Microsoft Word - A9_ｱﾎﾟﾄｰｼｽ_最終原稿_R.docx

Transcription

1 9 アポトーシスの検出 はじめに アポトーシス ( プログラム細胞死 ) は Fas(CD95) のシグナルや 薬剤や放射線による DNA の損傷 増殖因子の枯渇などさまざまな要因により誘導されます アポトーシスは DNA の断片化と核および細胞の形態変化に至る以前に ICE ファミリープロテアーゼの活性化や ミトコンドリア膜電位の低下などが認められることも明らかにされています アポトーシスをフローサイトメトリーで検出する方法として 各 DNA 染色による sub-g1 フラクションの検出や TUNNEL(TdTmediated dutp nick end labeling) 法による断片化 DNA の検出などが知られています これらはアポトーシスの分子機構における中 後期のイベントを見るものです 今日では この DNA 断片化よりも以前に起こる細胞膜の構造変化を検出する方法が行われています ここでは アポトーシスの初期段階を検出する Annexin V Kit の測定原理と使用方法のご紹介をいたします また 断片化 DNA を測定する TUNEL 法の原理もご紹介します 原理 Annexin V 細胞膜の内側に膜リン脂質 ( フォスファチジルセリン PS) と結合する蛍光標識 Annexin V と DNA に結合する PI や 7-AAD ( 膜透過性がない ) を用いてアポトーシス細胞を検出する方法です * ここでは PI を使用した例をお示しします 1. アポトーシスを誘導していない正常な状態の細胞は 細胞膜の内側に膜リン脂質 ( フォスファチジルセリン PS) が存在しています また 細胞膜の損傷もないので PI は細胞内に取り込まれず核内 DNA とは結合しません ( 図.1-1) 2. 細胞に Fas 抗体または薬剤などを作用させることにより アポトーシスを誘導させます 3. アポトーシスの初期の段階では 通常細胞膜の内側に存在する PS が細胞膜表面に露出してきます この PS と Annexin V は Ca 2+ 存在下で結合します この段階の細胞膜にはまだ損傷が起こっていないため PI は細胞内に取り込まれず 核内 DNA とは結合しません ( 図.1-2) 4. 後期のアポトーシス細胞およびネクローシス細胞は Annexin V と PI の両方に染まります ( 図.1-3) 図.1 Annexin V 染色原理 1 アポトーシス誘導前 2 初期のアポトーシス 3 後期アポトーシス ( 二次的ネク ローシス ) とネクローシス 核も PS も染まりません PS が Annexin V と結合 核が PI に染まり PS が Annexin V と結合 : 蛍光色素 :Annexin V :PI : フォスファチジルセリン (PS) 1

2 アポトーシス誘導例アポトーシスの誘導 1 -Fas 抗体によるアポトーシスの誘導 - Ⅰ. 準備細胞 : Jurkat 細胞試薬 : Fas(CD95) 抗体 (IM1504):in vitro で CD95 を発現している細胞株のアポトーシスを誘導します 注 : Fas 抗体 (IM1504) の濃度は 500μg/mL です RPMI 1640 または DMEM FCS 注 : RPMI 1640 DMEM および FCS は 弊社では取り扱っておりません Ⅱ. 方法 Fas(CD95) 抗体 (IM1504 を使用する場合 ) 1. Jurkat 細胞を cells/ml の濃度に調整し 10%FCS RPMI 1640 で培養します 2. この培養細胞に対して Fas(CD95) 抗体を 100ng/mL の濃度になるように加え 軽く振とうします 例 : 培養細胞 20mL Culture に 上記抗体を 4μL 加えます CO 2 5.0% で 4~8 時間インキュベートします ( この反応時間の場合 20%~50% の細胞にアポトーシスが誘導されます ) * 細胞種や培養条件などにより アポトーシスを誘導する時間は異なります アポトーシスの誘導 2 - 薬剤 (Actinomycin D) によるアポトーシスの誘導 - Ⅰ. 準備 細胞 : Jurkat 細胞または HL-60 細胞 試薬 : Actinomycin D-Mannitol (SIGMA #A 5156 など ) Ⅱ. 方法 ストック溶液 :SIGMA #A5156 を Actinomycin D-Mannitol が 1mg/mL になるように蒸留水 ( 無菌にしたもの ) に溶解します ( 溶解したものは 遮光をして 4 に保存します ) RPMI 1640 または DMEM FCS 注 :RPMI 1640 DMEM および FCS は 弊社では取り扱っておりません Actinomycin D-Mannitol(SIGMA #A 5156 を使用する場合 ) 1. Jurkat 細胞または HL-60 細胞を cells/ml の濃度に調整し 10%FCS RPMI 1640 で培養します 2. この培養細胞に Actinomycin D-Mannitol( 上記ストック溶液 ) を 2μg/mL の濃度になるように加え 軽く振とうします 例 : 培養細胞 20mL Culture に上記ストックを 40μL 加えます CO 2 5.0% で 6~8 時間インキュベートします ( この反応時間で 60%~80% の細胞にアポトーシスを誘導します ) * 細胞種や培養条件などにより アポトーシスを誘導する時間は異なります 2

