) 全てのTOYOPEARL GigaCapシリーズはこのタイプBのイオン交換基導入法に相当します TOYOPEARL GigaCap S-6 TOYOPEARL GigaCap CM-6 TOYOPEARL Sulfate-6F TOYOPEARL GigaCap Q-6 TOYOPEARL GigaCap DEAE-6 TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL NH2-7F

9 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) m TSKgel DEAE-5PW() TSKgel DEAE-5PW() TSKgel DEAE-6S TSKgel SuperQ-5PW() TSKgel SuperQ-5PW() TOYOPEARL SuperQ-6S Q タイプ Q タイプ - 4 min TOYOPEARL GigaCap Q-6S カラム 7. 5 mm I.D. 7.5 cm 離液 A mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.5) 離液 mmol/l トリス塩 塩 液 1. mol/l NaCl(pH 8.5) グラジエント 離液 A 1 min リニアグラジエント 1. ml/min (28 nm) 試 料 1. トランスフ リン (2.9 g/l) 2. オブアルブ ン (6.5 g/l). トリプシンインヒ ター (. g/l) 量 L 図 微粒子イオン交換体の分離選択性の比較 m TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M TOYOPEARL GigaCap Q-6M A 社 DEAE TOYOPEARL DEAE-6M 4 min カラム 7.5 mm I.D. 7.5 cm 離液 mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.5) 離液 mmol/l トリス塩 塩 液 1. mol/l NaCl(pH 8.5) グラジエント A 1 min リニアグラジエント 1. ml/min ( 2 8 nm) 量 25L 試 料 トランスフ リン (2.9 g/l) オブアルブ ン (6.5 g/l) トリプシンインヒ ター (. g/l) 図 4 分離選択性の比較 m TSKgel SP-5PW() TOYOPEARL SP-6S SP タイプ SP タイプ min TOYOPEARL GigaCap S-6S/M カラム 7. 5 mm I.D. 7.5 cm 離液 A 2 mmol/l り 塩 液 ( p H 7.) 離液 2 mmol/l り 塩 液 1. mol/l NaCl(pH 7.) グラジエント 離液 A 6 min リニアグラジエント 1. ml/min (28 nm) 試 料 1. リ クレアー A(9.8 g/l) 2. トクロム C(.6 g/l). リ ーム (6.4 g/l) 量 L 6 4 Q-6AR GigaCap Q-6M SuperQ-6M NH2-7F DEAE-6M 4 6 min カラム 5 mm I.D. 5 cm 離液 A mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.) 離液 離液 A 2. mol/l NaCl(pH 8.) グラジエント 離液 A 1 min リニアグラジエント 1. ml/min ( 2 8 nm) 試 料 SA 1 mg 図 5 各種イオン交換体における BSA の分離挙動 28nm (ma) 7 6 TOYOPEARL GigaCap CM, natie lyoyme 9 TOYOPEARL GigaCap CM, PEG-lyoyme 8 TOYOPEARL GigaCap S, natie lyoyme TOYOPEARL GigaCap S, PEG-lyoyme 4 4 min カラム 6 mm I.D. 4 cm 離液 A mmol/l り 塩 液 (ph 7.) 離液 mmol/l り 塩 液 (ph 7.),.5 mol/l NaCl グラジエント TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL GigaCap CM-6M minute 離液 A minute 離液 A 6minute - 6minute to 1 ml/min 試 料 ネイティブリ ーム 5 g/l, mono-pegリ ーム 5 g/l 図 6 ネイティブたんぱく質と PEG 化たんぱく質の分離選択性比較 表 6 たんぱく質の大きさと動的吸着量 (DBC) の関係 TOYOPEARL GigaCap Q-6M TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M TOYOPEARL SuperQ-6M TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL QAE-5C TOYOPEARL DEAE-6M (nm) 75 カラム 6 mm I.D. 4 cm 試料濃度 1g/L 吸着 離液 SA.5 mol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.5) Human IgG 28 nm (ma) Gradient PEG 化たんぱく質イオン交換体は PEG 化たんぱく質の精製にも よく使用されます 図 6に TOYOPEARL GigaCap CM-6MとTOYOPEARL GigaCap S-6Mを用いた天然型及びmono-PEG 化リゾチームの分離を示します 細孔径とイオン交換基導入方法の動的吸着量への影響表 6に 6 種類のTOYOPEARL 充塡剤における 種類の異なる分子量のたんぱく質の動的吸着量を示します TOYOPEARL GigaCap Q-6Mが 細孔径とイオン交換基導入法の効果により 最も高い吸着量を示しています TOYOPEARL SuperQ-6Mでは イオン交換基導入方法の違いにより 有効な細孔容積が減少したため 巨大たんぱく質の吸着量は減少しています このようなタイプAの充塡剤では スペーサーとイオン交換基のネットワーク構造により 充塡剤の細孔容積が減少します SA 66 Da mol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.7).15 mol/l NaCl Thyroglobulin.5 mol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.7).15 mol/l NaCl 4 Fraction 1 ( モ ー ) Fraction 2 ( 凝集体 ) 吸着量 (g/l) human IgG 16 Da Thyroglobulin 66 Da 71 ー 26 6 離液 吸着 離液 1. mol/l NaCl 1. ml/min(212 cm/h) (28 nm) カラム 5 mm I.D. 5 cm 離液 A mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.) 離液 離液 A 1 mol/l NaCl グラジエント 離液 A 6 min リニアグラジエント 1. ml/min (28 nm) 試 料 M a b( I g G 1,.5 mg) Fraction 2 の凝集体は と どが 2 量体 min 図 7 TOYOPEARL NH2-7F によるモノクローナル抗体 (IgG 1 ) の凝集体の分離 16 17

10 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) 28 nm (ma) TOYOPEARL GigaCap Q-6M A 社 Q タイプイオン 体 At 5 breathrough alue GigaCap Q-6M 1 C A 社ゲル 48 C 1 min カラム 6 mm I.D. 4 cm 試 料 polyclonal human IgG(1 g/l) 吸着 離液 15 mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.7) 離液 15 mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.7) 1. mol/l NaCl 1. ml/min(212 cm/h) (28 nm) 図 8にTOYOPEARL GigaCap Q-6Mと他社同等品のブレークスルーカーブの比較図を示します 図は % のブレークスルーまでの吸着と 溶出のクロマトグラムを示しています TOYOPEARL GigaCap 充塡剤では 他社品に比べ 溶出画分の容量が著しく少なく 高濃度での回収が可能となります TOYOPEARL NH2-7F TOYOPEARL NH2-7Fは TOYOPEARL 75に第 1 級アミノ基を導入した陰イオン交換体で 以下のようなユニークな特性を示します 塩耐性 (salt tolerant) 試料溶液や吸着溶離液の塩濃度が高い状態でも吸着分離が可能な塩耐性を示します 例えば.15 mol/l NaClを含んだ試料に対してpHに関わらず 高い吸着量が維持されます ( 表 8) 塩濃度が高い試料溶液でも 希釈 脱塩といった操作を行うことなく そのまま負荷することが可能です 表 8 動的吸着量の比較 図 8 TOYOPEARL GigaCap Q-6M と他社イオン交換体と 9 の吸着物 ( 抗体 ) の溶出容量比較 表 7 TOYOPEARL GigaCap シリーズのアルカリ耐久性 mol/l NaOH hlgg Dynamic 14 (g/l) mol/l NaOH hlgg Dynamic 99 (g/l) mol/l NaOH SA Dynamic binding capacity (g/l) 18 TOYOPEARL Q-6C AR mol/L NaOH epoure period (day) 図 9 TOYOPEARL Q-6C AR のアルカリ耐久性と動的吸着量 Static 166 (g/l) NA 15 * 16 *12 アルカリ耐久性高吸着量タイプの充塡剤は 目的物質だけでなく不純物や異性体も より多く吸着します 場合によっては.5 mol/lや 1. mol/l NaOH 等のアルカリ溶液による充塡剤の洗浄 再生が必要となります したがって 充塡剤には 高いアルカリ耐久性が要求されます TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL Q-6C ARは 高いアルカリ安定性を示します またTOYOPEARL GigaCap Q-6Mよりは やや小さい細孔径を持ち BSAの吸着量は g/lです 図 9に示すように 1 mol/l NaOH 溶液で 日間保存しても 動的吸着量は変化しません 強い保持力通常の陰イオン交換体に比較して 選択性が異なり 極めて強い保持力を示します ( 図 ) 従来の陰イオン交換体では保持 分離できなかった試料を効率良く精製できます ma(28 nm) 6 NH2-7F 4 Q-6 AR Giga Cap Q-6M Super Q-6M DEAE-6M 4 6 min カラム 5 mm I.D. 5 cm(1 ml) 離液 A mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.) 離液 mmol/l トリス塩 塩 液 2. mol/l NaCl(pH 8.) グラジエント 離液 A 1 min リニアグラジエント 1. ml/min (28 nm) 試 料 オブアルブ ン (1 mg) 図 たんぱく質の溶出挙動 優れた凝集体分離抗体等たんぱく質の凝集体分離に優れます ( 図 11) バイオ医薬品の精製工程において凝集体の除去は重要です 例えば抗体医薬品精製であれば TOYOPEARL NH2-7Fをプロテイン Aの後ステップに使用することで 凝集体を効率的に除去することが可能です ma(28 nm) 4 モ ー 凝集体 min カラム 5 mm I.D. 5 cm(1 ml) 離液 A mmol/l トリス塩 塩 液 (ph 8.) 離液 mmol/l トリス塩 塩 液 1. mol/l NaCl(pH8.) グラジエント 離液 A 6 min リニアグラジエント 1. ml/min (28 nm) 試 料 モ クロー ル抗体 (IgG 1,.5 mg) 図 11 モノクローナル抗体の凝集体の分離 18 19

