2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 2 of 要であることが示唆されている 5,) 同様に 虚血性網膜症及び糖尿病網膜症の動物モデルにおいて VEGF を薬理学的に中和すると 血管新生及び血管漏出の発現抑制あるいは回復が認められる 7,8) VEGF は病的な眼血管新生

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1 2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 1 of 2..1 緒言 血管内皮増殖因子 血管内皮増殖因子 (VEGF) は 血管内皮細胞にとって不可欠の増殖因子であり 1) 内皮細胞の分裂促進因子として機能するのみならず 既存の血管からの新たな血管形成 ( 血管新生 ) や血管系の初期形成 ( 脈管形成 ) のプロセスである内皮細胞の遊走 生存や管腔形成を促進する また VEGF は血管透過性を亢進させる さらに VEGF は正常な血管形成や生理的な血管新生において重要な役割を果たすほか 様々な疾患においても 病的な血管新生や血管透過性の亢進に深く関わっていることが知られている VEGF ( VEGF-A として記される場合もある ) には 一連の関連たん白質の存在が知られている ヒトや哺乳類の VEGF ファミリーには 胎盤増殖因子 (PlGF) VEGF-B VEGF-C や VEGF-D がある これらの VEGF ファミリーはいずれも二量体を形成し 3 種の受容体型チロシンキナーゼ [VEGFR-1(flt-1) VEGFR-2(flk-1) 及び VEGFR-3] のいずれか又は複数に結合する 1,2) これら受容体へのリガンドの結合は 受容体の二量体化 自己リン酸化及び細胞内シグナル伝達を誘導し 細胞機能を調節する VEGFR-2 は主として血管内皮細胞に発現しているが VEGFR-1 は血管内皮細胞のほかに 好中球 単球 マクロファージや周細胞などにも発現している VEGFR-1 は VEGFR-2 よりも VEGF に対する高い結合親和性を有しているものの VEGF による二量体化で生じる内皮細胞の VEGFR-1 活性化は弱い したがって すべての VEGF(VEGF-A) アイソフォームの作用は 主に VEGFR-2 の活性化を介して生じると考えられる VEGFR-1 は関連分子である PlGF や VEGF-B にも結合する VEGF と異なり PlGF や VEGF-B は正常の血管形成や成熟動物の生理的な血管新生に必須ではない しかしながら VEGF と同様に PlGF 及び VEGF-B は病的な血管のリモデリングに関与している 1) その他の VEGF ファミリーである VEGF-C や VEGF-D は VEGFR-3 に高親和性で結合する VEGFR-3 はリンパ管内皮細胞に主として認められ VEGF-C や VEGF-D は主にリンパ管新生の調節に関与していると考えられる 2) VEGF は単一遺伝子によってコードされているが 選択的スプライシングやたん白質分解切断により生じるいくつかの異なるアイソフォームが存在する 1) それぞれの VEGF アイソフォームはいずれも二量体として機能するものの その大きさ並びにヘパリンやニューロピリンと呼ばれるアクセサリーたん白質 ( 非シグナル性の結合たん白質 ) への結合能には違いがある 例えば ヒトで最も主要なアイソフォームである VEGF 15 は ヘパリンやニューロピリンに結合する VEGF 121 も多くの組織や病的な状態で高レベルに発現するが ヘパリンやニューロピリンに結合するドメインを欠いている 1,2) いずれの VEGF アイソフォームも主として VEGFR-2 への結合とその活性化を介して作用を発現するものの 血管パターンの制御過程において異なる役割を担っている VEGF と同様に PlGF も複数のアイソフォームが選択的スプライシングによって生じ ヘパリンやニューロピリンへの結合能に違いが認められる 臨床データ及び疫学データあるいは非臨床試験結果から VEGF が 滲出型 ( 血管新生 ) 加齢黄斑変性 (AMD) 糖尿病網膜症及び虚血性網膜症などの眼性血管疾患の特徴である血管透過性亢進 浮腫及び血管新生において重要な役割を果たしていることが示された 例えば 動物の眼内への VEGF 投与 あるいはトランスジェニック法により局所的 VEGF 過剰発現を誘導すると 異常な血管漏出及び眼血管新生が生じる 3,4) また 脈絡膜新生血管 (CV) の動物モデルでは VEGF シグナルの阻害により CV の発症が強力に抑制されたことから CV 発症に VEGF 刺激が必

