ホシガレイの全雌種苗生産技術の開発に関する研究

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1 NAOSITE: Nagasaki University's Ac Title ホシガレイの 全 雌 種 苗 生 産 技 術 の 開 発 に 関 する 研 究 Author(s) 築 山, 陽 介 Citation Nagasaki University ( 長 崎 大 学 ), 博 士 ( 水 産 学 ) Issue Date URL Right This document is downloaded

2 ホシガレイの 全 雌 種 苗 生 産 技 術 の 開 発 に 関 する 研 究 Development of the Technique for All-Female Seedling Production in the Spotted Halibut Verasper variegatus 2012 年 12 月 長 崎 大 学 大 学 院 生 産 科 学 研 究 科 築 山 陽 介

3 目 次 第 1 章 緒 言 1 第 2 章 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 7 材 料 および 方 法 8 結 果 10 考 察 17 第 3 章 人 為 的 な 性 制 御 20 第 1 節 ホシガレイの 性 分 化 20 材 料 および 方 法 20 結 果 21 考 察 24 第 2 節 高 水 温 飼 育 による 性 転 換 25 材 料 および 方 法 25 結 果 30 第 3 節 メチルテストステロン 投 与 による 性 転 換 43 材 料 および 方 法 44 結 果 48 考 察 58 第 4 節 総 合 考 察 63 謝 辞 67 文 献 68

4 第 1 章 緒 言 ホシガレイ Verasper variegatus は,カレイ 科 マツカワ 属 に 分 類 され, 本 州 中 部 以 南, 朝 鮮 半 島 西 岸, 渤 海, 黄 海 に 分 布 している( 山 田 1986)( Fig. 1) 本 種 は 長 崎 県 内 では 橘 湾 及 び 有 明 海 において 底 曳 網, 刺 網 により 12 月 ~5 月 に かけて 主 に 漁 獲 され( 森 川 ら 2000), 市 場 では 3,000~5,000 円 /kg で 取 引 され る 高 級 魚 である 本 種 は 岩 手 県, 宮 城 県, 福 島 県, 大 阪 府 および 長 崎 県 において 種 苗 生 産 また は 種 苗 放 流 が 行 われている( 水 産 庁 独 立 行 政 法 人 水 産 総 合 研 究 センター ( 社 ) 全 国 豊 かな 海 づくり 推 進 協 会 2012) ただし, 東 北 地 方 での 種 苗 生 産 は 2011 年 の 東 日 本 大 震 災 の 影 響 を 受 け, 現 在 は 休 止 している 長 崎 県 では 魚 介 類 種 苗 量 産 技 術 開 発 研 究 事 業 ( 平 成 9-13 年 度 )および 第 2 期 魚 介 類 種 苗 量 産 技 術 開 発 研 究 事 業 ( 平 成 年 度 )により 総 合 水 産 試 験 場 で 本 種 の 種 苗 生 産 技 術 開 発 に 取 り 組 み,10 万 尾 単 位 での 種 苗 生 産 技 術 を 確 立 させ, 長 崎 県 漁 業 公 社 へ 技 術 移 管 している また, 生 産 した 種 苗 を 用 いて, 魚 類 養 殖 多 様 化 推 進 事 業 により 養 殖 試 験 を 実 施 し, 平 成 22 年 度 には 養 殖 マニュアルを 作 成 している ホシガレイの 養 殖 は, 長 崎 県 の 陸 上 養 殖 施 設 においてヒラメ Paralichthys olivaceus に 代 わる 魚 種 として 普 及 を 行 っているが,ヒラメよりも 成 長 が 遅 いた め( 木 本 佐 藤 2003),それを 補 う 方 法 が 必 要 になる ホシガレイは,ヒラメ やマツカワ Verasper moseri などの 他 の 異 体 類 と 同 様 に 雌 が 雄 よりも 成 長 が 良 く, 雌 は 満 3 歳 で 体 重 1 kg に 達 するが, 雄 は 0.5 kg 未 満 であること( 佐 久 間 2001)から, 雌 種 苗 のみを 飼 育 することが 有 利 とされている( 八 木 2002) 通 常, 本 種 の 性 比 は1:1であるが, 成 熟 するまで 外 見 による 雌 雄 の 判 別 は 困 1

5 難 で, 成 長 の 雌 雄 差 も 孵 化 後 1 年 半 までは 顕 著 でないため( 佐 久 間 2001), 養 殖 現 場 において 雌 雄 選 別 を 行 うことは 難 しい ホシガレイ 養 殖 では 雌 のみを 飼 育 することが 効 率 的 であるが, 前 述 の 理 由 から 早 期 の 雌 雄 選 別 が 行 えないため, 種 苗 の 全 雌 化 が 効 率 の 良 い 養 殖 を 実 現 するための 方 策 と 考 える 全 雌 種 苗 を 得 るためには,1) 雌 性 ホルモンの 投 与,2) 染 色 体 操 作 による 雌 性 発 生,3) 遺 伝 的 雌 を 雄 へ 性 転 換 させた 偽 雄 の 精 子 を 用 いた 人 工 授 精 等 の 方 法 がある(Fig. 2) 雌 性 ホルモン 投 与 による 雌 化 は, 仔 稚 魚 へのエストラジオー ル-17β( 以 下,E2)の 浸 漬 または 経 口 投 与 によって 行 われ, 異 体 類 ではヒラメ ( 田 中 1988; 山 本 ら 1987)およびマツカワ( 森 ら 1995)で 実 施 されている 浸 漬 法 では,ヒラメの 性 的 未 分 化 期 (11~70 日 齢 )に E2 10 μg/l で 処 理 するこ とにより, 雌 比 率 が 対 照 区 の 35.7%に 対 して 48%となったが, 全 雌 化 には 至 っ ていない 一 方, 経 口 投 与 法 による 雌 化 はヒラメとマツカワで 実 施 されており, ヒラメでは 56~90 日 齢,マツカワでは 73~103 日 齢 にかけて E2 1 μg/g diet を 毎 日 投 与 することにより, 全 雌 種 苗 が 得 られている( 田 中 1988; 森 ら 1995) 染 色 体 操 作 による 雌 性 発 生 はホシガレイを 対 象 として 行 われており, 第 二 極 体 放 出 阻 止 型 の 雌 性 発 生 の 条 件 について 検 討 したところ, 八 木 ら(2004)は 授 精 3~5 分 後 に-1.5~-1 で 60 分 間 処 理 することにより,Ji et al.(2010)は 授 精 5 分 後 に-1 で 40~75 分 間 処 理 することにより 雌 化 を 誘 導 している 遺 伝 的 雌 を 雄 へ 性 転 換 させた 偽 雄 の 精 子 を 用 いた 人 工 授 精 による 全 雌 化 では, まず 合 成 雄 性 ホルモンのメチルテストステロン( 以 下,MT)を 性 分 化 期 の 個 体 に 投 与 し, 遺 伝 的 雌 を 雄 に 性 転 換 させなければならない ホシガレイの 遺 伝 的 性 決 定 様 式 はヒラメと 同 様 に XX/XY 型 であり(Ji et al. 2010), 性 転 換 した 遺 伝 的 雌 の 精 子 は X 染 色 体 のみを 持 つことから,これを 卵 子 と 受 精 させれば 全 て XX 遺 伝 子 を 持 つ 雌 となる この 方 法 による 全 雌 生 産 は,ヒラメにおいて 実 用 化 2

6 されている( 山 本 1992) しかし,Ma et al.(2010)はホシガレイの 性 決 定 様 式 が ZZ/ZW 型 である 可 能 性 を 論 じており,この 性 決 定 様 式 が 正 しいとすると, 雌 は ZW 遺 伝 子 を 持 つことから, 全 雌 作 出 には WW 型 の 遺 伝 子 を 持 つ 偽 雄 を 作 出 しなければならない 全 雌 作 出 にいたる 作 業 過 程 に 多 少 の 違 いはあるものの, MT 処 理 による 偽 雄 の 作 出 は, 全 雌 作 出 に 有 効 な 方 法 である 本 研 究 では,ホシ ガレイの 性 決 定 様 式 は XX/XY 型 の 性 決 定 様 式 として 議 論 する 雌 性 ホルモンを 投 与 する 方 法 は 大 量 の 種 苗 を 少 ない 労 力 で 性 転 換 させることが 可 能 であるが, 食 品 安 全 上, 養 殖 魚 には 適 さない 染 色 体 操 作 による 雌 性 発 生 魚 の 作 出 では, 孵 化 率 が 通 常 発 生 魚 と 比 較 してかなり 低 く, 大 量 の 種 苗 生 産 には 解 決 しなけれ ばならない 課 題 が 多 い これに 対 して 偽 雄 の 精 子 を 用 いた 種 苗 生 産 は, 食 品 と して 安 全 な 大 量 の 雌 種 苗 が 得 られることから, 実 用 性 の 高 い 技 術 として 注 目 さ れている 本 研 究 では,このような 背 景 のもと,ホシガレイの 全 雌 種 苗 を 生 産 するため に,まず 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 に 関 する 実 験 を 行 った この 実 験 では 低 温 処 理 による 第 二 極 体 放 出 阻 止 型 の 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 条 件 である 低 温 処 理 の 開 始 時 間, 処 理 水 温 および 継 続 時 間 について 検 討 した( 第 2 章 ) 続 いて, 魚 類 の 遺 伝 的 な 性 を 人 為 的 に 操 作 するためには, 性 的 未 分 化 期 に 性 操 作 を 継 続 して 行 う 必 要 があることから(Nakamura and Takahashi 1973), 性 分 化 の 過 程 を 明 ら かにする 試 験 を 行 った( 第 3 章 第 1 節 ) また, 偽 雄 を 作 出 するために 必 要 な, 遺 伝 的 雌 を 雄 化 する 技 術 の 開 発 に 向 け,ヒラメおよびマツカワが 水 温 等 の 環 境 要 因 により 性 転 換 すること( 山 本 1995;Goto et al. 1999)から,ホシガレイに ついても 性 転 換 する 可 能 性 が 高 いと 考 えられたため,ホシガレイ 仔 稚 魚 の 飼 育 水 を 加 温 または 冷 却 し, 性 分 化 に 及 ぼす 影 響 について 試 験 を 行 った( 第 3 章 第 2 節 ) 最 後 に,MT の 経 口 投 与 試 験 を 行 い,ホルモンの 添 加 濃 度 および 投 与 期 間 3

7 による 性 分 化 および 生 残 に 及 ぼす 影 響 について 調 べた( 第 3 章 第 3 節 ) これら の 成 果 をもとに,ホシガレイの 全 雌 化 技 術 の 最 適 化 について 考 えるとともに, 長 崎 県 におけるホシガレイの 種 苗 生 産 戦 略 についても 議 論 する 4

8 Female Male Fig. 1. Spotted halibut Verasper variegatus. Bars = 50 mm. 5

9 Fig. 2. Possible techniques for all-female seedling production in the spotted halibut Verasper variegatus. 6

10 第 2 章 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 ホシガレイの 全 雌 種 苗 生 産 に 有 効 な 方 法 には, 緒 言 で 述 べたように 1) 雌 性 ホ ルモンの 投 与 による 雌 の 作 出,2) 染 色 体 操 作 による 雌 性 発 生,3) 遺 伝 的 雌 を 雄 へ 性 転 換 させた 偽 雄 の 精 子 を 用 いた 人 工 授 精 による 雌 の 作 出 の 3 つの 方 法 があ る しかし, 食 品 としての 安 全 面 から 実 用 可 能 な 方 法 は, 後 者 の 2 つの 方 法, すなわち 染 色 体 操 作 による 雌 性 発 生 および 遺 伝 的 雌 を 雄 へ 性 転 換 させた 偽 雄 の 精 子 を 用 いた 人 工 授 精 による 雌 魚 の 生 産 である そこで 本 研 究 では,まず 染 色 体 操 作 によるホシガレイの 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 を 試 みた 作 出 した 雌 性 発 生 二 倍 体 をそのまま 種 苗 生 産 に 用 いることができれば, 大 量 の 全 雌 を 比 較 的 簡 単 に 生 産 することができる しかし, 雌 性 発 生 処 理 により 孵 化 率 が 通 常 魚 よりも 低 下 することから, 魚 種 によってはこの 方 法 を 用 いて 全 雌 生 産 の 産 業 化 に 必 要 な 尾 数 を 確 保 するのは 極 めて 困 難 である しかし, 雌 性 発 生 二 倍 体 は, 遺 伝 的 雌 のホルモンによる 偽 雄 化 にも 活 用 できる 偽 雄 を 作 出 するホルモン 処 理 には 性 的 に 未 分 化 の 孵 化 後 間 もない 個 体 を 用 いることが 多 いが, 天 然 の 個 体 を 用 い た 場 合, 遺 伝 的 雄 と 雌 が 1:1 で 混 在 することから, 作 出 した 雄 の 半 分 が 遺 伝 的 雄 となる そのため, 本 来 の 性 がいずれであったかを 検 討 し, 偽 雄 のみを 選 別 し なければならない 偽 雄 と 遺 伝 的 雄 を 判 別 するにはホシガレイが 成 熟 する 2 歳 まで 飼 育 し, 採 取 した 精 子 を 用 いて 後 代 検 定 を 行 う 方 法 があるが,そのために は 飼 育 の 労 力 や 場 所 および 親 魚 の 個 体 識 別 も 必 要 であり, 非 効 率 的 である 一 方, 雄 化 処 理 を 施 す 魚 が 遺 伝 的 雌 のみであれば, 雄 化 処 理 後 に 出 現 した 雄 は 間 違 いなく 偽 雄 であり, 後 代 検 定 の 必 要 がない このように 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 は 偽 雄 作 出 に 活 用 可 能 である この 場 合, 雌 性 発 生 二 倍 体 を 直 接 全 雌 生 産 用 の 種 苗 として 利 用 するのとは 異 なり, 人 工 授 精 に 用 いる 精 液 は 数 個 体 の 偽 雄 か ら 必 要 量 を 十 分 に 得 られることから, 雌 性 発 生 処 理 によって 生 残 率 が 低 下 し, 7