11 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) TOYOPEARL Sulfate-6F TOYOPEARL Sulfate-6F は 硫酸エステル基を持つ高吸 着量型の陽イオン交換体です 抗体凝集体の分離能に優れ プロテインAの後ステップとしても有効です ( 図 12) さらにヘパリンアフィニティー充塡剤に似た挙動を示し 血液凝固因子等への適用が可能です 図 1はアンチトロンビンⅢ 保持挙動の比較を示したものです 測定を行った条件では 通常の陽イオン交換体では全く保持されないのに対し TOYOPEARL Sulfate-6Fでは保持することが確認されています 28 nm(m) 4 monomer aggregate TOYOPEARL Sulfate-6F C 社 SO 社 SO A 社 SO TOYOPEARL GigaCap S-6M 4 min カラム 7.5 mm I.D. 7.5 cm 離液 A 54 mmol/l 塩 液 (ph 5.5) 離液 54 mmol/l 塩 液 1. mol/l NaCl(pH 5.5) グラジエント 離液 A 6 min リニアグラジエント 1. ml/min 量 9 L 試 料 したモ クロー ルヒト IgG( g/l) 図 12 抗体凝集体分離 28 nm(m) 6 4 TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL Sulfate-6F TOYOPEARL AF-Heparin HC-6M min カラム 7.5 mm I.D. 7.5 cm 離液 A mmol/l り 塩 液 (ph 7.5) 離液 mmol/l り 塩 液 2. mol/l NaCl(pH 7.5) グラジエント 離液 A min リニアグラジエント 1. ml/min 量 L 試 料 アン トロン ン ( g/l) 図 1 アンチトロンビン Ⅲ 保持特性 製品一覧表 陰イオン交換体 TOYOPEARL IEC 充塡剤 品番 品名 容量粒子径イオン交換容量たんぱく質吸着量 (ml) (μm) (eq/l) (BSA, g/l) TOYOPEARL GigaCap Q-6S , , TOYOPEARL GigaCap Q-6M , , TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M , , 1722 TOYOPEARL SuperQ-6S , , TOYOPEARL SuperQ-6M , , 1721 TOYOPEARL SuperQ-6C , 172 5, 7472 TOYOPEARL DEAE-6S , 797 5, 747 TOYOPEARL DEAE-6M , , 7988 TOYOPEARL DEAE-6C , , TOYOPEARL Q-6C AR , , 1426 TOYOPEARL QAE-5C , , 249 TOYOPEARL NH2-7F ( ヒト免疫グロブリンG) 244 1, , 陰イオン交換体 TSKgel IEC 充塡剤 品番 品名 容量粒子径イオン交換容量たんぱく質吸着量 (ml) (μm) (eq/l) (BSA, g/l) 48 TSKgel SuperQ-5PW() , , 428 TSKgel SuperQ-5PW() , , 481 TSKgel DEAE-5PW() , , 4281 TSKgel DEAE-5PW() , 187 5, 21

12 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) 製品一覧表 陽イオン交換体 TOYOPEARL IEC 充塡剤 品番 品名 容量 粒子径 イオン交換容量 たんぱく質吸着量 (ml) (μm) (eq/l) ( リゾチーム, g/l) TOYOPEARL GigaCap S-6S ( ヒト免疫グロブリン ) , , 2184 TOYOPEARL GigaCap S-6M ( ヒト免疫グロブリン ) , , TOYOPEARL GigaCap CM-6M ( ヒト免疫グロブリン ) , , 847 TOYOPEARL SP-6S , 848 5, 7997 TOYOPEARL SP-6M , , 7994 TOYOPEARL SP-6C , , 7474 TOYOPEARL CM-6S , , 7475 TOYOPEARL CM-6M , , 7991 TOYOPEARL CM-6C , , 1428 TOYOPEARL SP-5C , , 2185 TOYOPEARL MegaCapⅡSP-5EC ( インスリン ) , , 2468 TOYOPEARL Sulfate-6F ( ヒト免疫グロブリン ) , 247 5, 陽イオン交換体 TSKgel IEC 充塡剤 品番 品名 容量 粒子径 イオン交換容量 たんぱく質吸着量 (ml) (μm) (eq/l) ( リゾチーム, g/l) 482 TSKgel SP-5PW() , , 4282 TSKgel SP-5PW() , , TSKgel SP-PW() ( インスリン ) , , 製品一覧表 ToyoScreen IEC カラム ( プロセス開発用 スクリーニング用 ) 品番 品名 内容 ToyoScreen GigaCap Q-6M GigaCap Q-6M 1 mlタイプ 6 本 2186 GigaCap Q-6M 5 mlタイプ 6 本 ToyoScreen GigaCap DEAE-6M GigaCap DEAE-6M 1 ml タイプ 6 本 2287 GigaCap DEAE-6M 5 ml タイプ 6 本 2162 ToyoScreen SuperQ-6M SuperQ-6M 1 mlタイプ 6 本 216 SuperQ-6M 5 mlタイプ 6 本 216 ToyoScreen DEAE-6M DEAE-6M 1 mlタイプ 6 本 2161 DEAE-6M 5 mlタイプ 6 本 ToyoScreen Q-6C AR Q-6C AR 1 mlタイプ 6 本 2199 Q-6C AR 5 mlタイプ 6 本 2164 ToyoScreen QAE-5C QAE-5C 1 mlタイプ 6 本 21 QAE-5C 5 mlタイプ 6 本 244 ToyoScreen NH2-7F NH2-7F 1 mlタイプ 6 本 2444 NH2-7F 5 mlタイプ 6 本 ToyoScreen GigaCap S-6M GigaCap S-6M 1 mlタイプ 6 本 GigaCap S-6M 5 mlタイプ 6 本 ToyoScreen GigaCap CM-6M GigaCap CM-6M 1 mlタイプ 6 本 GigaCap CM-6M 5 mlタイプ 6 本 2168 ToyoScreen SP-6M SP-6M 1 mlタイプ 6 本 2169 SP-6M 5 mlタイプ 6 本 2166 ToyoScreen CM-6M CM-6M 1 mlタイプ 6 本 2167 CM-6M 5 mlタイプ 6 本 217 ToyoScreen SP-5C SP-5C 1 mlタイプ 6 本 2171 SP-5C 5 mlタイプ 6 本 2187 ToyoScreen MegaCapⅡSP-5EC MegaCapⅡSP-5EC 1 mlタイプ 6 本 MegaCapⅡSP-5EC 5 mlタイプ 6 本 2472 ToyoScreen Sulfate-6F Sulfate-6F 1 mlタイプ 6 本 247 Sulfate-6F 5 mlタイプ 6 本 GigaCap Q-6M GigaCap S-6M 2196 ToyoScreen IEC GigaCap CM-6M SuperQ-6M Q-6C AR SP-5C 1 mlタイプ各 1 本 GigaCap Q-6M GigaCap S-6M 2197 GigaCap CM-6M SuperQ-6M Q-6C AR SP-5C 5 mlタイプ各 1 本 GigaCap Q-6M DEAE-6M 2192 ToyoScreen A-IEC SuperQ-6M Q-6C AR QAE-5C 1 mlタイプ各 1 本 GigaCap Q-6M DEAE-6M 219 SuperQ-6M Q-6C AR QAE-5C 5 mlタイプ各 1 本 GigaCap S-6M GigaCap CM-6M 2194 ToyoScreen C-IEC CM-6M SP-6M SP-5C 1 mlタイプ各 1 本 GigaCap S-6M GigaCap CM-6M 2195 CM-6M SP-6M SP-5C 5 mlタイプ各 1 本 *ToyoScreen をご使用の際には 品番 214 ToyoScreen Holder が必要になります ToyoScreenカラムホルダ コネクタ 品番 品名 内容 214 ToyoScreen Holder 1 ml 5 mlカラム共通 28 T-Fユニオン FPLC 用コネクタ * FPLC は GE ヘルスケア ジャパン社の登録商標です * 価格につきましては TSKgel / TOYOPEARL 総合カタログ をご覧ください * 容量が1, ml 5, mlの製品の価格につきましては 当社営業までお問い合せください 22 2