3 アポトーシスの誘導 3 - 薬剤 (Mitomycin C) によるアポトーシスの誘導 - Ⅰ. 準備 細胞 : Jurkat 細胞 試薬 : Mitomycin C (SIGMA #M 4287 など ) Ⅱ. 方法 RPMI 1640 または DMEM FCS 注 :RPMI 1640 DMEM および FCS は 弊社では取り扱っておりません Mitomycin C(SIGMA #M 4287 を使用する場合 ) 1. Jurkat 細胞を cells/ml の濃度に調整し 10%FCS RPMI 1640 で培養します 2. この培養細胞に Mitomycin C を 1μg/mL の濃度になるように加え 軽く振とうします CO 2 5.0% で 12 時間インキュベートします ( この反応時間で 40%~50% の細胞にアポトーシスを誘導します ) * 細胞種や培養条件などにより アポトーシスを誘導する時間は異なります 3

4 2 カラー染色例 Annexin V Kit AnnexinV-FITC kit (PI) Annexin V-FITC/7-AAD Kit の場合 アポトーシスの特徴として 良く知られている DNA の特殊なフラグメント化の前に 細胞膜の構造変化が起こります 通常 膜の内側に存在する膜リン脂質フォスファチジルセリン (PS) は 膜の構造は保ったままで膜の外部に露出してきます 露出した PS と Annexin V は カルシウムイオンの存在下で結合します アポトーシスの起こった細胞では Annexin V-FITC の蛍光は観察されますが 細胞膜の構造は保たれているため PI/7-AAD は膜を通過できず DNA とは結合しません 一方 アポトーシスの後期やネクローシスの場合には 細胞膜の構造が崩壊しているため Annexin V-FITC と PI/7-AAD の両方の蛍光が観察されます また 正常な細胞はいずれの試薬とも反応せず陰性となります Ⅰ. 準備器具 : プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ FCM 用サンプルチューブ (PN : A など ) 試薬 : Annexin V-FITC Kit (PI) (IM T または IM T) Annexin V-FITC/7-AAD Kit (IM T) Ⅱ. 染色方法の流れ :2 カラー染色 Annexin V-FITC Kit AnnexinV-FITC/7-AAD Kit 20T 200T 150T アポトーシスの誘導 2~3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導 細胞の回収 洗浄 メディウムまたは PBS を加え 500g 4 5 分間遠心分離 上清除去 ( 注 ) 細胞によって遠心分離の条件 ( 時間 遠心力 ) は異なります バインディングバッファ - に懸濁 5x10 5 ~5x10 6 cells/ml になるように 氷中で冷却した 1x バインディングバッファ * で再懸濁します 5x10 6 ~1x10 7 cells/ml になるように氷中で冷却した 1x バインディングバッファ * で再懸濁します サンプルの染色 サンプル 100μL Annexin V-FITC 5μL PI 2.5μL を添加 サンプル 100μL Annexin V-FITC 1μL PI 5μL を添加 サンプル 100μL Annexin V-FITC 10μL 7-AAD 20μL を添加 インキュベーション暗所 氷上 10 分間暗所 氷上 15 分間 バインディングバッファ - を加える 400μL の 1x バインディングバファ * を加えます FCM で測定 FCM で測定 : 機器の感度設定 蛍光補正などを行い測定します * バインディングバッファの代わりに メディウムに CaCl 2 ( 終濃度 1.5mM 以上 ) を加えたもので代用できます Ⅲ. セットアップに必要なサンプル 1 : PI 単染色サンプル 2 : Annexin V-FITC 単染色サンプル 3 : Annexin V-FITC と PI 染色サンプル ( 測定サンプル ) 4