11 わずかの 個 体 しか 生 産 できなかったとしても 十 分 利 用 可 能 である そこで 本 研 究 では,ホシガレイの 雌 性 発 生 二 倍 体 を 作 出 条 件 を 確 認 するための 試 験 を 行 っ た 一 般 に, 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 において, 対 象 種 の 卵 発 生 を 誘 起 でき,かつ 雑 種 を 生 じても 非 生 存 性 となる 異 種 精 子 を 用 いれば, 作 出 個 体 が 雌 性 発 生 二 倍 体 であるか 否 かの 判 断 が 容 易 になること( 山 川 ら 1987)から,これまでホシガ レイの 雌 性 発 生 にはマダイ Pagrus major( 八 木 ら 2004),マコガレイ Limanda yokohamae( 八 木 ら 2005)およびスズキ Lateolabrax japonicus(ji et al. 2010) の 精 子 が 用 いられている 本 研 究 では,これまでの 事 例 をもとにマダイ 精 子 を 用 いるとともに,ホシガレイ 精 子 を 用 いて 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 を 試 みた 材 料 および 方 法 供 試 魚 長 崎 県 橘 湾 で 漁 獲 されたホシガレイ 天 然 親 魚 を 長 崎 県 総 合 水 産 試 験 場 へ 搬 入 し 実 験 に 用 いた 配 偶 子 の 確 保 にあたり, 山 田 ら(2006)に 従 い, 背 筋 部 へヒ ト 絨 毛 性 生 殖 腺 刺 激 ホルモン(HCG)を 100 IU/kg BW となるように 投 与 した その 後 24 時 間 以 上 経 過 した 雌 親 魚 より 採 卵 し, 雄 からは 採 精 を 行 った また, 採 精 用 マダイ 親 魚 には, 長 崎 市 内 の 養 殖 業 者 から 入 手 した 養 殖 魚 を 長 崎 県 総 合 水 産 試 験 場 において 養 成 した 4 歳 魚 を 用 いた 雌 性 発 生 用 の 精 子 の 確 保 にあた り,マダイ 親 魚 を 12 月 に 海 面 生 簀 から 陸 上 水 槽 に 収 容 し, 飼 育 水 温 を 徐 々に 昇 温 して 20 で 成 熟 を 促 し, 採 精 した 紫 外 線 照 射 試 験 用 の 配 偶 子 は,5 月 に 海 面 生 簀 内 で 成 熟 した 親 魚 から 採 卵 および 採 精 した 8

12 精 子 への 紫 外 線 照 射 による 遺 伝 的 不 活 化 精 子 を 不 活 化 する 適 切 な 紫 外 線 照 射 量 を 確 認 するため,マダイおよびホシガ レイの 精 子 を 用 いて 実 験 を 行 った 親 魚 から 採 取 したマダイおよびホシガレイ の 精 液 をクロダイ 人 工 精 漿 (Morisawa 1985)で 100 倍 に 希 釈 した 希 釈 精 液 5 ml を 直 径 14 cm のプラスチックシャーレ 上 に 薄 く 延 ばし,ロータリーシェー カーで 振 とうしながら, 殺 菌 灯 1 本 (GL-15, 東 芝 )により 紫 外 線 を 照 射 した 紫 外 線 照 射 量 は,シャーレ 上 の 5 箇 所 の 紫 外 線 強 度 を 紫 外 線 強 度 計 (UVC-254, カスタム)を 用 いて 測 定 し,その 平 均 値 に 照 射 時 間 を 乗 じて 算 出 した 照 射 紫 外 線 量 は,マダイ 精 子 では 1,2,5,10,20,30,40,50,60 および 70 mj/cm 2, ホシガレイ 精 子 では 0.5,1,2,5,10,20,30,40 および 50 mj/cm 2 とした 精 子 の 不 活 性 化 の 程 度 を 調 べる 実 験 では, 紫 外 線 照 射 した 精 子 を 同 種 の 成 熟 卵 と 人 工 授 精 させ,その 後 の 発 生 の 変 化 を 観 察 した 成 熟 卵 を 試 験 区 毎 にボウ ルへ 分 け, 紫 外 線 を 照 射 した 精 子 を 媒 精 した 対 照 区 には, 紫 外 線 を 照 射 して いない 精 子 を 媒 精 した 浮 上 卵 100 粒 以 上 を 500 ml ビーカーに 収 容 し,イン キュベーターで 卵 管 理 した 孵 化 までの 期 間 中 は,1 日 1 回, 沈 卵 の 除 去 および 海 水 交 換 を 行 い, 実 体 顕 微 鏡 を 用 いて 卵 または 孵 化 仔 魚 を 観 察 した 受 精 率, 胚 体 形 成 率 および 孵 化 率 は, 次 の 式 で 算 出 した 受 精 率 (%) = ( 受 精 卵 数 /ビーカー 収 容 卵 数 ) 100 胚 体 形 成 率 (%) = ( 胚 体 形 成 卵 数 /ビーカー 収 容 卵 数 ) 100 孵 化 率 (%) = ( 孵 化 仔 魚 数 /ビーカー 収 容 卵 数 ) 100 雌 性 発 生 処 理 条 件 の 検 討 低 温 処 理 によりホシガレイの 第 二 極 体 放 出 阻 止 型 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 を 試 みた 卵 発 生 の 誘 起 には,30 mj/cm 2 の 紫 外 線 照 射 により 不 活 化 したマダイ 精 9

13 子 を 用 いた 低 温 処 理 の 各 条 件 を 検 討 するため,1) 授 精 から 低 温 処 理 開 始 まで の 時 間,2) 低 温 処 理 の 継 続 時 間,および 3) 処 理 水 温 の 3 項 目 について 実 験 を 行 った 低 温 処 理 開 始 時 間 の 検 討 は, 開 始 時 間 を 授 精 後 1.5,3,5 および 7 分 とし, この 4 区 について-1 の 低 温 処 理 を 60 分 間 継 続 することにより 行 った 開 始 時 間 の 影 響 は, 受 精 率 および 孵 化 率 によって 評 価 した 低 温 処 理 の 継 続 時 間 の 検 討 は, 処 理 時 間 を 30,60 および 90 分 間 とし,この 3 区 について, 受 精 3 分 後 から 0.5 の 低 温 処 理 を 施 して, 受 精 率 および 孵 化 率 を 算 出 した 低 温 処 理 水 温 の 検 討 は, 処 理 水 温 を-1,1,3 および 5 とし,この 4 区 について 受 精 3 分 後 に 60 分 間 の 低 温 処 理 により 行 った この 実 験 では, 不 活 化 マダイ 精 子 に 加 えて, 不 活 化 していないホシガレイとマダイの 精 子 を 用 いた 低 温 処 理 を 施 さない 試 験 区 も 設 け( 自 然 水 温,14 ), 授 精 率 および 孵 化 率 を 求 めた 低 温 処 理 には,チ ラー(CL-80R,タイテック)または 海 水 氷 により 冷 却 した 海 水 を 用 いた 上 記 の 全 ての 試 験 には, 異 なる 3 個 体 の 親 魚 より 得 られた 卵 を 用 いて 同 一 の 試 験 を 繰 り 返 し 行 った 統 計 処 理 授 精 率 および 孵 化 率 の 有 意 差 は 一 元 配 置 の ANOVA の 後,Tukey-Kramer 法 による 多 重 比 較 により 求 めた 結 果 精 子 の 遺 伝 的 不 活 化 紫 外 線 照 射 により 不 活 化 した 精 子 を 用 いた 受 精 試 験 の 結 果 を Fig. 3 に 示 す 10

14 マダイの 精 子 では, 紫 外 線 を 照 射 しない 対 照 区 の 授 精 率 は 72.8%, 胚 体 形 成 率 および 孵 化 率 は 67.3%および 63.4%であった 1 mj/cm 2 の 紫 外 線 を 照 射 した 精 子 を 用 いると, 胚 体 形 成 率 および 孵 化 率 が 大 幅 に 低 下 し,28.0%および 17.4% と 最 低 値 となった 紫 外 線 照 射 量 の 増 加 に 伴 い,10 mj/cm 2 で 胚 体 形 成 率 およ び 孵 化 率 が 62.3%および 48.7%に 回 復 した 紫 外 線 照 射 区 の 孵 化 仔 魚 は 全 て 体 が 湾 曲 した 奇 形 魚 であった ホシガレイ 精 子 では, 紫 外 線 を 照 射 しない 対 照 区 の 授 精 率 は 69.8%と 比 較 的 高 く, 胚 体 形 成 率 および 孵 化 率 は 50.8%および 32.5%であった 紫 外 線 0.5 mj/cm 2 の 照 射 では, 胚 体 形 成 率 および 孵 化 率 の 低 下 が 確 認 され,1 mj/cm 2 の 照 射 によりそれらは 大 幅 に 低 下 した 1 mj/cm 2 での 胚 体 形 成 率 および 孵 化 率 は 最 低 値 の 7.6%および 0%を 示 した 2 mj/cm 2 以 上 の 照 射 では 胚 体 形 成 率 が 15.9%となり, 照 射 量 の 増 加 とともに 胚 体 形 成 率 も 増 加 し,30 mj/cm 2 以 上 で 横 ばいとなり,40 mj/cm 2 において 51.8%と 最 高 値 を 示 した また,1 mj/cm 2 以 上 の 照 射 区 では 生 存 した 孵 化 仔 魚 はみられなかった 1 mj/cm 2 以 上 の 紫 外 線 を 照 射 した 区 の 胚 体 は, 対 照 区 のそれと 比 較 して 体 が 太 く 短 い, 半 数 体 の 特 徴 を 示 した 11

15 Fig. 3. Effect of UV irradiation to sperm on fertilization ( ), embryo forming ( ) and hatching ( ). 12

16 雌 性 発 生 処 理 条 件 低 温 処 理 開 始 時 間 を 検 討 した 試 験 の 結 果 を Fig. 4 に 示 す 受 精 率 は 1.5~7 分 後 の 各 区 で 有 意 差 がみられなかったものの,1.5 分 後 区 が 他 の 区 と 比 較 して,や や 低 い 値 を 示 した 孵 化 率 は 受 精 3 分 後 の 値 が 他 の 区 と 比 較 して 高 かったが, 有 意 差 はなかった 低 温 処 理 の 継 続 時 間 を 検 討 した 試 験 の 結 果 を Fig. 5 に 示 す 授 精 率 は 処 理 時 間 が 長 くなるに 従 って 低 下 する 傾 向 がみられたが, 各 区 間 に 有 意 差 はなかった また, 孵 化 率 は 60 分 間 処 理 区 において,30 および 90 分 間 処 理 よりも 高 い 値 を 示 したが, 有 意 差 はなかった 低 温 処 理 水 温 の 影 響 を 調 べた 試 験 の 結 果 を Fig. 6 に 示 す ホシガレイ 精 子, マダイ 精 子 および 紫 外 線 照 射 により 不 活 化 したマダイ 精 子 の 受 精 率 は 57.4~ 60.1%となり,ほぼ 同 じ 値 を 示 し, 有 意 差 はみられなかった 低 温 処 理 水 温 の 影 響 を 調 べたところ, 低 温 処 理 を 施 さなかった 卵 の 授 精 率 と 比 べ, 低 温 処 理 を 施 した 卵 の 授 精 率 は 39.4~49.4%となり, 低 値 を 示 したが, 有 意 差 はみられな かった また,この 受 精 率 は 処 理 水 温 が 高 くなるに 従 い, 増 加 する 傾 向 がみら れた 孵 化 率 は,ホシガレイ 精 子 を 用 い 低 温 処 理 を 施 さない 卵 では 43.6±19.3% であったが,-1~3 の 低 温 処 理 区 では 7.1~7.6%と 低 い 値 を 示 し (P<0.05),5 処 理 区 では 10.7%となり, 有 意 差 は 認 められなかった 13

17 Fig. 4. Effects of starting time after fertilization of cold shock treatment on fertilization (A) and hatching (B). Bars indicate SD. 14

18 Fig. 5. Effect of cold shock duration on fertilization (A) and hatching (B). Bars indicate SD. 15

19 Fig. 6. Effect of cold water temperature on fertilization (A) and hatching (B). Bars indicate SD. Different letters show significantly different mean values (P<0.05). 16