13 イオン交換クロマトグラフィー (IEC) 製品一覧表 MiniChrom 品番 品名 カラム容量粒子径 (ml) (μm) 451 TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL GigaCap S-6S 5 45 TOYOPEARL GigaCap CM-6M TOYOPEARL GigaCap Q-6M TOYOPEARL GigaCap Q-6S TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M TSKgel SuperQ-5PW () TOYOPEARL NH2-7F TOYOPEARL Sulfate-6F 5 6 疎水クロマトグラフィー (HIC) µm TOYOPEARL SuperButyl-5C TOYOPEARL Hexyl-6C TOYOPEARL Butyl-6C TOYOPEARL Phenyl-6C RoboColumn 品番 品名 容量粒子径 (μl) (μm) 41 TOYOPEARL GigaCap S-6M 8 42 TOYOPEARL GigaCap S-6M TOYOPEARL GigaCap Q-6M 8 44 TOYOPEARL GigaCap Q-6M TOYOPEARL GigaCap CM-6M 8 46 TOYOPEARL GigaCap CM-6M TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M 8 48 TOYOPEARL GigaCap DEAE-6M TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL Q-6C AR TOYOPEARL NH2-7F TOYOPEARL NH2-7F TOYOPEARL Sulfate-6F TOYOPEARL Sulfate-6F µm TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL PPG-6M TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL Ether-6M 5 µm TOYOPEARL Butyl-6S TOYOPEARL Phenyl-6S TOYOPEARL Ether-6S *MiniChrom RoboColumn の他グレード製品につきましては 当社営業までお問い合せください µm TSKgel Phenyl-5PW () TSKgel Ether-5PW () µm TSKgel Phenyl-5PW () TSKgel Ether-5PW () 24

14 疎水クロマトグラフィー (HIC) 疎水クロマトグラフィー用 TOYOPEARL 充塡剤 疎水クロマトグラフィー (HIC) は生体分子を分離精製するための 有効な分離モードです このモードはたんぱく質表面に存在する疎 水性領域と 弱い疎水性を持つ充塡剤固定相との相互作用を利用し 異なる5 種類の疎水性リガンドが示す選択性 HIC 充塡剤にはそれぞれが程度の異なる疎水性と選択性を示す5 種類のリガンドがあります TOYOPEARL HIC 充塡剤では次の順に疎水性が高くなります :Ether<PPG( ポリプロピレングリコー 塩の種類が及ぼす影響 HIC 分離の選択性は リガンドの疎水性に加え 溶離液に用いる塩の種類によっても影響を受けます 異なるたんぱく質の分離能に及ぼす塩の影響を図 4に示します Ether-6M ます HIC はイオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーを補完す る優れた方法で 特にたんぱく質の異性体が存在する場合や粗試料 中の不純物が 類似の等電点や類似の分子量を持つ場合などの分離 に効果を発揮します アフィニティーリガンドと類似の結合サイト を持つたんぱく質を アフィニティークロマトグラフィーにより分 離した後に HIC を用いて疎水性の違いで分離するといった方法も考 ル )<Phenyl<Butyl<Hexyl( 図 2 参照 ) Hydrophilic OCH 2 CH 2 n OH Ether OH O n 二塩混合溶液での動的吸着量疎水クロマトグラフィーにおける吸着溶液において用いられる塩を1 種類から2 種類の異なる性質の塩を混合することにより 疎水ゲルの動的吸着量を改善することが可能です ( 表 ) 疎水クロマトグラフィーの塩として一般的に用いられている硫酸アンモニウム ( 硫 28 nm ma 2 PPG-6M Phenyl-6M Butyl-6M えられます HIC はどのように作用するか? 疎水性表面を持つたんぱく質やその他の分子は HIC 充塡剤の疎水性領域に吸着されます HICにおけるたんぱく質の充塡剤への結合は塩濃度の高い水溶液中で起こります 塩析効果により疎水性リガンドへのたんぱく質が結合します したがって HICでは塩濃度を下げることでたんぱく質の溶出が起こります 目的とするバイオ医薬品は低塩濃度または塩を含まない緩衝液で溶出することになります 逆相クロマトグラフィー (RPC) とHICの溶出法を比較すると HIC 分離の吸着エネルギーの方がRPC 分離のそれよりも低い値を PPG O Phenyl OCH 2 CH 2 CH 2 CH Butyl OCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH Hexyl Hydrophobic 図 2 HICリガンドの構造 たんぱく質の回収率 安 ) のほかにも塩化ナトリウム クエン酸ナトリウム 硫酸ナトリウム グリシンなどを混合することにより 疎水ゲルの動的吸着量を % ないし % 改善できる場合があります *) *)A. M. Senczuk et al., Hydrophobic Interaction Chromatography in Dual Salt System Increases Protein Binding Capacity, Biotechnology and Bioengineering, (9)9 表 1 たんぱく質の回収率 (%) SuperButyl-5C Hexyl-6C 4 min カラム ToyoScreen(1 ml) 溶 液 A.1 mol/l り 酸 液 1.8 mol/l Na 2 SO 4 (ph 7.) 溶 液 B.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) グラエント 溶 液 A B min リニ グラエント 1 ml/min ( 2 8 nm) 1. リ クレ ー A 2. リ ーム.- トリプ ー ンA, 1 g/l 量 5 L 示します この 2つの分離モードの相対的な結合エネルギーを比較するものとして 分離における吸着条件と溶出条件の表面張力を測定する手段があります HICとRPCの溶出における表面張力を比較した例を図 1に示します HICは ( 表面張力の変化が小さく ) 温和な溶離条件で分離を行うため ほとんどの場合 試料の生理活性も保持されます Surace Tenion erg/cm NH 4 2 SO 4 Concentration mol/l eorb protein CH CN Bind protein Bind protein NH 4 2 SO 4 HIC RPC eorb protein Acetonitrile 目的とするバイオ医薬品の疎水性と充塡剤の疎水性とを適合させることが 高い精製効率を得るために非常に重要です たんぱく質に対して疎水性の強すぎる充塡剤を使用するとたんぱく質が不可逆的に充塡剤に結合したり 酵素活性を失う原因になります TOYOPEARL HIC 充塡剤の標準的な質量回収率と生理活性回収率を表 1と表 2に示します HIC 工程を最適化するためには 高い動的吸着量と適切な分離選択性 良好な質量回収率と生理活性回収率のバランスをうまくとることが重要です TOYOPEARL Hexyl-6 及びButyl-6/5は強い吸着力を持つことから 親水性の高いたんぱく質の分離に使用されます この2 種類の充塡剤は 塩濃度の低い条件での分離にも使用することができます TOYOPEARL PPG-6 Butyl-6 Phenyl-6は特に抗体の分離に適し 高い吸着量を示します また中程度の疎水性を示すたんぱく質分離用充塡剤です TOYOPEARL Ether-6 充塡剤は 非常に疎水性の高い抗体や膜たんぱく質のような目的物質を精製するために使用されます スクリーニング用カラムToyoScreen TOYOPEARL HICの全てのグレードで 充塡剤量 1 mlと5 mlのカラムが用意されています 目的物質の吸着 選択性と回収に適した充塡剤をスクリーニングするために簡便にご使用いただけるカラムです 複数のカラムを直列接続することにより更に複雑な分離を行うこ Boine erum albumin * -Chymotrypinogen A * 9 Cytochrome c 81 * 87 * IgG 91 -Lactalbumin 9 Lyoyme Oalbumin Ribonucleae A 72 * 82 * Procedure A ml ample containing mg o protein a loaded onto a 7.5 mm I cm column and eluted ith a 6 minute gradient o 1.8 mol/l( * 1.5 mol/l)to. mol/l ammonium ulate in.1 mol/l odium phophate(ph 7.). The ma recoery a determined pectrophotometrically at 28 nm and 25. 表 2 たんぱく質の酵素活性回収率 TOYOPEARL HIC く () Phenyl-6 Phytochrome 79 Butyl-6 Halophilic proteae 85 Butyl-6 Poly(-hydroxybutyrate)depolymerae 88 Butyl-6 Aculeacin-A acylae 82 Butyl-6 Opine dehydrogenae 81 図 TOYOPEARL HIC 充塡剤のスクリーニング ( 標準たんぱく質の分離 ) Reolution Factor R Cytochrome c/conalbumin Na Citrate Na 2 SO 4 NH 4 2 SO 4 NaCl NH 4 SCN Conalbumin/-Glucoidae カラム TOYOPEARL Butyl mm I.. 4 cm 溶 液 A mmol/l り 酸 液 1 mmol/l の 各 (ph 7.) 溶 液 B mmol/l り 酸 液 (ph 7.) グラ エント 溶 液 A B min リニ グラ エント 1 ml/min ( 2 8 nm). Faunaugh, L. Kennedy and F. Regnier,. Chromatography 17, 図 4 分離能における塩の種類の影響 表 二塩混合溶液でのモノクローナル抗体の動的吸着量の比較 吸着溶液 Na Citrate Na 2 SO 4 NH 4 2 SO 4 NaCl NH 4 SCN 動的吸着量 (IgG 1, g/l) C. Horath et. al., Separation Procee in Biotechnology,. Aeno, Ed. 9, Marcel eer とも可能です ToyoScreenを使用して標準たんぱく質のTOYOPEARL HIC 充 Ether- 6M PPG- 6M Phenyl- 6M Butyl- 6M 図 1 HIC と RPC に用いられる水溶性溶離液の表面張力 塡剤に対する吸着特性と選択性を調べた結果を図 に示します 1 mol/l (NH4)2SO4 (15 ms/cm) mol/l NaCl.4 mol/l クエン酸ナトリウム (118 ms/cm) mol/l Glycine.6 mmol/l Na2SO4( ms/cm) mol/l NaCl.7 mol/l (NH4)2SO4(185 ms/cm) mol/l Glycine.8 mol/l (NH4)2SO4( ms/cm)