5 解析の流れ 解析例 AnnexinV-FITC Kit(PI) の場合 1. プロット図の作成 SS / FS のプロット図と生細胞集団を囲む A ゲートリージョンを作成します A ゲート設定をした FL1 / FL4 のプロット図とゲートなしの FL1 / FL4 のプロット図の二つを作成します Ungate A Gate Ungate 2. ネガティブコントロールサンプルネガティブコントロールサンプルは PI で単染色したサンプルを用います Ungate のプロット図で PI 陽性細胞の感度設定を行います また この PI 陽性サンプルで FL1 側のネガティブ領域を決定します ( 注 ):PI を加えると PI と細胞の非特異的な結合などによりバックグランドが上がります PI を添加していないサンプルを用いて FL4 の感度調整を行た場合 PI を添加したサンプルのネガティブ ( 生細胞 ) の集団が FL4 軸側に浮き上がった状態になりますので注意してください Ungate FS INT LIN SS INT LIN Annexin V- Annexin V- Annexin V- 3. FL4(PI) から FL1 への蛍光補正ネガティブコントロールサンプル (PI 単染色 ) を用いて FL4 から FL1 への蛍光補正を行います 蛍光補正は PI 陽性細胞が確認しやすい Ungate の FL1 / FL4 プロット図で行います Ungate 蛍光補正前 Ungate 蛍光補正後 Annexin V- Annexin V- 5

6 4. FL1(FITC) から FL4 への蛍光補正 AnnexinV-FITC で単染色されたサンプルで FL1 から FL4 への蛍光補正を行います ネガティブコントロールサンプルと違い PI が添加されていないため PI の非特異的な反応が大きいサンプルでは FL1 の軸にへばり付いた状態になることがあります その場合 正確は蛍光補正が行えない事があります その時には Annxin V-FITC PI 共に染色したサンプルを用い A Gate が設定されたデータで蛍光補正を行ってください A Gate 蛍光補正前 A Gate 蛍光補正後 5. サンプル測定例 A Gate Annexin V- Annexin V- B2: アポトーシス後期 ( 二次的ネクローシス細胞 ) もしくはネクローシス細胞の領域 B4: 初期のアポートーシスの領域 Annexin V- B3: アポトーシスを起こしていない 生細胞の領域 サンプル測定例 : Jurkat 細胞 5x10 6 cells/ml に対し Actinomycin D-Mannitol を終濃度 2μg/mL になるように加え 6 時間インキュベートした後に測定したデータです 6

7 3 カラー染色例 ( 細胞表面抗原とアポトーシス検出 ) Annexin V Kit Annexin V-Biotin Kit の場合 Annexin V-Biotin を使用することにより Annexin V-Biotin と結合する蛍光色素を自由に選択することが出来ます ここでは表面抗原を 2 つの蛍光色素て染色し Annexin V-Biotin をストレプトアビジン (SA) が修飾された蛍光色素で染色する 3 カラー染色方法をご紹介します Ⅰ. 準備器具 : プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ FCM 用サンプルチューブ (PN : A など ) 試薬 : Annexin V-Biotin Kit (IM T または IM T) 蛍光標識ストレプトアビジン蛍光標識抗体 Ⅱ. 染色方法の流れ :3 カラー染色 アポトーシスの誘導 Annexin V-Biotin Kit 20T/200T 2~3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導 細胞の回収 洗浄 メディウムまたは PBS を加え 500g 4 5 分間遠心分離 上清除去 ( 注 ) 細胞によって遠心分離の条件 ( 時間 遠心力 ) は異なります バインディングバッファ - に懸濁 10 5 ~10 6 cells/ml になるように 氷中で冷却した 1x バインディングバッファ * で再懸濁します サンプルの染色 サンプル 500μL Annexin V-Biotin 5μL を添加 インキュベーション 氷上 5 分間 遠心 洗浄 1x バインディングバッファ * を 500μL 加えて遠心分離 上清除去を 2 回行います 再懸濁 1x バインディングバッファ 100μL で再懸濁します 蛍光標識二次試薬蛍光標識抗体の添加 蛍光標識ストレプトアビジン (PC7 標識 - ストレプトアビジンなど ) を規定量添加細胞表面抗原を同時染色する場合は 蛍光標識抗体を規定量添加 インキュベーション 暗所 室温で 30 分間 遠心 洗浄 1x バインディングバッファ * を 500μL 加えて遠心分離 上清除去 再懸濁 1x バインディングバッファ * 500μL で再懸濁します FCM で測定 FCM で測定 : 機器の感度設定 蛍光補正などを行い測定します * バインディングバッファの代わりに メディウムに CaCl 2 ( 終濃度 1.5mM 以上 ) を加えたもので代用できます 7