20 考 察 紫 外 線 を 照 射 したマダイおよびホシガレイの 精 子 を 人 工 受 精 に 用 いたホシガ レイ 卵 の 胚 体 形 成 率 は 紫 外 線 照 射 により 減 少 し,1 mj/cm 2 において 最 低 値 を 示 した さらに 紫 外 線 照 射 量 の 増 加 に 伴 い 胚 体 形 成 率 は 徐 々に 増 加 し,マダイ 精 子 では 10 mj/cm 2,ホシガレイ 精 子 では 30 mj/cm 2 以 上 の 照 射 量 で 対 照 区 とほ ぼ 同 等 まで 胚 体 形 成 率 が 回 復 した 孵 化 率 は 胚 体 形 成 率 と 同 様 に 1 mj/cm 2 で 最 低 値 を 示 し,マダイ 精 子 では 紫 外 線 量 の 増 加 に 伴 い 増 加 した ホシガレイ 精 子 では 1 mj/cm 2 以 上 の 照 射 区 では 孵 化 仔 魚 はみられなかった これは, 紫 外 線 照 射 による Hertwig 効 果 であると 推 察 される Hertwig 効 果 とは, 紫 外 線 等 の 照 射 により 精 子 の 染 色 体 が 部 分 的 に 切 断 されることによって 胚 発 生 に 対 して 生 じ た 有 害 作 用 が,ある 線 量 を 超 すと 精 子 の 染 色 体 が 消 失 または 動 原 体 が 損 失 し, これが 卵 割 に 参 加 しなくなることにより, 逆 に 減 少 していくことである( 小 野 里 1982) このことから, 精 子 への 紫 外 線 照 射 はマダイでは 10 mj/cm 2 以 上, ホシガレイでは 30 mj/cm 2 以 上 行 うことで, 精 子 の 遺 伝 子 が 完 全 に 不 活 化 され ると 推 察 された 既 往 の 報 告 による 孵 化 率 が 低 下 する 紫 外 線 量 は,ヒラメ 精 子 では 1.1~2.3 mj/cm 2 ( 田 畑 ら 1986),マツカワ 精 子 では 2~5 mj/cm 2 ( 森 ら 2004)であり, 本 研 究 の 結 果 とほぼ 同 じであった マダイ 精 子 では 3~10 mj/cm 2 ( 山 川 ら 1987)と 本 研 究 の 結 果 より 照 射 線 量 が 高 いが,これは 使 用 しているシ ャーレの 大 きさ( 直 径 9 cm)と 処 理 液 量 (3 ml)による 液 量 の 深 さおよび 精 子 の 希 釈 濃 度 (50 倍 )による 差 と 推 察 される 雌 性 発 生 においては, 紫 外 線 照 射 および 倍 化 操 作 の 成 否 により 雌 性 発 生 二 倍 体 の 他 に, 同 種 の 精 子 を 用 いた 場 合 には 3 倍 体, 通 常 の 2 倍 体 および 半 数 体 が 作 出 され, 異 種 の 精 子 では 異 質 3 倍 体, 交 雑 魚 および 半 数 体 が 生 じる ホシガレ 17

21 イ 卵 およびマダイ 精 子 を 用 いて 雌 性 発 生 魚 の 作 出 を 行 った 場 合, 異 質 3 倍 体 お よび 交 雑 魚 が 僅 かに 孵 化 するが,こちらは 開 口 までに 全 てへい 死 し, 半 数 体 は 孵 化 しないことから, 生 残 魚 は 雌 性 発 生 二 倍 体 と 推 察 される( 八 木 ら 2004) したがって,ホシガレイの 雌 性 発 生 二 倍 体 作 出 には 異 種 精 子 であるマダイ 精 子 が 有 用 であると 判 断 した しかし,マダイはホシガレイの 産 卵 期 である 冬 季 に は, 成 熟 促 進 用 の 加 温 水 槽 が 必 要 なことから, 将 来 は 八 木 ら(2005)が 検 討 し ているマコガレイのようなハンドリングが 容 易 でホシガレイと 成 熟 期 が 同 時 期 である 異 種 魚 種 の 精 子 を 用 いることが 望 ましいと 思 われる 低 温 処 理 による 雌 性 発 生 魚 の 作 出 条 件 として, 低 温 処 理 の 開 始 時 間, 処 理 の 継 続 時 間 および 処 理 水 温 の 3 項 目 について 実 験 を 行 った 低 温 処 理 の 開 始 時 間 を 検 討 したところ, 受 精 1.5~7 分 後 の 全 ての 区 において 孵 化 仔 魚 が 得 られた 雌 親 魚 により 傾 向 は 異 なるものの, 授 精 3 分 後 の 処 理 開 始 が 最 も 高 い 孵 化 率 を 示 した マツカワの 雌 性 発 生 二 倍 体 作 出 では, 受 精 3~11 分 後 の 処 理 開 始 により 孵 化 仔 魚 が 得 られ,9 分 後 の 孵 化 率 が 有 意 に 高 くなっている( 森 ら 2004) こ の ように,マツカワではホシガレイより 処 理 開 始 時 間 を 遅 くしても 高 い 孵 化 率 が 得 られている これは 森 ら(2004)によるマツカワの 卵 管 理 水 温 が 8~10 と 本 試 験 の 卵 管 理 水 温 12~14 より 2~6 低 く, 卵 発 生 速 度 が 遅 いことが 原 因 の 一 つと 考 えられた 低 温 処 理 の 継 続 時 間 の 試 験 では,30~90 分 間 の 全 ての 試 験 区 で 孵 化 仔 魚 が 得 られた 卵 のロットにより 傾 向 は 異 なるが,60 分 間 の 低 温 処 理 の 孵 化 率 が 高 く, 最 も 適 していると 考 えられた 他 の 異 体 類 の 低 温 処 理 継 続 時 間 は,マツカワでは 60~90 分 間 ( 森 ら 2004),ヒラメでは 45 分 間 ( 田 畑 ら 1986),マコガレイでは 60 分 間 ( 柿 本 ら 1994),ヌマガレイ Platichthys stellatus では 60 分 間,スナガレイ Limanda punctatissima では 60 分 間 であ り( 矢 野 酒 井 1988), 本 研 究 のホシガレイの 結 果 とほぼ 同 じであった 低 温 18

22 処 理 水 温 の 試 験 では,-1~5 の 全 ての 区 で 孵 化 仔 魚 が 得 られたが,ほとんどが 奇 形 魚 であった この 比 較 試 験 では 最 適 な 処 理 水 温 を 明 らかにすることはでき なかったが,これまでに 行 った 雌 性 発 生 二 倍 体 の 作 出 では,-1.2~1.4 の 低 温 処 理 により 雌 性 発 生 二 倍 体 魚 が 得 られていることから,この 範 囲 内 に 低 温 処 理 に 適 した 水 温 があると 推 察 された これらの 結 果 から, 受 精 3 分 後 に-1.2~1.4 の 低 温 処 理 を 60 分 間 継 続 することで 雌 性 発 生 二 倍 体 が 作 出 できると 考 えられた これは 八 木 ら(2004)が 授 精 5 分 後 に,-1 の 低 温 処 理 を 60 分 間 継 続 すること で 雌 性 発 生 二 倍 体 が 得 られると 報 告 した 事 例 とほぼ 一 致 していることから,ホ シガレイに 適 した 方 法 であると 考 えられる 19

23 第 3 章 人 為 的 な 性 制 御 第 1 節 ホシガレイの 性 分 化 魚 類 の 遺 伝 的 な 性 を 人 為 的 に 性 ホルモン 等 の 処 理 により 制 御 するには, 性 分 化 期 間 の 初 期 から 終 了 までの 全 期 間 を 通 して 性 制 御 の 処 理 を 継 続 する 必 要 がある (Nakamura and Takahashi 1973)とされることから, 性 制 御 を 行 うにあたり 対 象 種 の 性 分 化 の 時 期 および 期 間 を 確 認 しておくことが 必 要 である( 森 ら 1995) そこで,ホシガレイにおいても, 性 分 化 に 関 する 知 見 を 得 ることを 試 みた 材 料 および 方 法 供 試 魚 長 崎 県 橘 湾 において 漁 獲 されたホシガレイ 天 然 親 魚 から 第 2 章 と 同 様 に, HCG を 用 いて 採 卵 し, 人 工 授 精 により 得 られた 仔 稚 魚 を 供 試 魚 に 用 いた 実 験 に 用 いた 仔 魚 の 発 育 ステージの 分 類 表 記 は, 有 瀧 ら(2001)の 定 義 に 従 った 全 長 6.1±0.1 mm(4 日 齢,ステージ C)の 仔 魚 1,000 尾 および 全 長 18.7±1.5 mm(46 日 齢,ステージ H)の 仔 魚 1,000 尾 をそれぞれ 200 l および 500 l 水 槽 に 収 容 し, 飼 育 した 仔 魚 への 餌 料 系 列 には, 宮 木 ら(2005)の 方 法 に 従 い, シオミズツボワムシ L 型 Brachionus plicatilis を 5 日 齢 から, 配 合 飼 料 (ラブ ラァバ, 林 兼 産 業 )を 30 日 齢 から,アルテミア Artemia sp. のノープリウス 幼 生 を 37 日 齢 から 給 餌 した シオミズツボワムシとアルテミアは, 栄 養 強 化 剤 (バ イオクロミスリキッド,クロレラ 工 業 )により 給 餌 前 に 栄 養 強 化 した 飼 育 水 には 紫 外 線 殺 菌 海 水 を 用 い, 自 然 水 温 で 飼 育 した シオミズツボワムシの 給 餌 期 間 中 はナンノクロロプシス Nannochloropsis oculata を 50 cells/ml になるよ う 飼 育 水 へ 添 加 した 20

24 サンプリング 200l 水 槽 からは 15,25 および 30~100 日 齢 まで 10 日 毎 に 各 10 個 体 をサン プリングし,500l 水 槽 からは 80~180 日 齢 まで 10 日 毎 に 各 10 個 体 をサンプリ ングした 採 取 した 仔 稚 魚 は, 万 能 投 影 機 を 用 いて 全 長 を 測 定 した 生 殖 腺 の 組 織 学 的 観 察 サンプリングした 全 ての 供 試 魚 は,ブアン 氏 液 で 固 定 後,70%エタノールで 保 存 した 固 定 した 生 殖 腺 を 定 法 により 5 μm のパラフィン 切 片 にし,ヘマトキ シリン エオシンの 二 重 染 色 を 施 し, 光 学 顕 微 鏡 下 で 観 察 した 仔 魚 の 発 育 ス テージを 有 瀧 ら(2001)に 従 って 判 定 した 結 果 生 殖 腺 の 組 織 像 を Fig. 7 に 示 す 30 日 齢 の 仔 魚 は 全 長 12.7±0.9 mm(n=10), ステージ E であった 組 織 観 察 により, 副 腎 輸 管 と 消 化 管 の 間 に 一 対 の 生 殖 隆 起 が 認 められた 生 殖 隆 起 内 部 には, 少 数 の 始 原 生 殖 細 胞 が 認 められる 未 分 化 の 状 態 であった(Fig. 7-A) 70 日 齢 の 仔 魚 は 全 長 20.5±1.0 mm(n=10), ス テージ H でほぼ 変 態 を 完 了 しており, 着 底 していた これらの 個 体 の 生 殖 腺 は 大 きくなり, 厚 みも 50 μm ほどを 示 し, 副 腎 輸 管 から 肛 門 方 向 へ 伸 長 した ま た, 生 殖 細 胞 数 も 増 加 したが, 生 殖 腺 において 性 分 化 を 示 す 形 態 的 特 徴 は 確 認 されなかった(Fig. 7-B) 90 日 齢 の 稚 魚 は 全 長 28.4±4.9 mm(n=10),ステ ージ I で 変 態 が 完 了 していた 生 殖 腺 の 組 織 観 察 において, 一 部 の 個 体 で 生 殖 腺 に 卵 巣 腔 の 形 成 が 初 めて 確 認 され, 雌 への 性 分 化 が 確 認 された 減 数 分 裂 中 の 生 殖 細 胞 が 多 く 観 察 され, 生 殖 腺 内 の 細 胞 数 がさらに 増 加 していた(Fig. 7-C) 21

25 100 日 齢 の 稚 魚 は 全 長 35.4±5.2 mm(n=10)であった 生 殖 腺 の 外 部 形 態 によ り 2 つの 型 に 分 類 できるようになった 一 方 は 腹 腔 最 後 部 から 尾 部 の 筋 肉 に 沿 って 生 殖 腺 が 後 方 へ 伸 長 し,この 生 殖 腺 組 織 には 卵 巣 腔 の 形 成 が 確 認 され, 雌 への 分 化 が 確 認 された(Fig. 7-D) 他 方 の 生 殖 腺 では 後 方 への 伸 長 が 認 められ ず, 腹 腔 後 部 に 付 着 しているだけであった 組 織 観 察 では 結 合 組 織 が 多 く 認 め られ, 生 殖 細 胞 は 卵 巣 へ 分 化 した 個 体 と 比 較 すると 少 なく, 将 来 は 雄 へ 分 化 す ると 考 えられた(Fig. 7-E) 120 日 齢 の 稚 魚 は 全 長 59.4±14.1 mm(n=10)で あった 卵 巣 では, 卵 巣 腔 がさらに 伸 長 し, 卵 巣 薄 板 が 形 成 され, 減 数 分 裂 前 期 の 卵 母 細 胞 が 多 数 確 認 された 一 部 に 染 色 仁 期 の 卵 母 細 胞 が 観 察 され, 雌 へ の 分 化 が 進 んでいた(Fig. 2-F) 160 日 齢 の 稚 魚 は 全 長 93.2±12.9 mm(n=10) に 成 長 し, 卵 巣 内 には 周 辺 仁 期 の 卵 母 細 胞 が 多 数 観 察 された(Fig. 7-G) 一 方, 精 巣 に 分 化 すると 考 えられる 生 殖 腺 では 精 原 細 胞 がみられ, 包 嚢 を 形 成 した (Fig. 7-H) 22

26 Fig. 7. Cross sections of gonad in spotted halibut Verasper variegatus. A, 30 days after hatching (DAH). Arrows show the sexually undifferentiated gonad; B, Sexually indifferent gonad at 70 DAH; C, Ovary at 90 DAH. Arrow head shows the ovarian cavity; D, Ovary at 100 DAH. Arrow head shows the ovarian cavity; E, Gonad at 100 DAH; F, Ovary including perinucleolus oocytes at 120 DAH; G, Ovary including perinucleolus oocytes at 160 DAH; H, Testis including spermatogonia at 160 DAH; Bars=100 μm. 23