15 疎水クロマトグラフィー (HIC) 図 5に示すホフマイスター系列は 各種アニオンとカチオンを疎水的吸着を促進する能力の順に並べたものです 系列の左側に属するイオンはリオトロピック性 (lyotropic) と呼ばれ 系列の右側のイオンはカオトロピック性 (chaotropic) と呼ばれます リオトロピックの塩は 塩濃度が高くなると疎水性相互作用を高める性質があるため たんぱく質を沈殿 塩析させ カオトロピックの塩は 塩濃度が高くなるとたんぱく質の変性を促進させます 図 4 及び表 に示すように塩の種類により充塡剤の吸脱着の性質が変化します For anion 2-2- SO 4 HPO 4 CH COO - halide NO - CIO 4 - SCN - For cation CH 4 N NH 4 K Na C Li Mg 2 Ca 2 Ba 2 酸 ン ニウム 酸ナトリウムが HIC に く使用さ です 図 5 ホフマイスター系列 製 製 製 C の HPLC カラム 製 Feedtoc m 粒子径の最適化 TOYOPEARL HIC 充塡剤は 次に示す各種粒子径が用意されて います : μm TOYOPEARL C キャプチャー ( 初期精製 ) μm TOYOPEARL M 中間精製 5μm TOYOPEARL S 中間精製 / 最終精製 μm TSKgel 5PW 高分離能 / 最終精製 工業スケールでHICを応用するために使用できる各種リガンドと 粒子径をまとめて図 7に示します この図では 各粒子サイズの充 塡剤が クロマトグラフィーの一連の製造工程 ( キャプチャー 中間 精製 最終精製 ) のどの工程で用いられているのかも示しています m 5m m m m nm TOYOPEARL HW (8) TSKgel PW G G4 G G6 の 図 6 HIC 充塡剤に使用される基材の特徴比較 TOYOPEARL SuperButyl-5C TOYOPEARL Hexyl-6C TOYOPEARL Butyl-6C TOYOPEARL Phenyl-6C TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL PPG-6M TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL Ether-6M TOYOPEARL Butyl-6S TOYOPEARL Phenyl-6S TOYOPEARL Ether-6S TSKgel Phenyl-5PW() TSKgel Ether-5PW() TSKgel Phenyl-5PW() TSKgel Ether-5PW() TSKgel Phenyl-5PW TSKgel Ether-5PW 機械的強度 TOYOPEARLとTSKgel 5PWのHIC 充塡剤は 高い流速で使用できます TOYOPEARL Phenyl-6の各粒子径が示す圧損 / 流速の関係を図 8に示します 粒子径の大きなCグレードでは 圧力が低く より高流速で使用可能なことがわかります 化学的安定性これらの製品はいずれも広い範囲のpHとイオン強度に耐える化学構造を有しています 細孔径の最適化多孔質充塡剤の絶対表面積は平均細孔径が小さくなるほど大きくなります 一方 細孔径が小さすぎると 大きなたんぱく質は細孔内に浸透しにくくなり 有効な表面積は減少します このため たんぱく質のサイズに応じて 有効な表面積が最大となる最適細孔径が存在することになります 吸着可能な表面積が増加すると 目的のバイオ医薬品の動的吸着量 (DBC) も大きくなります 上記の観点から より大きな動的吸着量を持つことを目的とした 種の細孔径のHIC 充塡剤が開発されました 高い動的吸着量を持つTOYOPEARL モノクロナール抗体への応用には細孔径約 75 nmの充塡剤が適しています 製品としてはTOYOPEARL PPG-6M Butyl-6MとPhenyl-6Mの タイプが用意されています これらの製品の動的吸着量 (DBC) をTOYOPEARL Phenyl-6 と比較したデータを図 9に示します 図 に HIC 充塡剤 6シリーズの分離選択性の比較を示します Phenyl-6S Preure bar Phenyl-6M 2.5 Phenyl-6C Flo cm/h カラムTOYOPEARL Phenyl-6C, M and S, 25 mm I.. 25 cm 溶 液 2 mol/l(nh 4 ) 2 SO 4 図 8 TOYOPEARL Phenyl-6の流速と圧力損失の関係 C/C PPG-6M Phenyl-6M Butyl-6M 他社 ニ タイプ Phenyl-6M 4 IgG loaded g/l カラム 7.8 mm I.. cm polyclonal human IgG 吸着溶 液 1 g/l IgG in.8 mol/l NH 4 2 SO 4.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) 2.4 ml /m i n( cm/h) 25 (28 nm) BC a calculated at o breathrough. 図 9 各種 HIC 充塡剤におけるポリクローナル抗体のブレークスルーカーブ 28 nm ma 1 PPG-6M Phenyl-6M Butyl-6M Elution olume ml カラム 7.5 mm I cm 1. リ クレ ー A 2. リ ーム. - トリプ ー ン A 量 L(1 g/l) 溶 液 A1.8 mol/l NH 4 2 SO 4.1 mol/l り 酸 液 ( p H 7.) 溶 液 B.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) グラ エント 溶 液 A B 6 min リニ グラ エント 1. ml /m i n(1 6 cm/h) 25 ( 2 8 nm) 図 TOYOPEARL HIC 充塡剤 6 シリーズの分離選択性比較 2 図 7 各種精製プロセスにおける疎水クロマトグラフィー用充塡剤 28 29