8 3 カラー ( 細胞表面とアポトーシス ) 解析の流れ 3 カラー染色解析例 今回使用した 3 カラー染色サンプルは CD5-FITC CD1a-PE Annexin V-Biotin/SA-PC7 を用いて測定しました 1. プロット図の作成 SS / FS のプロット図の感度調整を行い A ゲートリージョンを作成します A ゲート設定がされた各パラメータのプロット図を作成し感度調整を行います Ungate A Gate A Gate FS INT LIN SS INT LIN Annexin V- 2. FL1(FITC) から FL2(PE) FL1(FITC) から FL5(PC7) への蛍光補正 FL1(FITC) から FL2(PE) FL1(FITC) から FL5(PC7) への蛍光補正を FITC 単染色サンプルを用いて行います A Gate A Gate A Gate A Gate 蛍光補正前 蛍光補正後 蛍光補正前 蛍光補正後 3. FL2(PE) から FL1(FITC) FL2(PE) から FL5(PC7) への蛍光補正 FL2(PE) から FL1(FITC) FL2(PE) から FL5(PC7) への蛍光補正を PE 単染色サンプルを用いて行います A Gate A Gate A Gate A Gate 蛍光補正前蛍光補正後蛍光補正前蛍光補正後 8

9 4. FL5(PC7) から FL1(FITC) FL5(PC7) から FL2(PE) への蛍光補正 FL5(PC7) から FL1(FITC) FL5(PC7) から FL2(PE) への蛍光補正を PC7 単染色サンプルを用いて行います A Gate A Gate A Gate A Gate 蛍光補正前蛍光補正後蛍光補正前蛍光補正後 5. サンプル測定例 Ungate A Gate A Gate&B Gate FS INT LIN CD11a-PE SS INT LIN CD5-FITC Annexin V-PC7 OverLay Plot : アポトーシス誘導なしサンプル : アポトーシスを誘導したサンプル Jurkat 細胞に対して Actinomycin D-Mannitol を終濃度 2μg/mL になるよに加え 8 時間インキュベーションした後に測定したデータです Annexin V-PC7 9

10 接着細胞染色例 Annexin V Kit Annexin V-Biotin Kit の場合 Annexin V-Biotin を使用することにより PS と Annexin V の反応を好きな蛍光色素を用いることが出来ます ここでは接着細胞の染色方法をご紹介します Ⅰ. 準備器具 : 24wel プレートゴム製のスクレーパー FCM 用サンプルチューブ (PN : A など ) 試薬 : Annexin V-Biotin Kit (IM T または IM T) 蛍光標識ストレプトアビジン Ⅱ. 接着細胞染色方法の流れ Annexin V-Biotin Kit の場合 20T/200T アポトーシスの誘導 2~3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導 (24well プレートで培養した場合 ) Annexin V-Biotin の添加 細胞を培養している培養液 500μL に対し 5μL の Annexin V-Biotin を加えます ( 注 ) 培地 Ca 2+ の濃度を保つために終濃度 1.5mM になるようにバインディングバッファか CaCl 2 を加えます インキュベーション 5 分以上反応させます *Annexin V-Biotin は 42 以上で不安定になるので注意してください 細胞の回収培養液中の細胞プレートに接着している細胞 プレートから剥がれた細胞を含む溶液を回収 プレートに接着している細胞を 1x バインディングバッファ * ( 適量 ) で 2 回リンス 1x バインディングバッファ * を適量 (500μL 位 ) 加えて遠心分離 上清除去を 2 回 ( 注 ) 細胞によって遠心分離の条件 ( 時間 遠心力 ) は異なります スクレーバで細胞を回収 ( 注 ) トリプシンや EDTA を用いたハーベスト方法は細胞と Annexin V-Biotin の結合を弱め PS を細胞表面に誘導する可能性があります プレートから剥がれた細胞溶液とプレートに接着していた細胞をまとめます 遠心し 10 5 ~10 6 /ml の濃度になるように 1x バインディングバッファ * で懸濁 蛍光標識二次試薬と PI の添加 蛍光標識ストレプトアビジン (FITC 標識ストレプトアビジンなど ) を規定量添加 PI を終濃度 2.5μg/mL になるように加えます インキュベーション 暗所 氷上で 15 分間インキュベート FCM で測定 FCM で測定 : 機器の感度設定 蛍光補正などを行って測定します * バインディングバッファの代わりにメディウムに CaCl 2 ( 終濃度 1.5mM 以上 ) を加えたもので代用できます 10