27 考 察 本 研 究 によって,ホシガレイの 性 分 化 過 程 が 明 らかになった 自 然 水 温 で 飼 育 したホシガレイは,70 日 齢 ( 全 長 21 mm,ステージ H)までは 性 的 未 分 化 の 状 態 であったが,90 日 齢 ( 全 長 28 mm,ステージ I)の 稚 魚 では, 一 部 の 個 体 で 生 殖 腺 に 卵 巣 腔 の 形 成 が 初 めて 確 認 され, 雌 への 性 分 化 が 確 認 された 100 日 齢 ( 全 長 35 mm,ステージ I)では 生 殖 腺 の 外 部 形 態 が 2 つの 型 に 分 類 され た すなわち, 一 方 の 生 殖 腺 は 形 態 的 に 未 分 化 のままであったが, 他 方 のそれ では 卵 巣 腔 の 形 成 が 観 察 されており, 卵 巣 への 分 化 が 確 認 された このことか ら,ホシガレイの 雌 への 性 分 化 は 70~100 日 齢 ( 全 長 21~35 mm,ステージ H ~I)の 間 に 行 われると 推 察 された また, 多 くの 魚 種 と 同 様 に, 雌 における 卵 母 細 胞 の 出 現 が 雄 における 精 母 細 胞 の 出 現 よりも 早 期 に 観 察 された ヒラメで は,75~88 日 齢 ( 全 長 30 mm 前 後 )の 雌 において 卵 巣 腔 の 形 成 がみられ, 体 の 後 方 へ 生 殖 腺 が 伸 長 し,88 日 齢 ( 全 長 55 mm)の 稚 魚 で 減 数 分 裂 初 期 の 卵 母 細 胞 が 初 めて 確 認 されている( 田 中 1987) また,マツカワでは,73 日 齢 ( 全 長 30 mm)の 個 体 の 生 殖 腺 は 未 分 化 で 雌 雄 判 別 できないが,99 日 齢 ( 全 長 55 mm)では 生 殖 腺 に2つの 型 がみられ, 一 方 に 卵 巣 腔 の 形 成 が 確 認 され, 雌 への 分 化 が 確 認 されている( 森 ら 1995) ホシガレイは,ヒラメと 比 較 して 雌 への 性 分 化 が 若 干 遅 く,マツカワとほぼ 同 じであることが 分 かった これは,ホシ ガレイの 変 態 完 了 が 70~80 日 齢 前 後 ( 全 長 25 mm 前 後 )とヒラメの 変 態 完 了 (36~50 日 齢, 全 長 9.0~19.4 mm, 原 田 ら 1966)よりも 遅 れることから, 魚 種 による 発 生 および 発 達 速 度 の 違 いと 関 連 していると 考 えられる 24

28 第 2 節 高 水 温 飼 育 による 性 転 換 本 種 の 近 縁 種 であるマツカワでは, 性 分 化 期 の 仔 魚 を 高 水 温 で 飼 育 すると 性 比 が 雄 に 偏 ることが 報 告 されており(Goto et al. 1999; 森 2006),ヒラメでは 性 分 化 期 に 高 水 温 飼 育 することにより 雄 化 される( 山 本 1992; 岩 田 ら 1998) このように 仔 魚 の 高 水 温 処 理 が 遺 伝 的 な 雌 個 体 の 性 を 雄 に 誘 導 することは,ヒ ラメ 科 やカレイ 科 の 魚 類 においては 一 般 的 な 現 象 と 考 えられ,ホシガレイも 飼 育 水 温 の 調 節 によって 雄 化 を 誘 導 できる 可 能 性 が 考 えられる 本 種 においても マツカワおよびヒラメと 同 様 に 飼 育 水 温 の 調 節 により 人 為 的 に 偽 雄 を 作 出 することにより, 全 雌 種 苗 の 生 産 が 可 能 となる しかし,ホシガレイ 仔 稚 魚 は 高 水 温 により 生 残 率 が 低 下 することが 知 られており( 村 田 ら 1998; 佐 久 間 2001), 雄 化 を 促 す 高 水 温 処 理 は, 生 残 に 悪 影 響 を 及 ぼすことが 予 想 される したがっ て, 本 種 において 高 水 温 処 理 によって 産 業 的 に 利 用 できる 雄 化 を 行 うことが 可 能 か 否 かを 明 らかにするためには, 高 水 温 の 性 分 化 に 及 ぼす 影 響 に 加 えて, 生 残 に 及 ぼす 影 響 についても 検 討 する 必 要 がある そこで, 本 研 究 では 異 なる 水 温 でホシガレイの 仔 稚 魚 を 飼 育 し, 生 残 および 性 分 化 に 及 ぼす 水 温 の 影 響 を 調 べた 材 料 および 方 法 供 試 魚 平 成 21~23 年 1 月 に 長 崎 県 橘 湾 で 漁 獲 された 天 然 魚 から, 人 工 授 精 により 得 られた 受 精 卵 をアルテミア 孵 化 槽 で 卵 管 理 し, 孵 化 仔 魚 を 飼 育 水 槽 へ 収 容 し, 後 述 する 条 件 で 飼 育 した 仔 魚 への 餌 料 系 列 には,シオミズツボワムシ L 型 を 5 日 齢 から, 配 合 飼 料 (ラブラァバ, 林 兼 産 業 )を 30 日 齢 から,アルテミアのノ 25

29 ープリウス 幼 生 を 37 日 齢 から 給 餌 した シオミズツボワムシとアルテミアは, 栄 養 強 化 剤 (バイオクロミスリキッド,クロレラ 工 業 )により 栄 養 強 化 した 飼 育 水 には 紫 外 線 殺 菌 海 水 を 用 い,シオミズツボワムシの 給 餌 期 間 中 はナンノ クロロプシスを 50 cells/ml になるよう 添 加 した 試 験 方 法 本 実 験 における 飼 育 条 件 を Table 1 に, 水 温 処 理 方 法 を Fig. 8 に 示 す また, 実 験 に 用 いた 仔 魚 の 発 育 ステージの 分 類 表 記 は, 有 瀧 ら(2001)に 従 った 試 験 1 では 全 長 6.1±0.1 mm(4 日 齢,ステージ C)の 仔 魚 1,000 尾 を 200 l 水 槽 に 収 容 し,10,20,23,26,28 および 自 然 水 温 ( )の 6 つの 異 なる 条 件 下 で 飼 育 した 試 験 2 では 全 長 15.0±1.3 mm(40 日 齢,ステ ージ G~H)の 仔 魚 1,000 尾 を 1 kl 水 槽 に 収 容 し,26,28 および 自 然 水 温 ( )で 飼 育 した 試 験 3 では 全 長 18.7±1.5 mm(46 日 齢,ステー ジ H)の 仔 魚 1,000 尾 を 500 l 水 槽 に 収 容 し,23 および 自 然 水 温 ( ) で 飼 育 した 試 験 4 では 全 長 34.6±3.9 mm(95 日 齢,ステージ I)の 稚 魚 300 尾 を 300 l 水 槽 に 収 容 し,28 および 自 然 水 温 ( )で 飼 育 した 28 での 飼 育 は 130 日 齢 (28 -a 区 )および 146 日 齢 (28 -b 区 )までとし, 以 降 は 自 然 水 温 とした 各 試 験 において, 自 然 水 温 で 飼 育 した 水 槽 を 対 照 区 とした 試 験 区 における 水 温 設 定 は, 設 定 水 温 になるまで 1 / 日 の 割 合 で 飼 育 水 を 昇 温 または 冷 却 した また, 自 然 水 温 が 設 定 水 温 を 超 えた 場 合 には, 自 然 水 温 で 飼 育 を 継 続 した 各 水 槽 の 水 温 はデジタル 温 度 計 (SK-250WPⅡ-K, 佐 藤 計 量 器 製 作 所 )を 用 い, 毎 日 午 前 8~9 時 頃 に 測 定 した 26

30 Table 1. Outline of the rearing experiments Exp. Water temperature ( ) Age of days at the start of experiment (DAH) Initial number of larvae / tank Capacity of tank (kl) Control Control Control Control 23 Control 28-a 28-b 4 1, , , ,

31 DAH 20 DAH 17 DAH 15 DAH 4 DAH Cont DAH 65 DAH 62 DAH DAH A 142 DAH 140 DAH B 192 DAH Water temperature ( ) DAH 49 DAH 50 DAH Cont. 23 Cont. 141 DAH C a 110 DAH 131 DAH 146 DAH 28 -b D 95 DAH Cont. 138 DAH 150 DAH 0 0 DAH 200 Fig.8. Experimental design for study on temperature effects in spotted halibut Verasper variegatus. A, Experiment 1; B, Experiment 2; C, Experiment 3; D, Experiment 4. Control fish was reared on natural water temperature. 28

32 サンプリング 試 験 1 では 15,25 および 30~100 日 齢 まで 10 日 毎 に 各 試 験 区 から 10 個 体 ずつサンプリングし, 試 験 終 了 時 (200 日 齢 )に 対 照 区,10 区 および 20 区 からそれぞれ 120 個 体,23 区 から 25 個 体 をサンプリングした なお,26 および 28 区 ではへい 死 魚 が 多 かったため,7 日 齢 において 各 10 個 体 をサンプ リングした また,26 区 では 40 日 齢 に 25 個 体 を 採 集 し 試 験 を 終 了 したが, 28 区 はそれまでに 全 てがへい 死 した 試 験 2 では 40~100 日 齢 の 期 間,10 日 毎 に 各 試 験 区 から 10 個 体 ずつサンプリングし, 試 験 終 了 時 (200 日 齢 )に 対 照 区 から 180 個 体,26 区 から 161 個 体 をそれぞれサンプリングした ただし, 28 区 では 飼 育 個 体 が 大 量 へい 死 したため,140 日 齢 で 実 験 を 終 了 した 試 験 3 では 80~180 日 齢 の 期 間,10 日 毎 に 各 試 験 区 から 10 個 体 ずつサンプリングし, 試 験 終 了 時 (200 日 齢 )に 各 区 から 120 尾 ずつをサンプリングした 試 験 4 で は 134 日 齢 および 174 日 齢 に 各 試 験 区 から 10 尾 ずつサンプリングし, 試 験 終 了 時 (200 日 齢 )に 対 照 区 から 177 個 体,28 -a 区 から 158 個 体 および 28 -b 区 から 75 個 体 をそれぞれサンプリングした 生 残 率 の 算 出 試 験 開 始 時 から 50 日 齢,51~100 日 齢,101~150 日 齢,151~200 日 齢 まで の 生 残 率 と 試 験 期 間 内 での 生 残 率 をそれぞれ 求 めた 生 残 率 は 以 下 の 式 により 算 出 した 生 残 率 (%) = ( 生 残 個 体 数 / 収 容 個 体 数 または 各 期 間 の 初 日 の 生 残 個 体 数 )

33 生 殖 腺 の 組 織 学 的 観 察 および 雌 雄 比 の 調 査 サンプリングした 全 ての 供 試 魚 は 全 長 を 測 定 した 後,ブアン 氏 液 で 固 定 し, 70%エタノールで 保 存 した 固 定 した 生 殖 腺 を 定 法 により 5 μm のパラフィン 切 片 にし,ヘマトキシリン エオシンの 二 重 染 色 を 施 し, 光 学 顕 微 鏡 下 で 観 察 した また, 飼 育 水 温 と 雌 雄 比 の 関 係 を 明 らかにするため 観 察 にはすべての 実 験 区 の 仔 稚 魚 を 用 いた 雌 雄 の 判 別 には, 生 殖 腺 内 に 形 成 される 卵 巣 腔 と 精 小 嚢,および 卵 母 細 胞 と 精 原 細 胞 の 有 無 を 用 いた 雌 雄 比 は, 雌 に 対 する 雄 の 割 合 で 表 した 生 殖 腺 体 指 数 (GSI)の 算 出 生 殖 腺 体 指 数 (GSI)は 以 下 の 式 により 算 出 した GSI=( 生 殖 腺 重 量 / 体 重 ) 100 統 計 処 理 性 比 の 偏 りおよび 生 残 率 の 有 意 差 はχ 2 検 定 により 行 った 全 長 および GSI の 有 意 差 は 一 元 配 置 の ANOVA の 後,Tukey-Kramer 法 による 多 重 比 較 により 求 めた 結 果 水 温 の 実 測 値 各 試 験 における 水 槽 の 水 温 変 化 を Fig. 9 に 示 す 試 験 1 の 自 然 水 温 は 試 験 開 始 時 に 14.0 であったが,122 日 齢 には 20,142 日 齢 には 23 に 達 し, 試 験 終 了 時 には 25.6 に 達 した( 対 照 区 ) 20 および 23 区 の 加 温 は 自 然 水 温 30