16 疎水クロマトグラフィー (HIC) 28 nm ma 1 Phenyl-6M Phenyl-6M ロー タイプ ニ 1 2 C/C Phenyl-6M Phenyl-6M Lyoyme loaded g/l Elution time o each antibody on TSKgel phenyl-5pwmin No.1 No. No.5 No.7 No.9 No.11 No.1 No.15 No.17 No.19 No.21 No.2 No.25 No.27 No.29 No.1 No. No.5 No.7 No.9 No.41 No.4 No.45 No.47 No.49 No.51 Antibody カラム TSKgel Phenyl-5PW, 7.5 mm I cm 溶 液 A.1 mol/l り 酸 液 1.8 mol/l NH 4 2 SO(pH 4 7.) 溶 液 B.1 mo l / L り 酸 液 ( p H 7.) グラエント(B) ( min) (5 min) ( min)linear 1 ml/min (28 nm) ウ クローナ51 A. m TSKgel Ether-5PW 15 B. mtoyopearl Ether-6M mab mab min Elution olume ml Binding capacity g/l Breathrough 図 14 HIC 分離におけるマウスモノクローナル抗体の多様性 ( 溶出時間 ) カラム 7.5 mm I cm 1. リ クレ ー A 2. リ ーム. - トリプ ー ン A 量 L(1 g/l) 溶 液 A 1.8 mol/l NH 4 2 SO 4.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) 溶 液 B.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) グラ エント 溶 液 A B 6 min リニ グラ エント 1. ml /m i n(16 cm/h) 25 (28 nm) 図 11 フェニルタイプの HIC 充塡剤の分離選択性比較 P h e n y l - 6 M 58 P h e n y l M 27 カラム 7.8 mm I.. cm 1 g/l リ ームを.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) 1.8 mol/l NH 4 2 SO ml/min( cm/h) (28 nm) 図 1 TOYOPEARL Phenyl-6Mのブレークスルーカーブ ( リゾチーム ) 図 11にフェニル基を持つ充塡剤 TOYOPEARL Phenyl-6M Phenyl-6M 及びアガロース系充塡剤の分離比較を示します たんぱく質凝集体の除去大きな細孔径を持つTOYOPEARL Butyl-6とPhenyl-6 はたんぱく質凝集体の分離 除去に非常に有効です Kargerら *) は 分子量 万を超えるたんぱく質と凝集体を対象とした研究においてHICが凝集体除去に有効であることを明らかにしました 糖たんぱく質糖たんぱく質は糖を基材とする充塡剤ではしばしば不可逆的結合を起こしますが TOYOPEARL HIC 充塡剤を使用すれば精製が可能です TOYOPEARL Butyl-6S 充塡剤を使用して巨大糖たん 15 カラム A. TSKgel Ether-5PW, 7.5 mm I cm B. TOYOPEARL Ether-6M,7.5 mm I cm ウ A. 1.5 mg in L B..76 mg in L 溶 液 A.1 mol/l り 酸 液 1.5 mol/l NH 4 2 SO 4 (ph 7.) 溶 液 B.1 mol/l り 酸 液 (ph 7.) グラ エント 溶 液 A B 6 min リニ グラ エント 1. ml/min(16 cm/h) (28 nm) min. Butyl-6M Hexyl-6C PPG-6M 図 12にTOYOPEARL SuperButyl-5Cとその他 HIC 充塡剤のDBCの比較を示します リゾチーム ( 分子量 12, Da) のような低分子たんぱく質には TOYOPEARL SuperButyl-5C ぱく質を精製した例を図 16 に示します DNA プラスミドの精製とエンドトキシン除去 図 15 マウス腹水からのモノクローナル抗体の分離 (TOYOPEARL と TSKgel の比較 ) Phenyl-6M ( 細孔径 nm の TOYOPEARL 55 から誘導体化 ) が適して Cambrex, Baltimore, MD は プラスミド DNA の精製に 28 nma.2.1 Ether-6M Lyoyme loaded g/l Binding capacity g/l Breathrough Ether-6M 12.5 Phenyl-6M 27.5 Butyl-6M 2.2 Hexyl-6C.2 PPG-6M 44.2 SuperButyl-5C 54. SuperButyl-5C カラム 7.8 mm I.. cm 1 g/l リ ームを.1 mol/l り 酸 液 1.8 mol/l NH 4 2 SO 4 (ph 7.).8 ml /m i n( cm/h) (28 nm) 図 12 各種 HIC 充塡剤を用いたリゾチーム分離のブレークスルー います TOYOPEARL Phenyl-6Mは 分子量の小さいたんぱく質リゾチームに対しても 高いDBCを示します ( 図 1) 6と 5シリーズのHIC 充塡剤はあるたんぱく質に対し高い動的吸着量を示し 細孔径とリガンドの違いにより製造プロセスの経済性 (Process economics) に劇的な変化をもたらします モノクロナール抗体 HICはモノクロナール抗体 (mab) の精製に有用です 図 14は 51 種類の異なるマウスIgGをTSKgel Phenyl-5PWで測定 ( 溶離時間を疎水性の指標として代用 ) したものです mabは非常に多様な疎水性を示すことが分かります 何種類かのIgGは他のIgGよりも2 倍も溶出が遅く より強い疎水性を持つことが分かります 疎水性の強いmAb( マウスの抗ニワトリ14kDaレクチン抗体など ) に対しては より疎水性の弱い ( 親水性が強い )TOYOPEARL Ether-6Mが適しています 腹水からのmAbの精製 ( 図 15) ではTSKgel Ether-5PW( μm) を使用し スケールアップでは同じ選択性を持つTOYOPEARL Ether-6M( 粒子径 μm) を使用することができます TOYOPEARL Hexyl-6C 充塡剤を使用しました (US patent 6,95,686) Hexyl-6Cはエンドトキシン除去用としても HIC 充塡剤の中で最も高い効果を持つことが示されており その吸着除去量は2 百万 EU/mL 充塡剤です RNAと混入たんぱく質も効果的に除去されました またTOYOPEARL Hexyl-6Cは スーパーコイル状及び開環環状型 (open circular forms) のプラスミドDNAの分離でも有効でした ミスフォールドたんぱく質の除去ミスフォールドたんぱく質は一般に 本来のたんぱく質よりも高い疎水性を示しますので ミスフォールドたんぱく質除去には TOYOPEARL Butyl-6M 充塡剤が利用されます 多くの場合 ミスフォールドたんぱく質を吸着し 目的物質がカラムを通過するような溶離条件 ( フロースルー ) でのクロマトグラフィーを用います 詳細な応用例については 弊社のウェブサイトを参照ください *)Grinberg, N. Blanco, R. Yarmush, D. Karger, B. L. Protein Aggregation in High Performance Liquid Chromatography: Hydrophobic Interaction Chromatography of β-lactoglobin, Anal. Chem. 1989, 61, Aborbance, 28 nm A. B. C Fraction Number 8 ml/raction カラム TOYOPEARL Butyl-6S, 22 mm I.. 26 cm ラ く 溶 液 mmol/l り 酸 液 NH 4 2 SO 4 (ph 7.) A. 4 NH 4 2 SO 4 B. NH 4 2 SO 4 C. NH 4 2 SO 4 グラ エント プ ( に ) (28 nm) 図 16 TOYOPEARL Butyl-6Sを用いた高分子量糖たんぱく質の分離 Antibacterial actiity -Inhibition カーブと動的吸着量 1

17 疎水クロマトグラフィー (HIC) 製品一覧表 製品一覧表 TOYOPEARL HIC 充塡剤 品番 品名 容量粒子径たんぱく質吸着量 ( 参考値 ) (m L ) (μ m ) ( リゾチーム, g/l) TOYOPEARL Ether-6S , , 1617 TOYOPEARL Ether-6M , , 22 TOYOPEARL PPG-6M 4 9 5(γ-globulin) 2 1, 24 5, TOYOPEARL Phenyl-6M , , TOYOPEARL Phenyl-6S , , TOYOPEARL Phenyl-6M , , TOYOPEARL Phenyl-6C , , 7476 TOYOPEARL Butyl-6S , , 7477 TOYOPEARL Butyl-6M , , 7478 TOYOPEARL Butyl-6C , , TOYOPEARL Butyl-6M (γ-globulin) 214 1, , TOYOPEARL SuperButyl-5C , , 1926 TOYOPEARL Hexyl-6C , , TSKgel HIC 充塡剤 品番 品名 容量 粒子径 たんぱく質吸着量 (ml) (μm) ( リゾチーム, g/l) 4276 TSKgel Ether-5PW() , , 4176 TSKgel Ether-5PW() , , 4277 TSKgel Phenyl-5PW() , , 4177 TSKgel Phenyl-5PW() , 172 5, * 価格につきましては TSKgel / TOYOPEARL 総合カタログ をご覧ください * 容量が1, ml 5, mlの製品の価格につきましては 当社営業までお問い合せください 2

18 疎水クロマトグラフィー (HIC) 製品一覧表 ToyoScreen HIC カラム ( プロセス開発 スクリーニング用 ) 品番品名内容 2172 ToyoScreen Ether-6M Ether-6M 1 ml タイプ 6 本 217 Ether-6M 5 ml タイプ 6 本 218 ToyoScreen PPG-6M PPG-6M 1 ml タイプ 6 本 2181 PPG-6M 5 ml タイプ 6 本 2174 ToyoScreen Phenyl-6M Phenyl-6M 1 ml タイプ 6 本 2175 Phenyl-6M 5 ml タイプ 6 本 ToyoScreen Phenyl-6M Phenyl-6M 1 ml タイプ 6 本 2189 Phenyl-6M 5 ml タイプ 6 本 2176 ToyoScreen Butyl-6M Butyl-6M 1 ml タイプ 6 本 2177 Butyl-6M 5 ml タイプ 6 本 ToyoScreen Butyl-6M Butyl-6M 1 ml タイプ 6 本 Butyl-6M 5 ml タイプ 6 本 2182 ToyoScreen SuperButyl-5C SuperButyl-5C 1 ml タイプ 6 本 218 SuperButyl-5C 5 ml タイプ 6 本 2178 ToyoScreen Hexyl-6C Hexyl-6C 1 ml タイプ 6 本 2179 Hexyl-6C 5 ml タイプ 6 本 Phenyl-6M PPG-6M Phenyl-6M 2198 ToyoScreen HIC Hexyl-6C Butyl-6M Butyl-6M 1 mlタイプ各 1 本 Phenyl-6M PPG-6M Phenyl-6M 2199 Hexyl-6C Butyl-6M Butyl-6M 5 ml タイプ各 1 本 *ToyoScreen をご使用の際には 品番 214 ToyoScreen Holder が必要になります ミックスモードクロマトグラフィー (MXC) µm TOYOPEARL MX-Trp-6M ToyoScreenカラムホルダ コネクタ 品番 品名 内容 214 ToyoScreen Holder 1 ml 5 mlカラム共通 28 T-Fユニオン FPLC 用コネクタ MiniChrom 品番 品名 カラム容量 (ml) 粒子径 (μm) TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6S TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL PPG-6M TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL Butyl-6S TOYOPEARL Butyl-6M RoboColumn 品番 品名 容量 (μl) 粒子径 (μm) 41 TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL Butyl-6M TOYOPEARL PPG-6M TOYOPEARL PPG-6M TOYOPEARL Phenyl-6M TOYOPEARL Phenyl-6M *MiniChrom RoboColumnの他グレード製品につきましては 当社営業までお問い合せください 4