11 MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit (TUNEL 法 ) 原理 MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Dirrect /Ⅱ は TUNEL 法により DNA の断片化を指標として アポトーシスによる細胞死を細胞個々に検出する試薬です 細胞内の核における断片化 DNA の 3 -OH 末端部分に fluorescein-dutp を結合させることにより 断片化 DNA に特異的な蛍光を検出できます 図.2 TUNEL 法染色原理 MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct dutp が FITC 標識されているため 染色の工程が少なく 簡便に染色できます FCM 測定 核の断片化 DNA の 3 -OH 末端部に FITC-dUTP が結合 MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ dutp が Biotin 標識されているため dutp の検出をするための蛍光色素を自由に選択することができ 好きな染色の組み合わせを選択できます FCM 測定 核の断片化 DNA の 3 -OH 末端部に Biotin-dUTP が結合 DNA に接合した Biotin-dUTP と FITC-Avidin が結合 MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct, MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ は株式会社医学生物学研究所 (MBL) で取り扱ってます MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct :MBL code 8445 MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ:MBL code 8441 MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct FCM 解析データ Jurkat 細胞を抗ヒト Fas 抗体 ( クローン CH-11) でアポトーシスを誘導しました 抗体添加 2 時間後 及び 4 時間後に細胞を回収し MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct で染色し フローサイトメーターで測定しました 抗ヒト Fas 抗体によるアポトーシス誘導 2 時間後データ 抗ヒト Fas 抗体によるアポトーシス誘導 4 時間後データ 抗ヒトFas 抗体添加濃度 陽性率 (%) Untreated 6.2% 20 ng/ml 8.5% 200 ng/ml 18.3% 2,000 ng/ml 24.5% 11 抗ヒトFas 抗体添加濃度 陽性率 (%) Untreated 6.2% 20 ng/ml 45.4% 200 ng/ml 68.7% 2,000 ng/ml 70.2% データ提供 : 株式会社医学生物学研究所 (MBL)