34 31

35 が 加 温 区 の 設 定 水 温 と 同 等 になった 時 点 で 終 了 した 20 区 における 設 定 水 温 到 達 後 の 平 均 水 温 は 19.9±0.18,23 区 におけるそれは 22.9±1.06,26 区 では 26.4±0.27,28 区 では 28.8±0.05 であった 試 験 2 の 自 然 水 温 は 試 験 開 始 時 に 15.9 であり, 試 験 終 了 時 には 26.3 であった( 対 照 区 ) 26 区 の 加 温 は 192 日 齢 には 26 を 超 えたため 終 了 した 28 区 は 140 日 齢 までにほと んどの 個 体 がへい 死 したことから,140 日 齢 で 飼 育 を 中 止 した 26 区 におけ る 設 定 水 温 到 達 後 の 平 均 水 温 は 25.9±0.24, 28 区 におけるそれは 27.8±0.20 であった 試 験 3 の 自 然 水 温 は 試 験 開 始 時 に 15.7 であったが,141 日 齢 において 23.0 に 達 し, 試 験 終 了 時 には 27.8 となった( 対 照 区 ) 23 区 の 加 温 は, 自 然 水 温 が 加 温 区 の 設 定 水 温 と 同 等 となった 時 点 で 終 了 した 23 区 における 設 定 水 温 到 達 後 の 平 均 水 温 は,23.0±0.62 であった 試 験 4 の 対 照 区 における 自 然 水 温 は 試 験 開 始 時 に 16.2, 試 験 終 了 時 に 24.8 であった 28 -a 区 および 28 -b 区 は,それぞれ 130 日 齢 および 146 日 齢 に 28 での 飼 育 を 終 了 し, 徐 々に 水 温 を 低 下 させた 後,138 日 齢 および 150 日 齢 に 自 然 水 温 に 戻 した 28 -a 区 における 設 定 水 温 到 達 後 の 平 均 水 温 は 28.4±0.92,28-b 区 に おけるそれは 28.7±0.83 であった 生 残 および 成 長 試 験 1 における 10,20 および 対 照 区 の 試 験 終 了 時 の 生 残 率 は,それぞれ 26.5,24.1 および 34.8%であり, 対 照 区 のそれが 最 も 高 くなった (χ 2 -test, P<0.05) (Table 2) 10 および 20 区 間 を 除 く 各 区 の 生 残 率 には 有 意 差 が 認 められた (P<0.05) 加 温 した 試 験 区 のうち,23,26 および 28 区 では 50 日 齢 までに 大 量 減 耗 し, 生 残 率 が 著 しく 低 下 した 特 に,28 区 では 20 日 齢 ま でに 全 ての 仔 魚 がへい 死 し,26 区 では 40 日 齢 までに 生 残 率 が 0.5%となった 32

36 33

37 Fig. 10. Changes in mean total length of spotted halibut Verasper variegatus during the experiments. Vertical bars show the standard errors. Different letters show significantly different mean values (P<0.05). 34

38 ことから 飼 育 を 中 止 した 試 験 終 了 まで 飼 育 できた 23 区 の 生 残 率 は 2.5%で あった この 試 験 における 仔 稚 魚 の 全 長 は, 対 照 区 および 20 区 で 35.4±5.2 mm お よび 37.7±3.0 mm であったのに 対 し,23 区 ではそれより 劣 り (P<0.05),10 区 では 最 も 成 長 が 停 滞 した(Fig. 10-A) 試 験 2 における 26 および 28 区 の 生 残 率 は,それぞれ 16.2%および 0.4% となり, 対 照 区 の 30.7%より 低 い 値 を 示 した (P<0.05) また, 成 長 は 対 照 区 お よび 26 区 と 比 較 して 28 区 が 遅 く (P<0.05), 試 験 終 了 時 の 平 均 全 長 は 対 照 区,26 区,28 区 の 順 に 小 さくなった(Fig. 10-B) 試 験 3 における 対 照 区 および 23 区 の 生 残 率 は,それぞれ 92.1%および 85.9%と 高 かったが,23 区 の 値 は 対 照 区 のそれより 低 かった (P<0.05) 23 区 および 対 照 区 の 全 長 はほぼ 同 じ 値 を 示 し, 試 験 1 のように 23 区 と 対 照 区 の 成 長 差 はみられなかった(Fig. 10-C) 試 験 4 における 対 照 区 および 130 日 齢 まで 加 温 を 継 続 した 28 -a 区 の 生 残 率 は 62.0%および 55.7%となり,ほぼ 同 じであったが,146 日 齢 まで 加 温 を 継 続 した 28 -b 区 では 生 残 率 が 28.3%と 低 くなった (P<0.05) 平 均 全 長 は 対 照 区 と 比 較 して,28 -a 区 および 28 -b 区 のいずれにおいても 加 温 期 間 中 には 小 さ かったが (P<0.05), 加 温 終 了 後 には 対 照 区 とほぼ 同 じ 全 長 を 示 した(Fig. 10-D) 性 分 化 各 試 験 区 の 100 日 齢 の 個 体 の 生 殖 腺 を 観 察 したところ,10 区 ( 全 長 21 mm, ステージ I)のそれは 未 分 化 の 状 態 であった 20 区 ( 全 長 38 mm,ステージ I)の 生 殖 腺 は 卵 巣 腔 および 卵 母 細 胞 が 発 達 し, 雌 への 分 化 が 認 められた 23 区 ( 全 長 28 mm,ステージ I)の 生 殖 腺 には, 卵 巣 腔 および 染 色 仁 期 の 卵 母 細 35

39 胞 が 認 められた 26 区 ( 全 長 39 mm,ステージ I)の 生 殖 腺 に 卵 巣 腔 が 観 察 され, 雌 への 性 分 化 が 認 められたが, 卵 母 細 胞 は 染 色 仁 期 であった 28 区 ( 全 長 23 mm,ステージ H~I)の 生 殖 腺 は 未 分 化 であった 28 区 では 全 長 25 mm (140 日 齢 )でも 性 分 化 は 始 まっておらず, 生 殖 腺 には 生 殖 原 細 胞 が 数 個 観 察 さ れるにとどまった 性 比 試 験 1 では 23 区 において 雄 / 雌 比 は 2.28 であり, 雄 への 偏 りがみられたが (χ 2 -test,p<0.05),10,20 および 対 照 区 の 性 比 は 1:1( 雄 / 雌 比 0.94~1.04) であった(Table 3) 26 区 および 28 区 は 生 残 率 が 低 く, 途 中 で 飼 育 を 中 止 したため, 性 比 の 算 出 に 至 らなかった 試 験 2 では 26 区 において 雄 が 雌 より も 多 かったが( 雄 / 雌 比 1.33), 有 意 差 は 認 められなかった 28 区 では 生 残 尾 数 が 少 なく, 性 比 の 算 出 には 至 らなかった 試 験 3 では 23 区 および 対 照 区 の 性 比 は 1:1 であった 試 験 4 では 131 日 齢 まで 28 で 飼 育 した 後, 自 然 水 温 に した 28 -a 区 と 対 照 区 の 性 比 は 1:1 であったが,146 日 齢 まで 28 で 飼 育 した 28 -b 区 は 雄 への 偏 りが 認 められた (P<0.05) GSI 試 験 4 の 実 験 終 了 時 に 全 供 試 魚 から 生 殖 腺 を 摘 出 し,GSI を 算 出 した (Fig. 11) 雌 の GSI は 28 -a 区 および 28 -b 区 が 対 照 区 と 比 較 して 小 さく (P<0.01), 28 -b 区 は 28 -a 区 と 比 較 しても 小 さかった (P<0.01) GSI は 対 照 区,28 -a 区,28 -b 区 の 順 に 小 さくなり, 加 温 期 間 が 長 くなるに 従 い GSI も 小 さくな った 雄 の GSI は 28 -a 区 および 28 -b 区 が 対 照 区 と 比 較 して 小 さく (P<0.05), 28 -a 区 と 28 -b 区 の 間 では 有 意 差 は 認 められなかった 36

40 Table 3. Sex ratio of spotted halibut in each experiment Exp. Water temperature ( ) Beginning of experiment (DAH) Female Male Total Sex ratio (Male/Female) Control * Control Control Control a * b * * Control fish was reared natural water temperature. Asterisks show significant difference from theoretical 1:1 sex ratio (P<0.05). *1, The group started heating-up to 28 at 95 DAH and kept 28 until 131 DAH; *2, The group started heating-up to 28 at 95 DAH and kept 28 until 146 DAH. 37

41 Fig. 11. Gonadosomatic index (GSI) of female and male in experiment 4. Vertical bars show the standard errors. Different letters show significantly different mean values (P<0.05). 38

42 考 察 試 験 1 においてホシガレイを 23,26 および 28 で 飼 育 したところ,これら の 試 験 区 における 50 日 齢 までの 生 残 率 は 対 照 区 ( 水 温 12.4~16.4 )のそれと 比 較 して 低 い 結 果 となった これは,23 以 上 の 高 水 温 が 本 種 仔 魚 の 生 残 に 悪 影 響 を 与 えていることを 示 している これまでにも,ホシガレイ 仔 稚 魚 の 生 残 率 は 12~21 の 範 囲 において 水 温 が 低 いほど 高 い 傾 向 を 示 すが( 佐 久 間 2001), 27 では 生 残 率 が 低 下 することが 報 告 されている( 村 田 1998) 九 州 西 岸 にお いて 本 種 の 天 然 仔 魚 が 採 集 された 際 の 海 水 温 は 11.1~15.7 である( 乃 一 ら 2006;Wada et al. 2006,2012)ことから,23 以 上 の 水 温 はホシガレイ 仔 魚 の 好 適 水 温 から 大 きく 外 れており,それが 生 残 率 を 低 下 させる 原 因 であると 推 察 される このような 高 水 温 による 生 残 率 の 低 下 は, 同 じ 異 体 類 のヒラメ 仔 魚 でも 報 告 されており,10~22 日 齢 のヒラメ 仔 魚 は 20~24 において 高 い 生 残 率 を 示 すが,26 以 上 になると 生 残 率 が 低 下 し,27 が 半 数 致 死 温 度 であると される( 嶋 田 ら 2006) 日 本 沿 岸 の 天 然 海 域 においてヒラメ 仔 稚 魚 が 確 認 され た 場 所 の 水 温 は 12~25 であることから( 下 茂 ら 2000), 26 以 上 の 水 温 はヒ ラメの 好 適 水 温 より 高 いと 考 えられる このように 本 種 で 確 認 された 高 水 温 に よる 生 残 率 低 下 は,ヒラメ 仔 魚 でも 観 察 される 現 象 であるが, 本 種 の 生 残 にお ける 適 正 水 温 の 上 限 はヒラメのそれよりもやや 低 いと 考 えられる 本 研 究 で 実 施 した 26 および 28 飼 育 において,4 日 齢 から 加 温 した 試 験 1 では 仔 魚 が 大 きく 減 耗 し,40 日 齢 までに 飼 育 を 中 止 したが,40 日 齢 以 降 に 加 温 した 試 験 2 では 対 照 区 と 比 較 して 生 残 率 が 低 くなったものの 試 験 終 了 まで 生 残 した これは 仔 魚 の 高 水 温 耐 性 が 40 日 齢 以 降 に 向 上 していることを 示 唆 してい る 有 瀧 ら(2001)による 仔 魚 の 発 育 ステージの 分 類 では,30 日 齢 には 上 屈 前 39

43 仔 魚 期 および 上 屈 仔 魚 期 であるステージ D および E,40 日 齢 には 眼 の 移 動 が 開 始 したステージ G および 有 眼 側 にほぼ 移 動 を 終 えたステージ H に 達 していた ステージ G は 底 棲 生 活 への 移 行 期 で, 着 底 生 活 に 必 要 な 機 能 はほぼ 完 成 してい ることから( 有 瀧 ら 2001), 高 水 温 耐 性 の 向 上 はこのような 生 活 様 式 の 変 化 と 深 く 関 わっている 可 能 性 が 高 い また 本 研 究 において, 稚 魚 への 変 態 完 了 後 の 95 日 齢 以 降 に 28 へ 加 温 した 試 験 4 の 生 残 率 は, 上 述 した 4 日 齢 および 40 か ら 28 へ 加 温 した 試 験 1 および 試 験 2 の 結 果 よりも 高 くなった これは, 仔 稚 魚 の 高 温 耐 性 が 変 態 後 の 成 長 に 伴 い, 上 昇 することを 示 唆 している 変 態 時 の 異 体 類 の 仔 魚 では, 急 激 な 生 理 学 的 形 態 学 的 変 化 が 引 き 起 こされるが( 堀 田 ら 2001),このような 時 期 は 外 部 環 境 の 変 動 に 敏 感 である 可 能 性 が 高 い マガ レイ Pleuronectes herzensteini では 生 息 水 温 が 0~23 とされるものの, 仔 魚 飼 育 においては 水 温 21 以 上 では 安 定 した 飼 育 が 行 えないことから,この 水 温 はマガレイ 仔 魚 にとっての 適 水 温 から 外 れていると 述 べられており( 有 瀧 1996), 本 種 やマガレイの 着 底 前 の 変 態 期 仔 魚 にとって 高 水 温 は 生 残 に 対 する 負 の 要 因 として 作 用 すると 考 えられる 本 研 究 におけるホシガレイ 仔 魚 の 成 長 は, 自 然 水 温 で 飼 育 した 対 照 区 と 比 較 して 20 では 促 進 されるものの,それ 以 外 の 試 験 区 では 同 等 もしくは 劣 ってお り, 特 に 10 および 28 では 成 長 が 著 しく 停 滞 した ホシガレイ 仔 魚 の 成 長 は, 水 温 9~21 の 範 囲 において 水 温 が 高 いほど 促 進 される( 有 瀧 ら 2004) また, 稚 魚 の 飼 育 適 水 温 は 18~24 であり, 最 適 飼 育 水 温 は 21 付 近 にあるとされて いる( 村 田 ら 1998) これらの 報 告 と 本 研 究 の 結 果 はよく 一 致 しており,ホシ ガレイの 仔 稚 魚 の 成 長 促 進 を 目 的 とした 飼 育 水 の 加 温 は,20~21 が 良 いと 考 えられる ホシガレイの 理 論 上 の 性 比 は 雌 雄 1:1 であり(Ji et al. 2010), 本 研 究 におい 40