19 ミックスモードクロマトグラフィー (MXC) ミックスモードクロマトグラフィー用 TOYOPEARL 充塡剤ミックスモードクロマトグラフィー (MXC) は 異なる複数の相互作用 ( イオン交換 疎水結合 アフィニティー結合など ) を持つ官能基を導入した充塡剤を用いる分離モードです したがって 目的物質の分離において 複合的な相互作用と分離選択性により 一段階で不純物を除去し 高純度精製が可能となります また イオン交換クロマトグラフィーに較べて 試料や溶離液中の塩濃度が高い場合でも 試料が吸着しやすいため ( 塩耐性クロマトグラフィー ) 初期精製や 中間精製において有利になります 一方 複雑な相互作用のため 分離条件の最適化が必要となります 実験計画 (DoE) などにより 溶離液の塩濃度 phなどの検討が MXCの利用におけるポイントとなります TOYOPEARL MX-Trp-6M TOYOPEARL MX-Trp-6Mには アミノ酸であるトリプトファンが固定化されています ( 図 1) トリプトファン分子には インドール環による疎水性相互作用と カルボキシ基による陽イオン交換作用があります また 抗体の吸着量が高く 試料中や 試料溶液中の塩濃度が高い場合でも 分析種を十分吸着できる能力 ( 塩耐性 ) を有しています 表 1に 市販ミックスモード充塡剤との抗体の吸着量の比較を示します イオン交換基と疎水基の両方が 吸着に寄与するため 吸着条件 溶出条件 洗浄条件の検討が重要です 一般的な分離条件を表 2に示します MXC 及びIECにおける塩存在下での動的吸着量の比較 MXCでは 一般のイオン交換体と比べ 試料中に塩が含まれていても 高い吸着量を維持することができます 図 2は.15 mol/l NaClを含む試料中のIgG 吸着量を各 phで比較したものです 高い吸着量を得るため 通常のイオン交換体ではpHを下げる必要がありますが MXCでは中性に近いpHでも高い吸着量が維持されています MXCでの動的吸着量と塩濃度及びpHの影響 MXCにおける動的吸着量は 吸着溶離液における塩濃度とpHの影響が大きく phが低い場合 より高い塩濃度でも 高い吸着量が得られます ( 図 ) 抗体の分離精製 細胞培養液には イオン強度として mol/lのnaclに相当する塩が含まれており この条件で吸着分離できるMXCは モノクローナル抗体の分離精製に適用可能です ( 図 4) また 2 種類の塩を組み合わせた溶離液において 塩とpHの両方のグラジエントを用いることによって 良好な抗体フラグメントの分離が行えます ( 図 5) ma DBC 9 g/l Yeld 96 表 2 TOYOPEARL MX-Trp-6M における一般的な分離条件 1 TOYOPEARL OCH 2 CNH COONaH C CH 2 N H 図 1 TOYOPEARL MX-Trp-6M の構造 疎水 陽イオン交換 イオン交換基と疎水基の両方が 試料の吸着に寄与するため 吸着条件 溶出条件 洗浄条件の検討が重要です 陽イオン交換体に近い分離条件になります 吸着溶離液の ph 及び塩濃度で 吸着量が大きく変動します 吸着条件緩衝液 :ph 塩濃度 :.1 mol/l NaCl 以下が望ましい試料に塩 (.15 mol/l 以下 ) が含まれていても吸着にはあまり問題はありません * 不純物が多い場合には 吸着条件で洗浄の後 塩濃度が.1 mo l / L 以下の緩衝液 ( p H 5. 7.) で洗浄することも効果的です 溶出条件緩衝液 :ph 前後塩濃度 :.15 mol/l NaCl 以上洗浄条件塩濃度 :.5 1. mol/l NaCl アルカリ溶液 :.1.5 mol/l NaOH IgG DBC g/l TOYOPEARL MX-Trp-6M TOYOPEARL GgaCap CM-6M TOYOPEARL GgaCap S-6M クス ー 剤 ph 図 2 ミックスモード充塡剤及び陽イオン交換体におけるIgGの動的吸着量の比較 (.15 mol/l NaCl 存在下 各種 ph) mn カラム : TOYOPEARL MX-Trp-6M(6 mm I.D. 4 cm) 吸着溶離液 : mmol/l 酢酸塩緩衝液 (ph 4.7).1 mol/l NaCl 溶出溶離液 :.1 mo l / L リス塩酸塩緩衝液 ( p H 8. 5 ). mol/l NaCl 流速 ( 吸着 ):1. ml /m n( 212 cm/h) 流速 ( 溶出 ):2. ml / m n 12 4 分検出 :U V( 2 8 nm) 試料 : CHO 液 (クロー ル 体 ) 試料は 体濃度が1g/Lとなるに 吸着溶離液で 図 4 細胞培養液からのモノクローナル抗体の精製 1 表 1 抗体の吸着量の比較 粒子径 (μm) イオン交換容量 (μl) 吸着溶離液 (ph 4.7) 中の NaCl 濃度. mol/l(12 ms/cm).15 mol/l(17 ms/cm) 動的吸着量 (IgG) 回収率 動的吸着量 (IgG) TOYOPEARL MX-Trp-6M g/l 97 % 48 g/l 96 % 市販ミックスモード充塡剤平均 g/l 86 % 11 g/l 85 % 吸着溶離液 :.5 mol/l 酢酸塩緩衝液 (ph 4.7).1 mol/l or.15 mol/l NaCl 流速 :212 cm/h DBC: % ブレークスルーカーブ 回収率 Hman IgG DBC g/l mol/l NaCl. mol/l NaCl.15 mol/l NaCl. mol/l NaCl Loadng er ph カラム : 6 mm I.D. 4 cm 吸着溶離液 :.5 mol/l 酢酸塩緩衝液 (ph 4. 6.).2 mol/l NaCl 溶出溶離液 :.1 mol/l リス塩酸塩緩衝液 (ph 8. 5). mol/l NaCl 流速 : 1. ml /m n( 212 cm/h) 検出 : U V( 2 8 nm) 試料 : リクロー ル I g G(1 g/l) 動的吸着量は ブレークスルーカーブ ( さ ) り 出した ph UV mau 6 4 Fc F(a)2 ma 1 2 mn 1 カラム : 6.6 mm I.D. 2 cm 吸着溶離液 :.1 mol/l 酢酸塩緩衝液.2 mol/l NaCl(pH 4.) 溶出溶離液 :.1 mol/l 酢酸塩緩衝液.4 mol/l NaCl(pH 5.6) リニアグラ ン (8 分 ) 流速 :.86 ml/mn(1 cm/h) 検出 : UV(28 nm) 試料 : クロー ル 体 ( 体含 ), 1 g/l 図 5 TOYOPEARL MX-Trp-6M による抗体フラグメントの分離 CIP % B condcyms/cm 図 動的吸着量における吸着緩衝液の ph 及び塩濃度の影響 6 7

20 ミックスモードクロマトグラフィー (MXC) 製品一覧表 TOYOPEARL MXC 充塡剤 品番 品名 容量 粒子径 たんぱく質吸着量 (ml) (μm) (γ-globulin, g/l) TOYOPEARL MX-Trp-6M , 228 5, * 価格につきましては TSKgel / TOYOPEARL 総合カタログ をご覧ください * 容量が1, ml 5, mlの製品の価格につきましては 当社営業までお問い合せください 使用時に 酸化剤の使用や 強い直射日光 UV 光への暴露は避けてください 遮光保存してください アフィニティークロマトグラフィー (AFC) 粒子径 AC 充塡剤 45 µm TOYOPEARL AF-rProtein A-6F TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F TOYOPEARL AF-rProtein L-6F ToyoScreen カラム ( プロセス開発 スクリーニング用 ) 品番 品名 規格 内容 ToyoScreen MX-Trp-6M 1 ml 6 本 MX-Trp-6M 1 ml タイプ6 本 ToyoScreen MX-Trp-6M 5 ml 6 本 MX-Trp-6M 5 ml タイプ6 本 *ToyoScreenをご使用の際には 品番 214 ToyoScreen Holderが必要になります AC 充塡剤 µm TOYOPEARL AF-Chelate-6M TOYOPEARL AF-Red-6ML TOYOPEARL AF-Heparin HC-6M ToyoScreen カラムホルダ コネクタ 品番 品名 内容 214 ToyoScreen Holder 1 ml, 5 mlカラム共通 28 T-Fユニオン FPLC 用コネクタ AC 充塡剤 µm TOYOPEARL AF-Tresyl-6M TOYOPEARL AF-Epoxy-6M MiniChrom 品番 品名 カラム容量粒子径 (ml) (μm) TOYOPEARL MX-Trp-6M 5 RoboColumn 品番 品名 容量粒子径 (μl) (μm) AC 充塡剤 ( 剤 ) µm TOYOPEARL AF-Formyl-6M TOYOPEARL AF-Amino-6M TOYOPEARL AF-Carboxy-6M 451 TOYOPEARL MX-Trp-6M