12 参考文献 1. Vermes,I.,Haanen,C., Reutelingsperger,C.P.M., A novel assay for apoptosis:flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic ceils using fluorescein labelled annexin V,1995,J.Immunol.Methods,180, Martin,S,J.,Reutelingsperger,C.P.M.,McGahon,A,J.,Rader,J.,van Schie,R.C.A.A., LaFace, D.M., Green,D.R., Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus. Inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl, 1995,J.Exp.Med.,182, Wyllie,A.H.,Kerr,J.F.R.,Currie,A.R., Cell death:the significance of apoptosis,1980, lnterm.rev.cytol., 68, Kerr,J.F.K.,Wyllie A.H., Currie,A.H., Apoptosis, a basic biological phenomenon with wider implications in tissue kinetics,1972,br.j.cancer,26, Wyllie,A.H.Morris,R.G.,Smith, A.L.,Dunlop,D., Chromalin cleavage in apoptosis:association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis,1984,j.pathol.,142, Oberhammer,F.A.,Wilson,J.W.,Dive, C.,Morris,I.D.,Hickman, J.A.,Wakeling, A.E., Walker,P.R., Apoptotic death in epithelial cells:cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation, 1993,Embo.J.,12, Savill,J., The innate immune system:recognition of apoptotic cells. ln:apoptosis and the immune response,1996,ed.,gregory, C.D.,Willey-Liss,NewYork,p Fadok,VA,Voelker,D.R.,Campbell, P.A.S.,Cohen.J.J.,Bratton,D.L.,Henson,P.M., Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages,1992,j.immunol.,148, Fadok,V.A.,Savill,J.S.,Haslett, C.,Bratton,D.L.,Doherty,D.E.,Campbell,P.A.,Henson, P.M., Different populations of macrophages use either the vitronectin receptor or the phosphatidylserine receptor to recognize and remove apoptotic cells 1992,1992.J.Immunol.,149, Diaz,C.,Schroit, A.J., Role of translocases in the generation of phosphatidylserine asymmetry,1996, Journal of Membrane Biology,151, Verhoven,B.,Schlegel,R.A.,Williamson,P., Mechanism of phosphatidylserine exposure,a phagocyte recognition signal on apoptotic T lymphocytes,1995,j.exp.med.,182, van Heerde,W.L.,Degroot,P.G.,Reutelingsperger,C.P.M., The complexiy of the phospholipid binding protein annexin V,1995,Thromb Haemost.,73, Tait,J.F.,Gibson, D.,Fujikawa,K., Phospholipid binding properties of human placental anticoagulant protein-i,a member of the lipocortin family,1989,j.biol.chem.,264, Andree,H.A.,Reutelingsperger,C.P,M.,Hauptmann, R., Hemker,H.C.,Hermens, W.T., Willems, G.M., Binding of vascular anticoagulant alpha(vac alpha)to planar phospholipid bilayers,1990,j.biol.chem.,265, Thiagarajan,P.,Tait,J.F., Collagen-induced exposure of anionic phospholipid in platelets and platelet-derived microparticles,1991.j.biol.chem.,266, Dachary-Prigent,J.,Freyssinet,J.M.,Pasquet,J.M.,Carron,J.C.,Nurden,A.T., Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation:a flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups,1993,blood,81, Homburg,C.H.E.,de Haas,M.,von dem Borne,A.E.G.Kr.,Verhoeven,A.J.,Reutelingsperger, C.P.M.,Roos,D., Human neutrophils lose their surface FcgRIII and acquire annexin V binding sites during apoptosis in vitro,1995,blood,85, Koopman,G.,Reutelingsperger,C.P.M.,Kuijten,G.A.M.,Keelmen,R.M.J.,Pals,S.T.,van Oers,M.H.J., Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis,1994,blood,84, van Engeland,M.,Ramaekers,F.C.S.,Schutte,B.,Reutelingsperger,C.P.M., A novel assay to measure loss of plasma membrane asymmetry during apoptosis of adherent cells in culture,1996,cytometry,24, Castedo,M.,Hirsch,T.,Susin, S.A.,Zamzami,N.,Marchetti,P.,Macho,A.,Kroemer,G., Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis,1996,j Immunol.,157, Berthou,C.,Michel,L.,Soulie,A.,Jean-Louis,F.,Flageul,B.,Dubertret,L.,Sigaux,F.,Zhang, Y.,Sasportes,M.,"Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense,1997,j Immunol.,159, Van den Eijnde,Boshart, L.,Reutelingsperger.C.P.M.,De Zeeuw,CI.,Vermeij-Keers,C., Phosphatidylserine plasma membrane asymmetry in vivo:a Pancellular phenomenon which alters during apoptosis",1997,cell Death and Differentiation,4, Wyllie,A.H.Apoptosis(The 1992 Franck Rose Memorial lecture).1993.br.j. Cancer,67, Steller,H.Mechanisms and genes of cellular suicide.1995.science,267, Mori,C.,Nakamura.N., Okamoto,Y.,Osawa,M.,Shiota,K.Cytochemical identification of programmed cell death in the fusing fetal mouse palate by specific labeling of DNA fagmentation.1994.anat.&embryol.,190, Moli,C.,Nakamura,N.,Kimura,S.,Irie,H.,Takigawa,T.,Shiota,K.Programmed cell death in the interdigital tissue of the fetal mouse limb is apoptosis with DNA fragmentation Anat.Rec.,242, Krammer,P.H.,Behrmann,I.,Daniel,P.,Dhein,J.,Debatin,K.-M.Regulation of apoptosis in the Immune system.1994.curr.opin.immunol.6, Gavrieli, Y.,Sherman,Y.,Ben-Sasson,S.A.ldentification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.1992.j.cell Biol.,119, Carbonari,M.,Cibati,M.,Fiorilli,M.Measurement of apoptotic cells in peripheral blood Cytometry,22, 辻本賀英 祢重信 武 新アポトーシス実験法 - 基本操作と最先端の解析法 - 羊土社 改訂履歴 Ver 年 12 月 Ver 年 2 月 CE