44 ても,10~20 による 飼 育 試 験 では 1:1 の 性 比 が 得 られた しかし,ヒラメ 科 およびカレイ 科 魚 類 では 性 的 未 分 化 期 に 高 水 温 で 飼 育 すると 性 比 が 偏 ることが 知 られている 例 えば,ヒラメでは 40 日 齢 から 飼 育 水 温 を 25.0~27.5 として 飼 育 すると 性 比 が 雄 に 偏 り,27.5 では 全 ての 個 体 が 雄 になる( 山 本 1992) ま たマツカワでは,32~79 日 齢 ( 全 長 10.1~29.7 mm)の 個 体 を 14 から 18 に 昇 温 して 飼 育 を 続 けると 性 比 が 雄 に 偏 り,10.1 mm から 昇 温 した 個 体 では 全 てが 雄 となる(Goto et al. 1999) 本 実 験 ではヒラメ 科 およびカレイ 科 魚 類 の 特 徴 として 考 えられる 性 的 未 分 化 期 の 性 決 定 に 関 するゆらぎの 大 きさに 注 目 し, 高 水 温 飼 育 を 行 うことよって 雄 化 の 誘 導 を 試 みた その 結 果,4 日 齢 から 23 で 飼 育 した 個 体 のうち 69.5%が,また 95 日 齢 から 28 で 飼 育 した 個 体 のうち 62.7%がそれぞれ 雄 となったことから, 他 のヒラメ 科 およびカレイ 科 魚 類 と 同 様 にホシガレイの 性 分 化 には 水 温 が 影 響 することが 明 らかとなった これは, 23 よりも 高 水 温 で 本 種 仔 魚 を 飼 育 すれば, 完 全 に 雄 化 が 誘 導 される 可 能 性 を 示 している しかし, 本 実 験 で 実 施 した 高 水 温 飼 育 では 生 残 率 が 大 幅 に 低 下 し, ヒラメおよびマツカワのように,すべての 種 苗 の 雄 化 誘 導 には 至 らなかった 本 研 究 で 用 いた 23~28 の 飼 育 に 限 らず, 本 種 の 仔 魚 は 21 の 飼 育 でも 生 残 率 が 低 下 するという( 有 瀧 ら 2004) これは, 同 じ 異 体 類 であっても, 性 分 化 に 影 響 を 与 える 水 温 域 と 生 存 に 影 響 を 与 える 水 温 域 とが 大 きく 異 なることを 示 唆 している さらに 興 味 深 いことに, 試 験 2 で 実 施 した 40 日 齢 からの 28 飼 育 群 の 140 日 齢 の 稚 魚 において, 生 殖 腺 内 に 始 原 生 殖 細 胞 のみが 存 在 する 性 的 未 分 化 個 体 のみが 観 察 された このように,28 処 理 は 雄 化 を 誘 導 する 可 能 性 を 持 つものの, 長 期 に 亘 る 高 温 処 理 は 成 長 および 生 残 だけでなく 生 殖 腺 の 発 達 そ のものを 強 く 阻 害 することを 示 唆 している マツカワを 用 いた 温 度 処 理 による 雄 化 誘 導 試 験 では, 性 分 化 に 影 響 を 及 ぼす 41

45 温 度 感 受 性 の 獲 得 と 消 失 が 論 じられており, 全 長 約 10 mm(32 日 齢 )から 温 度 感 受 性 が 発 現 した 後, 成 長 に 従 い 感 受 性 が 低 くなり, 全 長 約 41 mm(95 日 齢 ) では 昇 温 飼 育 しても 性 比 は 1:1 と 変 わらないことから,この 時 期 に 温 度 感 受 性 は 消 失 すると 考 えられる(Goto et al. 1999; 萱 場 2005) 本 研 究 では, 全 長 6 mm (4 日 齢,B ステージ)の 仔 魚 を 23 で 飼 育 すると 雄 化 が 誘 導 されたことから, 変 態 前 の 仔 魚 において 性 分 化 に 影 響 を 与 える 温 度 感 受 性 が 備 わっていることが 判 った また, 全 長 35 mm(95 日 齢,I ステージ)のホシガレイ 稚 魚 を 28 で 全 長 70 mm(150 日 齢 )まで 飼 育 したところ 性 比 が 雄 へ 偏 った( 雄 / 雌 比 1.68) ことから, 少 なくとも 全 長 70 mm まで 温 度 感 受 性 が 残 っていると 考 えられる 雄 化 を 誘 導 する 温 度 に 対 する 反 応 性 は,マツカワでは 14 から 18 への 4 の 昇 温 飼 育 で 雄 化 することから 比 較 的 高 い 一 方,ホシガレイでは 15 から 約 5 の 昇 温 飼 育 では 雄 化 せず,8~13 の 昇 温 でようやく 性 比 の 雄 への 偏 りがみられ たことから,マツカワと 比 べ 雄 化 を 誘 導 する 温 度 に 対 する 反 応 性 が 低 いと 考 え られる このように, 同 属 のマツカワとホシガレイでも 温 度 感 受 性 や 反 応 性 に 違 いがあることが 判 った 本 研 究 の 結 果 は, 本 種 が 水 温 操 作 によって 性 転 換 を 誘 導 できる 魚 種 ではある ものの, 他 の 異 体 類 と 比 較 すると, 人 為 的 な 雄 への 性 転 換 は 容 易 ではない 魚 種 であることを 示 している それは 本 種 の 性 決 定 のゆらぎがヒラメやマツカワな どよりも 少 ないことに 起 因 するのかも 知 れない このような, 性 決 定 に 及 ぼす 遺 伝 的 支 配 の 強 さや 環 境 影 響 の 感 受 性 などを 今 後 明 らかにする 必 要 がある 42

46 第 3 節 メチルテストステロン 投 与 による 性 転 換 これまで 述 べてきたとおり, 全 雌 種 苗 生 産 には 遺 伝 的 雌 を 雄 化 し 偽 雄 を 作 出 することが 重 要 である ヒラメやマツカワ 等 の 異 体 類 が 持 つ 水 温 依 存 性 の 性 決 定 を 利 用 した 雄 化 は 本 種 においても 可 能 であったが, 高 水 温 による 仔 稚 魚 の 飼 育 は 生 残 にも 悪 影 響 を 及 ぼしたことから, 効 率 的 に 雄 へ 誘 導 することができな かった 全 雌 種 苗 の 生 産 においては, 大 量 の 雌 種 苗 を 同 時 に 得 られることから, 遺 伝 的 雌 を 雄 化 した 偽 雄 の 精 子 を 用 いた 種 苗 生 産 が 実 用 性 の 高 い 技 術 と 考 えられて いる 偽 雄 の 作 出 には, 水 温 調 節 または 雄 性 ホルモン 投 与 等 によって 遺 伝 的 雌 を 人 為 的 に 雄 化 することが 必 要 である 性 ホルモンによる 魚 類 の 性 転 換 ( 性 分 化 誘 導 )は 古 くから 試 みられており( 隆 島 会 田 1984), 同 属 のヒラメではメ チルテストステロン( 以 下,MT) 投 与 により 雄 化 した 偽 雄 を 用 いた 全 雌 種 苗 生 産 が 実 証 されている( 山 本 1992) 本 種 においても,MT 処 理 により 作 出 した 偽 雄 の 精 子 を 用 いて 全 雌 種 苗 生 産 が 可 能 と 考 えられる しかし,MT を 用 いた 雄 へ の 誘 導 においては,その 投 与 量 によっては 正 常 に 雄 化 されないことや, 過 剰 投 与 すると 逆 に 雌 化 が 促 されたり(Nakamura 1975;Tabata 1991; 山 本 1992; 藤 岡 1993; 山 本 1995), 生 残 率 が 低 下 すること( 安 藤 ら 2008)が 知 られている 従 って,MT 処 理 を 本 種 の 雄 化 誘 導 に 利 用 する 場 合 には,その 投 与 量 を 十 分 に 検 討 する 必 要 がある そこで 本 研 究 では, 異 なる 量 の MT をホシガレイ 仔 稚 魚 へ 経 口 投 与 し, 生 残 および 性 分 化 に 及 ぼす MT の 影 響 を 調 べた また, 併 せて 投 与 する 期 間 の 検 討 も 行 った 43

47 材 料 および 方 法 供 試 魚 平 成 20~23 年 の 1~2 月 に 長 崎 県 橘 湾 で 漁 獲 された 天 然 親 魚 からヒト 絨 毛 性 生 殖 腺 刺 激 ホルモン(HCG)を 用 いて 採 卵 し, 人 工 授 精 により 得 られた 仔 稚 魚 を 後 述 する 条 件 で 飼 育 して 供 試 魚 に 用 いた 仔 魚 には,シオミズツボワムシ L 型 Brachionus plicatilis を 5~50 日 齢,アルテミア Artemia sp.の 幼 生 を 37~ 50 日 齢, 配 合 飼 料 (ラブラァバ, 林 兼 産 業 )を 30 日 齢 から 給 餌 し,50 日 齢 以 降 は 配 合 飼 料 のみを 与 えた シオミズツボワムシとアルテミアは, 栄 養 強 化 剤 (バイオクロミスリキッド,クロレラ 工 業 )により 栄 養 強 化 した シオミズツ ボワムシの 給 餌 期 間 中 はナンノクロロプシス Nannochloropsis oculata を 50 cells/ml になるよう 飼 育 水 に 添 加 した 試 験 方 法 MT 投 与 濃 度 の 検 討 を 試 験 1 および 2 において, 効 果 的 投 与 期 間 の 検 討 を 試 験 3 および 4 においてそれぞれ 実 施 した MT 投 与 試 験 区 の 配 合 飼 料 には,MT (メチルテストステロン, 和 光 純 薬 工 業 )を 溶 かした 99.5%エチルアルコール を 均 一 に 添 加 した 後,アルコールを 除 去 するため 十 分 に 乾 燥 させた 対 照 区 の 配 合 飼 料 には, 試 験 区 と 同 量 の 99.5%エチルアルコールのみを 添 加 し, 同 様 の 処 理 を 行 った これを 毎 日,6~8 回 飽 食 給 餌 した MT 添 加 濃 度, 投 与 期 間 を 含 む 飼 育 条 件 を Table 4 に 示 す 各 試 験 における MT の 投 与 開 始 時 の 仔 魚 の 発 育 段 階 は, 有 瀧 ら(2001)の 分 類 でステージ G であった 試 験 1 では,MT を 0.1, 1,10 μg/g diet で 添 加 した 区 および 無 添 加 ( 対 照 区 ) 区 の 計 4 区 を 設 けた 35 日 齢 の 仔 魚 を 500 尾 ずつ 0.5 kl 水 槽 へ 収 容 し,40~300 日 齢 の 期 間,MT 添 44

48 加 飼 料 を 給 餌 した その 後, 一 部 の 稚 魚 は MT 無 添 加 飼 料 を 用 いて 満 2 歳 まで 継 続 飼 育 した 試 験 2 では,MT を 0.001,0.01,0.1 μg/g diet で 添 加 した 区 および 無 添 加 区 の 計 4 区 を 設 けた 7 日 齢 の 仔 魚 を 5,000 尾 ずつ 0.5 kl 水 槽 へ 収 容 し,40~240 日 齢 の 期 間,MT 添 加 飼 料 を 給 餌 した その 後, 一 部 の 稚 魚 は MT 無 添 加 飼 料 を 用 いて 満 2 歳 まで 継 続 飼 育 した 試 験 3 では,MT を 0.5 μ g/g diet で 添 加 した 飼 料 を 46~110,130,170 および 300 日 齢 の 期 間 に 給 餌 し た 区 および 無 添 加 区 の 計 5 区 を 設 けた 40 日 齢 の 仔 魚 を 1,000 尾 ずつ 0.5 kl 水 槽 へ 収 容 し,MT 添 加 飼 料 を 上 記 の 期 間 給 餌 した その 後, 無 添 加 の 飼 料 を 給 餌 し 継 続 飼 育 した 試 験 4 では,MT を 0.5 μg/g diet で 添 加 した 飼 料 を 42~130, 140,150,160,170,180,190 および 200 日 齢 の 期 間 に 給 餌 した 区 および 無 添 加 区 の 計 9 区 を 設 けた 37 日 齢 の 仔 魚 を 500 尾 ずつ 0.5 kl 水 槽 へ 収 容 し, MT 添 加 飼 料 を 上 記 の 期 間 給 餌 した その 後, 無 添 加 の 飼 料 を 給 餌 し 継 続 飼 育 し た 生 残 率 の 算 出 実 験 1 では,MT 処 理 終 了 時 の 300 日 齢 において, 実 験 2 では,MT 処 理 終 了 時 の 240 日 齢 において, 実 験 3 および 4 では,それぞれ 試 験 終 了 時 の 300 お よび 200 日 齢 において, 生 残 率 を 求 めた 生 残 率 は 以 下 の 式 により 算 出 した 生 残 率 (%) = ( 生 残 個 体 数 / 収 容 個 体 数 )

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50 生 殖 腺 の 組 織 学 的 観 察 および 雌 雄 比 の 調 査 各 試 験 区 の 供 試 魚 を 定 期 的 にサンプリングし, 生 殖 腺 発 達 を 組 織 学 的 に 観 察 した 生 殖 腺 の 採 取 にあたり, 仔 稚 魚 の 生 殖 腺 のみを 摘 出 するのは 困 難 である ことから, 個 体 全 体 をブアン 氏 液 で 固 定 し,その 後 70%エタノールで 保 存 した 固 定 した 仔 稚 魚 の 生 殖 腺 のある 部 位 を 体 ごとパラフィンに 包 埋 し, 切 片 とした パラフィンへの 包 埋, 切 片 の 作 成 は 常 法 に 従 った また, 切 片 は 5 μm とし, ヘマトキシリン エオシンの 二 重 染 色 を 施 し, 光 学 顕 微 鏡 下 で 観 察 した 雌 雄 の 判 別 は, 生 殖 腺 の 外 部 形 態 および 生 殖 腺 内 に 形 成 される 卵 巣 腔 と 精 小 嚢,お よび 卵 母 細 胞 と 精 原 細 胞 の 有 無 を 指 標 として 行 い, 生 殖 腺 内 に 卵 巣 および 精 巣 の 組 織 がみられた 個 体 は 間 性 とした 生 殖 腺 体 指 数 (GSI)の 算 出 試 験 1 および 2 の 個 体 を MT 投 与 が 終 了 した 後 もさらに 継 続 飼 育 し, 生 殖 腺 の 摘 出 が 可 能 となった 個 体 を 用 いて, 生 殖 腺 体 指 数 (GSI)を 以 下 の 式 により 算 出 した GSI=( 生 殖 腺 重 量 / 体 重 ) 100 統 計 処 理 性 比 の 偏 りおよび 生 残 率 の 有 意 差 はχ 2 検 定 により 行 った 全 長 および GSI の 有 意 差 は 一 元 配 置 の ANOVA の 後,Tukey-Kramer 法 の 多 重 比 較 検 定 により 行 った 47