21 アフィニティークロマトグラフィー (AFC) プロテイン A アフィニティークロマトグラフィー モノクローナル抗体はバイオ医薬品や診断検査試薬として需要が高く 大量精製 高純度精製が必須となっています そのためダウンストリームでのクロマトグラフィーによる精製が ますます重要になっています 表 1に各種クロマトグラフィー分離モードの特長を 図 1に 抗体精製のクロマトグラフィープロセス例を示します 現在では プロテインA 充塡剤は 抗体の精製純度が非常に高く 初期精製に最もよく使用されています 初期工程にプロテインA 充塡剤を用いるプロセスでは 以降のプロセスで 不純物 ( ホストセルたんぱく質 核酸 抗体凝集体 プロテインAリガンドなど ) を除去していく方法です 陰イオン交換体 ( 陰イオン交換膜クロマトグラフィーも含む ) は フロースルーモードで 不純物の除去分離を行います 耐アルカリ 高吸着型及び高速型プロテインA 充塡剤初期工程では 大量の培養上清を迅速に精製することが要求されるため 高吸着量で 高速処理が可能なプロテインA 充塡剤が適しています TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6Fは 高濃度の抗体試料液に対しても非常に高い吸着量を示します また 短い滞留時間でも高い吸着量が維持されます TOYOPEARL AF-rProtein A-6Fは 機械的強度に優れており カラム高さを cmないし cmにすることで 高流速条件 ( 線速を cm/ hないし 1, cm/h) でも 比較的高い吸着量を維持でき 抗体精製における生産効率を向上させることが可能です TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F 及びAF-rProtein A-6F は アルカリ耐久性のあるプロテインAを親水性ビニルポリマー基材に多点で結合しており 一般的に吸着が弱かったマウスIgG 1 や IgM Fabなどに対しても強い親和性を示します またアルカリ洗浄による繰り返しCIPでも 吸着量の減少が抑えられています プロテイン A プロテイン A プロテイン A プロテイン A 中 陽イオン交換体 イオン交換体 ミックスモード充塡剤 * アパタイトゲルを 疎水充塡剤 図 1 プロテイン A 充塡剤を用いる抗体精製プロセス例 吸着 プロテイン 充塡剤 DC or IgG (g/l-gel) イオン交換体 陽イオン交換体 イオン交換体 イオン交換体 TOYOPEARL AF-rProtein A-6F A 社アガロース 吸着 アルカリ プロテイン A 充塡剤 7 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F min Residence Time カラムTOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F TOYOPEARL AF-rProtein A-6F A 社アガロース 吸着 アルカリ プロテイン A 充塡剤カラムサイズ5 mm I.D. 5 cm 溶 液.2 mol/l り 液.15 mol/l acl(ph 7.) トポリクロー ル IgG(1 g/l) プロテイン A 充塡剤の通液特性 Pressre(MPa) cm ID 2.1 cm ID 9. cm ID. cm ID. 4 Flo Rate(cm/h) 6 7 図 4 高吸着型 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F の通液特性 Pressre MPa TOYOPEARL AF-Protein A-6F.1 45 m in ater L8.4 cm 4 6 Flo cm/h カラム 5. mm I.D. 5 cm or TP AF-rProtein A-6F A 社アガロース プロテイン A 充塡剤 1 ml 流速 1. ml/min 溶 液 A mmol/l トリス 液 (ph 8.5) 溶 液 25 mmol/l クン 液 (ph 2.8) to リニアグラジ ント mose IgM in mmol/l Tris-HCl(pH 8.5)ca. 8g/L μl AF-rProtein A-6F 4 - A 社アガロースプロテインA 充塡剤 min 出 (28 nm) 図 7 IgM の分離例 表 1 各種クロマトグラフィー分離モードの特長 抗体吸着量 抗体精製純度 充塡剤の洗浄 充塡剤のコスト で 6 g/l の い 吸着量が れます 図 2 滞留時間と動的吸着量の関係 カラムサイズ 4 cm I.D. 8.4 cm(. 6 L) カラム圧力は 線速 5 cm / h でも.1 MPa 図 5 高速型 TOYOPEARL AF-rProtein A-6F の通液特性 プロテイン A 充塡剤 8 陽イオン交換体 疎水充塡剤 ミックスモード充塡剤 ; 特に優れている ; 優れている ; 改善が望まれる DC or IgG g/l-gel g/l 5 g/l g/l ma(28 nm) 1 溶出溶 液 CIP(.1 mol/l aoh) 2. 5 min Residence time Resin rprotein A HC-6F Colmn sie 5 mm I.D. 5 cm(resin olme 1 ml) 図 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6FにおけるIgG 濃度と動的吸着量 1 2 min カラム TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F (5 mm I.D. 5 cm) 吸着溶 液.2 mol/l り 液.15 mol/l acl(ph 7.) 溶出溶 液.1 mol/l クン 液 ( p H.) 流速.2 ml/min 出 (28 nm) 液 4 ml( ト I g G11 g/l) * 精製 は TSKgel GSWL による純度 ックにより 純度 95 と されまし 図 6 モノクローナル抗体 (IgG1) の精製例 4 41

22 アフィニティークロマトグラフィー (AFC) プロテイン A 充塡剤のアルカリ耐久性 耐アルカリ型プロテインA 充塡剤は.1mol/L NaOHによるCIP では サイクルまで 吸着量の減少は % 程度です ( 図 8) また その際のプロテインA 充塡剤の精製能力として CIPサイクル後でも ホストたんぱく質の除去効率は 低下しません ( 図 9) Capacity CIP cycles カラムTOYOPEARL AF-rProtein A HC-6F (5. mm I.D. 5 cm) CIPサイクル C 吸着溶 液, 5 C 溶出溶 液, 7C 吸着溶 液 C.1 aoh (15), 5 C 吸着溶 液 DCはCIPに ブレークスルーにより 定 図 8 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6Fのアルカリ耐久性 (CIP) CHOP content(compared to start ale) mber o CIP cycles CIP は.2 mol/l aoh(15) で し CIP サイクルでもゲルは 定 図 9 CIP におけるホストセルたんぱく質の除去効率 プロテインA 充塡剤からのリガンド漏出量 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-6Fは プロテインAリガンドが基材に化学的に多点結合されているため リガンドが充塡剤から漏出する量が非常に少なくなっています ( 図 ) ProteinA leachingng/ml mber o CIP cycles 図 CIP におけるプロテイン A リガンドの漏出量 プロテイン A 充塡剤の温度安定性 溶媒安定性 プロテインA 充塡剤のリガンドは 遺伝子組み換えによるプロテインAで 化学的 物理的に安定な構造を持ち 高温や 高濃度の有機溶媒 変性剤などの処理においても 吸着量の変化が少なくなっています ( 図 11 図 12) Static binding capacity g/l-gel 6 4 Re Atoclae Temperatre degreec 加温 溶 イオン交換水オートクレーブ 12 度 1. 2 圧 15 図 11 温度安定性 Static binding capacity(g/l-gel) Re EtOH 4 EtOH 6 EtOH 8 EtOH EtOH Concentration o ethanol プロテイン L アフィニティークロマトグラフィー Fab scfv Diabodyといったフラグメント抗体は 一般的に製造コストが安いメリットがあり また組織への浸透性等 優れた特性を有することから次世代の抗体医薬品として開発が進められています 通常の抗体 ( フルボディ ) 精製のアフィニティー精製には 抗体のFc 領域に親和性を有するプロテインA 充塡剤が広く使用されていますが フラグメント抗体はFc 領域を有さないため 適用できません これまでに数種類のフラグメント抗体医薬品が承認されていますが 精製にはイオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィーといった従来型の分離モードが使用されています TOYOPEARL AF-rProtein L-6Fは κ 軽鎖に親和性のある遺伝子組み換えプロテインLを固定化したフラグメント抗体精製用アフィニティークロマトグラフィー用充塡剤です 新規に開発した遺伝子組み換えプロテインLは 既存市販品に比較して 吸着量 耐アルカリ性が大幅に向上しています また他のTOYOPEARLグレードと同様に機械的強度にも優れ 大型プロセスでも実用的に使用可能です プロテインL 充塡剤の吸着量 TOYOPEARL AF-rProtein L-6Fは 新規リガンドの使用に加えて基材の特性を最適に設計することにより 他社品 ( アガロースベース ) に比較して 高いFab 動的吸着量を示します ( 表 2) プロテインL 充塡剤の耐アルカリ性 TOYOPEARL AF-rProtein L-6Fは 既存他社品 ( アガロースベース ) に比較して 優れた耐アルカリ性を示します 例として.1 mol/l NaOH 水溶液に浸漬した場合 初期から 9% 以上の吸着量が維持できる時間は 2 倍以上長くなっています ( 図 1) プロテインL 充塡剤の親和性プロテインL 充塡剤ではIgAやIgMにも親和性があります プロテインA 充塡剤で吸着しない抗体の精製においての補完的な役割も果たします 表 2 Fab 動的吸着量の比較 TOYOPEARL AF-rProtein L-6F 社品 Fab 吸着量 (g/l) カラムサイズ 4.6 mm I.D. 5 cm 吸着液.1 mol/l りトリ ム 液 (ph 7.5) 2 g/l Fab( ポリクロー ルト免疫グロブリン G) 吸着量は ブレークスルーより 出 inding capacity() AF-rProtein L-6F(lot.A) AF-rProtein L-6F(lot.) 社品 Exposre time(hor) 図 1 耐アルカリ性 表 種 抗体クラスによる親和性の確認 28 nm (m) ト ス ラット クラス IgG1 IgG2 IgG IgG4 IgG1 IgG2a IgG2b IgA IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG2c IgA IgM 性 の抗体により 性が なることが ります Fab raction 4 6 Time(min.) カラムサイズ 5 mm I.D. 5 cm 吸着液 mmol/l クントリ ム 液 (ph 6.5) 溶出液 mmol/l クントリ ム 液 (ph 2.5) 流 速.25 ml/min 出 (28 nm) 量 1.2 ml トモ クロー ル抗体のパパイン 図 12 エタノール溶媒安定性 図 14 ヒト化モノクローナル抗体パパイン消化物からの Fab 精製 42 4