51 結 果 成 長 および 生 残 試 験 1 における 生 残 率 は, 対 照 区,MT 0.1,1 および 10 μg 区 ではそれぞれ 57.0%,58.6%,61.0%および 51.6%となり,MT 10 μg 区 のそれは 対 照 区 と 比 べて 有 意 に 低 かった (P<0.05) (Table 5) この 試 験 終 了 時 における 全 長 は, 対 照 区 では 154.9±11.2 mm,mt 0.1 μg 区 では 145.3±10.4 mm,mt 1 μg 区 では 136.1±9.7 mm および MT 10 μg 区 では 132.0±10.9 mm となり,MT 1 および 10 μg 区 は 対 照 区 および MT 0.1 μg 区 より 有 意 に 小 さかった (P<0.05) (Fig. 12-A) 試 験 2 における 生 残 率 は, 対 照 区,MT 0.001,0.01 および 0.1 μg 区 ではそ れぞれ 88.2%,85.0%,79.8%および 86.5%となり,MT 0.01 μg 区 は 対 照 区 よ り 有 意 に 低 かった (P<0.05) (Table 6) 200 日 齢 における 各 区 の 全 長 は, 対 照 区 では 88.1±5.5 mm,mt μg 区 では 72.0±4.6 mm,mt 0.01 μg 区 で は 61.8±5.7 mm,mt 0.1 μg 区 では 76.7±5.6 mm となり,MT 投 与 区 は 対 照 区 よりも 全 長 が 有 意 に 小 さかった (P<0.05) (Fig. 12-B) 試 験 3 における 生 残 率 は, 対 照 区,MT 0.5 μg/g diet 投 与 終 了 110 日,130 日,170 日,300 日 区 では,それぞれ 80.2%,90.5%,91.6%,91.8%および 93.3% となり, 対 照 区 のそれが MT 区 に 比 べて 有 意 に 低 かった (P<0.05) (Table 7) MT 投 与 を 終 了 した 際 の 各 区 の 全 長 は,110 日 齢 では 48.3±13.0 mm,130 日 齢 では 72.2±5.9 mm,170 日 齢 では 98.1±9.7 mm,300 日 齢 では 148.0±15.4 mm であった 300 日 齢 における 各 区 の 全 長 は, 対 照 区 では 175.7±1.73,MT 投 与 終 了 110 日 区 では 160.2±15.8 mm,130 日 区 では 161.6±18.3 mm,170 日 区 では 154.3±18.6 mm,300 日 区 では 147.8±15.4 mm となり,MT 投 与 区 は 対 48

52 照 区 と 比 較 して 有 意 に 小 さかった (P<0.05) (Fig. 12-C) 試 験 4 における 生 残 率 は 47.0~75.4%の 範 囲 で,130 日 齢 まで MT 投 与 した 130 日 区 が 最 も 低 くなり,180 日 区 が 最 も 高 かった (P<0.05) (Table 8) MT 投 与 期 間 と 生 残 率 の 間 に 相 関 は 認 められなかった 200 日 齢 における 平 均 全 長 は, 113.2~127.6 mm の 範 囲 であった MT 投 与 期 間 と 全 長 との 間 には 相 関 は 認 めら れなかった (Fig. 12-D) MT 投 与 による 生 殖 腺 の 変 化 本 試 験 では, 正 常 に 分 化 した 卵 巣 (Fig. 13-A), 卵 巣 と 精 巣 の 組 織 が 混 在 する 間 性 生 殖 腺 (Fig. 13. B-D), 正 常 に 分 化 した 精 巣 (Fig. 13-E)が 観 察 された 試 験 4 においては, 間 性 生 殖 腺 をさらに 詳 細 に 観 察 したところ, 以 下 の 3 つに 分 類 された ⅰ) 卵 巣 腔 が 形 成 されているものの, 卵 巣 と 精 巣 の 組 織 が 混 在 する 生 殖 腺 (Fig. 13-B),ⅱ) 卵 巣 腔 の 形 成 が 認 められず, 卵 巣 と 精 巣 の 組 織 が 混 在 する 生 殖 腺 (Fig. 13-C),ⅲ) 精 巣 細 胞 に 少 数 の 周 辺 仁 期 の 卵 母 細 胞 が 散 在 する 生 殖 腺 (Fig. 13-D) 性 比 試 験 1 における 300 日 齢 の 結 果 を Table 5 に 示 す MT 0.1 μg および 1 μg 区 では 雄 が 76.2%および 79.2% 出 現 し, 雄 の 割 合 が 有 意 に 高 かった (P<0.01) また, 間 性 個 体 もそれぞれ 7.4%および 2.6% 出 現 した しかし,10 μg 区 では 間 性 個 体 3.9%を 除 いた 雌 雄 比 はほぼ 1:1 であり, 対 照 区 との 間 に 有 意 な 差 は 認 められなかった 試 験 2 の 結 果 を Table 6 に 示 す 各 区 の 性 比 に 偏 りは 認 められ なかった また,この 試 験 において 間 性 個 体 は 出 現 しなかった 試 験 3 の 結 果 を Table 7 に 示 す MT 0.5 μg/g diet を 110 日 齢 まで 投 与 した 区 および 対 照 区 49

53 の 雌 雄 比 はほぼ 1:1 であった 130,170 および 300 日 齢 まで MT を 投 与 した 区 では, 雄 の 割 合 がそれぞれ 67.0%,74.3%および 94.0%となり, 雄 への 性 比 の 偏 りが 認 められた (P<0.05) 試 験 4 の 結 果 を Table 8 に 示 す MT を 投 与 した 全 ての 区 で, 雄 への 性 比 の 偏 りが 認 められた (P<0.05) MT 0.5 μg/g diet を 130~150 日 齢 まで 投 与 した 区 では 雄 が 55.4~78.7% 出 現 した 雌 もわずかに 存 在 したが,その 他 はⅰ~ⅲ 段 階 の 間 性 個 体 であった (Fig. 13-B, C, D) 160~200 日 齢 まで MT を 投 与 した 区 では 雌 が 出 現 せず, 雄 性 生 殖 細 胞 で 占 められる 雄 個 体 と 間 性 個 体 のみとなった 特 に 180 日 齢 以 上 まで MT 投 与 した 区 では, 出 現 した 間 性 個 体 はⅲ 段 階 の 生 殖 腺 のみであった GSI 試 験 1 および 2 の 供 試 魚 を 継 続 飼 育 し, 生 殖 腺 を 摘 出 して GSI を 算 出 した (Fig. 14) 試 験 1 において,MT 投 与 区 の 雌 の GSI は 対 照 区 と 比 較 して 小 さか った (P<0.05) 雄 の GSI には 各 区 間 で 有 意 差 はなかった また,MT 投 与 区 に おいて 間 性 個 体 が 2.6~7.4%みられたが, 間 性 個 体 および 雄 の GSI はほぼ 同 じ 値 であり, 有 意 差 は 認 められなかった 試 験 2 において,MT μg および 0.01 μg 区 の 雌 の GSI に 有 意 差 は 認 められなかった MT 0.1 μg 区 の 雌 の GSI は, 他 の 試 験 区 より 有 意 に 小 さかっ た (P<0.05) 50

54 51

55 52

56 53

57 54

58 Fig. 12. Changes in mean total length of spotted halibut during the experiments. Vertical bars show the standard errors. Different letters show significantly different mean values (P<0.05). 55

59 Fig. 13. Cross sections of gonad in spotted halibut Verasper variegatus. A, ovary at 200 days after hatching (DAH). B, intersex gonad including ovarian and testicular tissues. Ovarian cavity was formed. C, intersex gonad including ovarian and testicular tissues. Ovarian cavity was not formed. D, intersex gonad including a small number of oocytes in testicular tissue. E, testis at 200 DAH. Oc, ovarian cavity. Oo, oocyte. Bars=100 μm. 56

60 Fig. 14. Gonadosomatic index (GSI) in experiment 1 and 2. Vertical bars show the standard errors. Different letters show significantly different mean values (P<0.05)., female;, male;, intersex. 57

61 考 察 本 研 究 において, 雄 化 誘 導 に 有 効 な MT の 処 理 濃 度 を 検 討 した その 結 果, 実 験 2 において MT 0.001~0.1 μg/g diet 投 与 した 稚 魚 の 性 比 には 偏 りはみられ ず, 対 照 区 と 同 じであったことから,この 濃 度 範 囲 は 雄 化 に 有 効 でないことが わかった また, 生 殖 腺 の 外 部 形 態 も 対 照 区 のそれと 変 わらず, 雌 では 正 常 に 魚 体 後 方 へ 大 きく 伸 長 していた しかし, 試 験 1 において, 実 験 2 と 同 様 の MT 0.1 μg/g diet 処 理 を 施 したところ, 有 意 な 雄 への 偏 りがみられた 一 方 GSI は, MT μg および 0.01 μg 処 理 では, 対 照 区 と 変 わらなかったのに 対 して, 実 験 1 および 2 のいずれにおいても 0.1 μg 処 理 区 のそれは 有 意 に 減 少 した こ のことから,0.1 μg/g diet は 卵 巣 発 達 を 抑 制 する 効 果 を 持 つものの, 雄 化 誘 導 に 関 しては 効 果 を 及 ぼす 臨 界 値 である 可 能 性 が 考 えられる また,MT 0.1 μg/gdiet 処 理 により 雌 雄 比 が 両 実 験 で 異 なった 原 因 の 一 つとして, 仔 魚 期 における 給 餌 方 法 との 関 連 が 考 えられる 仔 魚 期 に MT を 経 口 投 与 する 場 合,ワムシお よびアルテミアも 併 用 して 給 餌 しており, 仔 稚 魚 の 配 合 飼 料 に 対 する 餌 付 きの 程 度 により 投 与 初 期 の 魚 体 内 への MT 取 り 込 み 量 が 異 なっていた 可 能 性 がある したがって, 実 験 1 における 0.1 μg/g diet の MT 添 加 量 は, 本 種 の 仔 稚 魚 を 性 転 換 させる 必 要 量 に 足 りていなかったのかも 知 れない 本 実 験 では,0.5 および 1 μg/g diet の 処 理 を 実 施 したところ, 実 験 1 では 雄 の 割 合 が 約 80%, 実 験 3 お よび 4 では 90% 以 上 となり, 明 らかな 雄 化 誘 導 効 果 が 観 察 された これらの 結 果 から, 遺 伝 的 雌 を 雄 へ 性 転 換 させるためには,MT 投 与 量 を 0.5 μg/g diet 以 上 とすることが 望 ましいと 思 われる しかし,MT 投 与 量 が 過 剰 な 場 合 には 逆 に 雌 の 割 合 が 高 くなることが 知 られており(Nakamura 1975;Tabata 1991; 山 本 1995; 藤 岡 1993; 山 本 1995),ティラピア Tilapia mossambica では MT 投 58

62 与 期 間 が 長 くなると 雄 化 が 阻 害 され, 間 性 個 体 が 出 現 すること(Nakamura 1975)から,ホシガレイでは MT 10 μg/g diet の 飼 料 の 投 与 は 過 剰 投 与 である と 推 察 される しかし,これまでに 実 施 されたホシガレイの MT 処 理 実 験 の 結 果 は, 本 研 究 の 結 果 と 大 きく 異 なる 八 木 ら(2005)は, 平 均 全 長 25 mm のホ シガレイ 稚 魚 に MT を 0.1,1,10,20 および 50 μg/g diet 添 加 した 配 合 飼 料 を 10 ヶ 月 間 経 口 投 与 したところ,1 μg/g diet 以 上 の 投 与 区 で 雄 の 割 合 が 高 く なり,10 μg/g diet 以 上 では 100%の 個 体 が 雄 になったとしている このように, 本 研 究 の 結 果 より 高 濃 度 の MT 処 理 において 雄 化 が 誘 導 されており,また 阻 害 効 果 も 確 認 されていない この 実 験 では, 投 与 開 始 が 全 長 25 mm( 本 実 験 の 70 日 齢 相 当 )と 遅 いことから, 処 理 魚 の 発 達 段 階 による 反 応 性 の 違 いなどによっ て 過 剰 投 与 にならなかった 可 能 性 がある また, 八 木 ら(2005)は 雌 雄 を 生 殖 腺 の 外 部 形 態 によってのみ 判 別 しているが, 本 研 究 では 生 殖 腺 の 組 織 観 察 で 判 定 したことから,MT 投 与 時 の 雌 雄 判 別 や 異 常 形 態 の 出 現 をより 正 確 に 捉 えるこ とができたと 思 われる 投 与 量 に 対 する 反 応 性 は 魚 種 により 大 きく 異 なる たとえば, 同 じ 異 体 類 で あるヒラメでは, 雌 性 発 生 二 倍 体 魚 へ MT 1 および 10 μg/g diet の 飼 料 を 59~ 103 日 齢 の 期 間 投 与 することにより 98.8%および 100%の 個 体 が 雄 へと 性 転 換 す るが,100 μg/g diet を 同 時 期 に 投 与 すると, 雄 の 比 率 が 15.6%に 低 下 する (Tabata 1991) ホシガレイの MT に 対 する 感 受 性 は, 他 の 魚 種 よりも 高 く, 低 濃 度 でも 雄 化 誘 導 の 引 き 金 が 引 かれるようである また, 試 験 1 および 3 において,MT を 0.1~10 μg/g diet で 300 日 齢 まで 投 与 すると 間 性 個 体 が 観 察 された Nakamura(1975)の 報 告 にあるように, 間 性 は MT の 過 剰 投 与 によっても 出 現 するが, 雌 から 雄 への 性 転 換 過 程 において も 出 現 する 本 実 験 では,10 μg/g diet の MT 処 理 のみでなく,これより 低 濃 59

63 度 の 処 理 でも 出 現 すること,また, 実 験 4 では, 処 理 期 間 が 短 い 群 において 多 く 出 現 し, 処 理 期 間 が 長 くなることによって, 卵 巣 の 組 織 を 持 つ 間 性 個 体 は 出 現 しなくなり,すべてが 精 巣 卵 を 持 つ 間 性 個 体 または 雄 となったことから, 雄 化 の 過 程 において 出 現 したものと 考 えられる 雄 化 誘 導 に 必 要 な MT 処 理 (0.5 μg/g diet)の 期 間 について 調 べたところ, 試 験 3 および 4 の 結 果 から,MT の 投 与 を 42~46 日 齢 に 開 始 し,130 日 齢 まで 継 続 すると 性 比 の 雄 への 偏 りが 始 まり, 期 間 を 延 長 すると 雄 化 が 促 進 される 実 験 4 では,MT を 42~160 日 齢 まで 投 与 することで 雌 が 出 現 しなくなり,180 日 齢 まで 投 与 すると 生 殖 腺 から 卵 巣 の 形 態 が 消 失 し,わずかな 未 熟 な 卵 母 細 胞 が 残 るのみとなり, 雄 化 は 完 了 したものと 思 われる 八 木 ら(2005)によると, 全 長 25 mm の 個 体 に 10 ヶ 月 の MT 処 理 を 施 して 雄 化 を 誘 導 しているが, 全 長 25 mm が 70 日 齢 前 後 と 推 定 されることから,MT 処 理 による 雄 化 誘 導 に 向 けた 生 理 変 化 は,70 日 齢 以 降 に 起 きることが 想 像 される ヒラメでは 性 分 化 期 は 60 ~100 日 齢 といわれており(Kitano et al. 1999),この 期 間 を 通 じて MT 処 理 す ることが 雄 化 には 必 要 であるとされ,59 日 齢 からの 処 理 によって 雄 化 の 誘 導 が 可 能 である(Tabata 1991) ホシガレイの 雌 への 性 分 化 期 は 70~100 日 齢 であ り( 第 3 章 第 1 節 ), 本 種 でも 性 分 化 期 を 通 して MT 処 理 することが 雄 化 には 必 要 だと 思 われるが, 試 験 3 では 110 日 齢 まで MT を 投 与 したにもかかわらず, 性 比 が 雌 雄 1:1 であったことから, 性 分 化 後 も 一 定 期 間 は 遺 伝 的 な 性 決 定 に 従 っ て 生 殖 腺 が 分 化 すると 思 われる また, 本 研 究 では 180 日 齢 まで 処 理 すると 雄 化 は 完 了 することが 分 かった したがって, 本 種 の 雄 化 には, 性 分 化 期 を 含 む 3 ヶ 月 以 上 の MT 処 理 期 間 が 必 要 だと 考 えられる ヒラメでは 性 分 化 期 を 含 む 59 ~103 日 齢 の MT 投 与 で 雄 化 が 誘 導 されている(Tabata 1991)のと 比 べ,ホシ ガレイでは 約 100 日 間 以 上 の MT 投 与 が 必 要 であり,ヒラメと 比 較 して 遺 伝 的 60

64 な 性 決 定 の 影 響 が 強 く, 人 為 的 な 雄 化 が 誘 導 されにくいものと 推 察 された 本 研 究 の 生 残 率 をみると, 試 験 1 の MT 0.1~1 μg 区 では 対 照 区 と 有 意 差 がな かったことから,MT 1 μg/g diet 以 下 では 生 残 に 対 する 影 響 は 小 さいが,MT 10 μg 区 の 生 残 率 は MT 0.1~1 μg 区 および 対 照 区 と 比 較 して 低 く (P<0.05), 高 濃 度 の MT 投 与 がホシガレイ 仔 稚 魚 の 生 残 を 低 下 させることが 明 らかになった MT 0.5 μg 区 では 対 照 区 と 比 較 して 300 日 齢 まで 長 期 投 与 した 場 合 でも 生 残 率 の 低 下 はみられなかった 試 験 2 では,MT 0.01 μg 区 の 生 残 率 が 対 照 区 より 有 意 に 低 い 値 を 示 したが, 濃 度 依 存 的 な 減 少 は 認 められなかったため,MT の 影 響 以 外 の 要 因 で 生 残 率 が 低 下 したと 考 えられた ヒラメでは,59~103 日 齢 の 期 間 に MT を 100 μg/g diet の 濃 度 で 投 与 しても, 投 与 しない 対 照 区 とほぼ 同 等 の 生 残 率 である(Tabata 1991) ホシガレイは 雄 化 における MT 感 受 性 同 様, 生 残 においてもヒラメ 等 に 比 べ 高 い MT 感 受 性 を 持 つものと 思 われる 本 研 究 で 実 施 した 4 回 の 異 なる 試 験 のうち,3 回 において MT 処 理 による 成 長 の 阻 害 が 確 認 され,MT はホシガレイの 成 長 阻 害 作 用 を 持 つことがより 明 らか となった MT は μg/g diet の 低 濃 度 でも 仔 稚 魚 の 成 長 を 抑 制 した また, 濃 度 が 高 くなると 成 長 の 遅 延 が 促 進 される 傾 向 を 示 した MT 投 与 期 間 と 成 長 の 関 係 をみると, 期 間 が 長 くなるに 従 い, 稚 魚 の 成 長 が 阻 害 ( 実 験 3)あるいは 阻 害 される 傾 向 ( 実 験 4)が 観 察 された この 成 長 差 は MT 投 与 を 終 えた 後 でも 継 続 される 可 能 性 がある 偽 雄 の 作 出 においては 可 能 な 限 り 早 期 に MT 投 与 を 終 了 し, 偽 雄 個 体 の 成 長 を 促 すことが 成 熟 時 の 効 率 的 な 採 精 には 望 ましいと 考 え られる ヒラメでは MT を 10 μg/g diet の 濃 度 で 59~103 日 齢 に 投 与 しても 成 長 の 低 下 はみられず,100 μg/g diet の 投 与 濃 度 で 成 長 の 抑 制 がみられること (Tabata 1991)から,ホシガレイは 成 長 においても MT の 影 響 をヒラメよりも 強 く 受 けると 考 えられた 61

65 本 種 と 同 様 に 雄 よりも 雌 の 経 済 的 価 値 が 高 いアユにおいても, 全 雌 種 苗 生 産 に 用 いる 偽 雄 を 作 出 するために MT 0.4 μg/g diet 処 理 により 雌 から 雄 への 性 転 換 が 行 われているが, 性 転 換 率 は 10% 未 満 と 低 く,200 日 齢 以 降 まで MT 投 与 を 継 続 した 場 合 には 発 達 した 生 殖 腺 を 持 たない 不 稔 魚 が 高 率 で 出 現 している ( 桑 田 ら 2001) また,アユやブラウントラウト Salmo trutta では,MT 処 理 を 施 した 性 転 換 雄 から 精 液 を 搾 取 できる 個 体 が 少 ないことが 問 題 となっており, 輸 精 管 の 形 成 が 不 十 分 な 個 体 がみられている( 桑 田 ら 2001; 小 原 2006) 本 研 究 において 雄 化 処 理 を 施 した 2 歳 魚 から 産 卵 期 に 採 精 を 試 みたところ, 採 精 が 可 能 であった 個 体 は 少 なく,アユ 等 と 同 様 の 現 象 が 起 こっているのかも 知 れな い 今 後 は, 雄 化 の 方 法 において,MT の 経 口 投 与 だけでなく 浸 漬 や 高 水 温 飼 育 と の 併 用 についても 検 討 し, 全 ての 個 体 が 雄 となる 飼 育 条 件 を 確 認 することが 偽 雄 の 効 率 的 な 作 出 につながると 思 われる 62

66 第 4 章 総 合 考 察 本 研 究 において, 雄 化 誘 導 における MT の 効 果 的 な 処 理 濃 度 を 検 討 した そ の 結 果, 試 験 1 において,MT 0.1~1 μg/g diet 処 理 区 で 雄 への 有 意 な 偏 りが みられた しかし, 試 験 2 において MT 0.001~0.1 μg/g diet 投 与 した 稚 魚 の 性 比 には 偏 りはみられず, 雄 化 は 誘 導 されなかった MT 0.1 μg/g diet 処 理 の 性 分 化 への 効 果 が 両 試 験 で 異 なった 原 因 のとして, 試 験 2 は 試 験 1 に 比 べ 仔 魚 の 収 容 密 度 が 高 く, 成 長 も 試 験 1 より 劣 っていたことから, 経 口 投 与 における MT 摂 取 量 が 少 なかったことが 考 えられる また,50 日 齢 までの 仔 魚 への MT 経 口 投 与 では,ワムシおよびアルテミアを MT を 含 む 配 合 飼 料 と 併 用 して 給 餌 していることから, 仔 稚 魚 の 配 合 飼 料 に 対 する 餌 付 きの 程 度 により 投 与 初 期 の 魚 体 内 への MT 取 り 込 み 量 が 異 なっていた 可 能 性 がある したがって, 試 験 1 の 0.1 μg/g diet 処 理 区 では, 本 種 の 仔 稚 魚 を 雄 に 性 分 化 させるために 必 要 な MT の 取 り 込 みが 不 足 していたのかも 知 れない これらのことから,ホシガレイ の 遺 伝 的 雌 を 雄 へと 分 化 誘 導 するための MT 処 理 濃 度 の 下 限 値 は,おそらく 0.1 μg/g diet と 推 察 される MT および 0.01 μg 処 理 区 の GSI および 生 殖 腺 の 外 部 形 態 は 対 照 区 の それと 変 わらず,また, 卵 巣 は 正 常 に 魚 体 後 方 へ 大 きく 伸 長 していた しかし, 試 験 1 および 2 のいずれにおいても 0.1 μg 処 理 区 の GSI は 有 意 に 減 少 した このことから,この 濃 度 は 雄 への 分 化 誘 導 には 効 果 的 ではあるものの, 併 せて 卵 巣 発 達 の 抑 制 作 用 を 有 すると 思 われる 本 試 験 において,MT 0.5 および 1 μg/g diet の 処 理 を 実 施 したところ, 試 験 1 では 雄 の 割 合 が 約 80%, 試 験 3 および 4 では 90% 以 上 となり, 明 らかな 雄 化 誘 導 効 果 が 観 察 された これらの 結 果 から, 遺 伝 的 雌 を 確 実 に 雄 へ 性 分 化 させ 63

67 るためには,MT 投 与 量 を 0.5 μg/g diet 以 上 とすることが 望 ましいと 思 われる しかし,MT 投 与 量 が 過 剰 な 場 合 には 逆 に 雌 の 割 合 が 高 くなることが 知 られてお り(Nakamura 1975;Tabata 1991; 山 本 1992; 藤 岡 1993; 山 本 1995), テ ィラピア Tilapia mossambica では MT 投 与 期 間 が 長 くなると 雄 化 が 阻 害 される (Nakamura 1975)との 報 告 がある 本 研 究 においても 10μg/g diet の MT を 与 えると, 性 比 に 偏 りが 認 められず 雄 化 が 促 進 されなかった このことから, ホシガレイでは MT 10 μg/g diet の 投 与 は 雄 化 誘 導 に 対 して 過 剰 であり, 雄 化 を 効 果 的 に 誘 導 する MT 投 与 濃 度 は,0.5~1 μg/g diet の 範 囲 であると 考 えら れる これまでに 八 木 ら(2005)が 実 施 したホシガレイの MT 処 理 試 験 の 結 果 は, 本 研 究 の 結 果 と 大 きく 異 なる 平 均 全 長 25 mm のホシガレイ 稚 魚 に MT を 0.1, 1,10,20 および 50 μg/g diet 添 加 した 配 合 飼 料 を 10 ヶ 月 間 経 口 投 与 したと ころ,1 μg/g diet 以 上 の 投 与 区 で 雄 の 割 合 が 高 くなり,10 μg/g diet 以 上 で は 100%の 個 体 が 雄 になったと 報 告 している しかし,この 研 究 では 生 殖 腺 の 組 織 学 的 観 察 は 実 施 しておらず, 雄 に 分 化 したとされる 精 巣 の 状 態 は 不 明 である 同 じ 魚 種 において MT の 効 果 に 違 いがあることから, 今 後, 組 織 学 的 観 察 を 加 えながら, 発 達 段 階 による 反 応 性 の 違 いなども 含 め 改 めて MT 投 与 量 の 限 界 値 について 検 討 する 必 要 があろう 雄 化 の 誘 導 に 有 効 な MT 投 与 量 は 魚 種 により 大 きく 異 なる たとえば, 同 じ 異 体 類 であるヒラメでは, 雌 性 発 生 二 倍 体 魚 へ MT 1 および 10 μg/g diet の 飼 料 を 59~103 日 齢 の 期 間 投 与 することにより 98.8%および 100%の 個 体 がそれ ぞれ 雄 へと 性 分 化 する(Tabata 1991) ボラ Mugil cephalus では 孵 化 後 6 ヶ 月 の 稚 魚 に MT 20 μg/g diet を 4 ヶ 月 間 投 与 すると, 雄 化 が 誘 導 され, 雄 の 比 率 が 100%となる(Chang et al. 1999) マダイ Pagrus major では,55 日 齢 の 64