23 アフィニティークロマトグラフィー (AFC) アフィニティークロマトグラフィー用 TOYOPEARL 充塡剤 TOYOPEARLアフィニティークロマトグラフィー (AFC) 充塡剤には活性化型充塡剤や 群特異的リガンドを導入した充塡剤が用意されています 活性化型充塡剤はたんぱく質その他のリガンドを直接結合させることが可能です 固定化反応についてはカルボジイミドカップリングまたは還元アミノ化処理を施して共有結合を形成させるタイプもあります TOYOPEARLの活性化型充塡剤の構造を図 16に TOYOPEARLの群特異的リガンドを図 17に示します リガンド固定化のための活性化型充塡剤の選択たんぱく質のカップリング用としてTOYOPEARL AF-Tresyl- 6MまたはTOYOPEARL AF-Formyl-6Mを推奨しますが 分子量の小さいリガンドのカップリング用としてはTOYOPEARL AF-Epoxy-6Mが適しています TOYOPEARL AF-Amino- 6M 及びTOYOPEARL AF-Carboxy-6Mはどちらの目的にも使用できます TOYOPEARLアフィニティー充塡剤の固相合成への応用各種の有機溶媒及び過酷なpH 値に対して優れた安定性を示す TOYOPEARL AFC 充塡剤は ペプチドやオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルケミストリーや固相合成用としても使用することができます 性 TOYOPEARL TOYOPEARL AF-Tresyl-6M O-R-O-SO 2 -CH 2 -CF Ligand Density 8μmol/g dry TOYOPEARL AF-Epoxy-6M O-R-O-CH 2 -CH-CH 2 O Ligand Density 8μmol/g dry TOYOPEARL AF-Formyl-6M O-R-O-CH 2 -CHO Ligand Density 6 mmol/l TOYOPEARL AF-Amino-6M O-R-O-CH 2 -CH-CH 2 -H 2 OH Ligand Density meq/l TOYOPEARL AF-Carboxy-6M O-R-O-CH 2 COOH Ligand Density meq/l R hydrophilic polymer 図 16 活性化型 AFC 充塡剤の構造 TOYOPEARLアフィニティー充塡剤の共通の特性 膨潤収縮が少なく 優れた圧損 / 流通特性を備えた親水性充塡剤 巨大たんぱく質にも対応できる大きい細孔径 ( nm) ラボと生産スケール両方のAFC 分離に適したMグレード (4 9μm) 表 タイプ別 AFC 充塡剤 AF-Tresyl AF-Amino AF-Red AF-Epoxy AF-Carboxy AF-Chelate AF-Formyl AF-Heparin HC TOYOPEARL AF-Red-6ML ao S ao S ao S TOYOPEARL AF-Chelate-6M TOYOPEARL AF-Heparin HC-6M OH H O-R-O H R hydrophilic polymer COOa O OH 図 17 群特異的 AFC 充塡剤の構造 H CH 2 COO a O-R-O CH 2 - CH 2 COO a Ligand Density mmol/l O OSO a HOSO a n Approximate Ligand Density 5 g/l HO H OH SO a CH 2 OSO a O OH O SO a SO a 活性化型充塡剤 - リガンドを直接固定化 TOYOPEARL AF-Tresyl-6M はアミノ基及びチオール基に 対して強い反応性を示す活性化型充塡剤です この充塡剤は乾燥状態で提供され たんぱく質その他のリガンドを含む緩衝液で反応します 固定化反応は中性から弱アルカリ性 (ph7 8) の溶液で行います ( 図 18) このような条件下では不安定なたんぱく質でも固定化させることができます この固定化反応によって非常に安定性の高い二級アミンまたはチオエーテル結合が作られます トレシル (tresyl-) 基密度は至適化 ( 膨潤ウェット状態で約 mmol/l) してあり 多点結合によるたんぱく質リガンドの不活化を防ぎながら 固定化が可能です 代表的データを表 4にまとめてあります 粒子径 μmのtskgel Tresyl-5PWにつきましては TSKgel / TOYOPEARL 総合カタログ をご覧ください TOYOPEARL AF-Epoxy-6Mは高密度のエポキシ基 ( 約 8μmol/g) を持つ活性型充塡剤であり 乾燥状態で提供されます 低分子量リガンドを高密度で固定化する場合に特に効果を発揮します ( 図 19) たとえば 膨潤状態の充塡剤にグルタチオンとグリシンは mmol/lを超える密度で固定化されます 活性化型充塡剤 - リガンド固定化に添加剤を利用 TOYOPEARL AF-Formyl-6Mを使用すれば 温和な条件下で第一級アミンを有するリガンドを固定化することができます リガンドは充塡剤のホルミル基 ( アルデヒド基 ) と安定な二級アミン結合により充塡剤に結合します ( 図 ) 代表的な固定化例を表 4に示します 多種多様な工業用酵素がアルデヒド基を含む担体を用いて固定化されています TOYOPEARL AF-Formyl-6Mは 機械的強度に優れた多孔性充塡剤に そのまま使用可能なアルデヒド基を持つ担体です 表 4 活性化型 AFC 充塡剤を用いたたんぱく質の固定化 -O-R-O-CH 2 CH 2 OSO 2 CH 2 CF H 2 - Ligand TOYOPEARL AF-Tresyl-6M -O-R-O-CH 2 CH 2 -H-Ligand CF CH 2 SO H Stable secondary amine linage -O-R-O-CH 2 CH 2 OSO 2 CH 2 CF HS-Ligand TOYOPEARL AF-Tresyl-6M ph O-R-O-CH 2 CH 2- S-Ligand CF CH 2 SO H Stable slide linage R hydrophilic polymer ph 図 18 活性化型 AFC 充塡剤を用いた固定化方法 -O-R-O-CH 2 -CH-CH 2 H 2 -Ligand TOYOPEARL AF-Epoxy R hydrophilic polymer O ph O-R-O-CH 2 -CHOH-CH 2 -H-Ligand Stable secondary amine linage O -O-R-O-CH 2 -CH-CH 2 HS-Ligand TOYOPEARL AF-Epoxy ph O-R-O-CH 2 -CHOH-CH 2 -S-Ligand Stable slide linage 図 19 活性化型 AFC 充塡剤を用いた固定化方法 く 定 量 (g/l) Soybean trypsin inhibitor Protein A 1.9 Concanaalin A 1 1-Antitrypsin 12. -Chymotrypsin 12.5 Myoglobin 12.4 Oalbmin oine serm albmin Hman IgG Cytochrome C Lysoyme Copling agent not reqired ach ach or Carbodiimide Carbodiimide Optimal ph