2 2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 2 of 要であることが示唆されている 5,) 同様に 虚血性網膜症及び糖尿病網膜症の動物モデルにおいて VEGF を薬理学的に中和すると 血管新生及び血管漏出の発現抑制あるいは回復が認められる 7,8) VEGF は病的な眼血管新生や網膜浮腫に至るプロセスに関わる基本的因子であることから VEGF の阻害はこれらの病態を特徴とする疾患に対する有望な治療法の一つとなることが期待される また VEGF に加え 関連の血管新生たん白質である PlGF もまた眼血管新生及び血管漏出に関与していると考えられている 9,10) VEGF Trap-Eye VEGF Trap( アフリベルセプト ) は ヒト VEGFR-1 の第 2 Ig ドメインとヒト VEGFR-2 の第 3 Ig ドメインをヒト IgG1 の Fc ドメインに直列に融合した新規の組換えヒト融合たん白質である ( 図 ) 組換え VEGF Trap たん白質 ( ホモ二量体糖たん白質 ) は チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)K1 細胞で発現させ ろ過及びクロマトグラフィー法で精製する 図 VEGF Trap の構造 VEGFR-1 及び VEGFR-2 は互いに近縁の受容体であり それぞれ細胞外に 7 個の Ig ドメインと細胞内に 1 個のチロシンキナーゼドメインを有する VEGF Trap には 融合した VEGFR-1 の第 2 Ig ドメイン及び VEGFR-2 の第 3 Ig ドメイン 並びにそれらと融合した IgG1 の Fc 領域が含まれている VEGFR-1 と VEGFR-2 それぞれのリガンド結合に重要なドメインを取込むことによって VEGF Trap はすべての VEGF アイソフォームに結合するようにデザインされた ) 実際に VEGF Trap

3 2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 3 of は VEGF に結合し その活性を阻害することが様々な試験において確認されている また VEGF Trap は VEGF のヘパリン結合アイソフォーム及びヘパリン非結合アイソフォームいずれにも同等に結合した [ 解離定数 (K D) は VEGF 15:0.5pM VEGF 121:0.3pM] VEGF に対する高い結合親和性により VEGF Trap は VEGF と複合体を形成し VEGF とその細胞表面受容体との相互作用を阻害する VEGF Trap は VEGFR-1 のリガンドである PlGF-2 及び VEGF-B にも高い結合親和性 (K D: それぞれ 39pM 及び 1.92pM) を有している VEGF Trap の VEGF 及び PlGF に対する結合は in vivo においてそれらリガンドとその内因性 VEGF 受容体との相互作用を阻害し 異常な血管新生及び血管漏出を抑制すると考えられる VEGF Trap-Eye は 硝子体内投与用として高純度に精製された VEGF Trap の等浸透圧性製剤であり 滲出型 AMD 糖尿病黄斑浮腫及び網膜血管閉塞性疾患を有する患者を対象に臨床試験が実施されている これらの疾患は先進国における中途失明の主な原因となっている 臨床試験では VEGF Trap-Eye (VEGF Trap として )0.5mg 又は 2.0mg を月 1 回又はそれ以下の頻度で罹患眼に硝子体内投与した 本概要に記載の非臨床試験プログラムは これら疾患の適応に VEGF Trap- Eye を使用する根拠及び安全性を裏付けるために計画された VEGF Trap は ヒトの VEGF 及び PlGF と同程度の親和性でマウス ラット ウサギ及びサルの VEGF 及び PlGF に結合することから これらの動物種において非臨床の薬理試験 薬物動態試験及び毒性試験を実施した 本概要中で示した VEGF Trap の非臨床試験のほか 公表されている非臨床試験 4,12,13) において 滲出型 AMD 糖尿病網膜症及び虚血性網膜症の動物モデルにおける異常な血管透過性及び血管新生に対する VEGF Trap の抑制効果が検討された いずれのモデルにおいても VEGF Trap は全身又は硝子体内投与で異常な血管透過性及び血管新生を効果的に抑制した 非臨床安全性試験の評価を裏付け VEGF Trap-Eye の臨床使用を支持する知見を得るために 硝子体内投与による薬物動態試験を実施し VEGF Trap の in vivo における分布及び消失について全身曝露も含めて評価した VEGF Trap の毒性プロファイルは マウス ラット ウサギ及びサルを含む複数の動物種を用いた単回及び反復投与毒性試験によって評価した また VEGF Trap の安全性プロファイルを硝子体内 皮下及び静脈内を含む複数の投与経路により評価した さらに 硝子体内投与による VEGF Trap-Eye の眼に対する慢性毒性をサルを用いて評価した サルの網膜は構造的及び機能的にヒトの網膜と類似しているため サルをこれらの試験に用いる動物種として選択した また サルの硝子体は比較的容量が大きいため ヒト臨床用量よりも高い投与量で VEGF Trap-Eye を反復硝子体内投与したときの影響が評価可能である 本概要に示す一連の非臨床試験により 硝子体内投与した VEGF Trap は 網膜及び脈絡膜に効果的に曝露するとともに 全身曝露を最小限にし かつ安全性プロファイルが良好であることが確認された VEGF Trap-Eye の申請効能 効果は 中心窩下脈絡膜新生血管を伴う加齢黄斑変性 であり 申請用法 用量は アフリベルセプト ( 遺伝子組換え ) として 2mg(0.05mL) を 1 ヵ月ごとに 1 回 連続 3 回 ( 導入期 ) 硝子体内投与する その後の維持期においては 通常 2 ヵ月ごとに 1 回 硝子体内投与する なお 症状により投与間隔を適宜調節する である

4 2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 4 of 略語一覧 略語 英語名称 日本語名称 ADA Anti-drug antibody 抗薬物 (VEGF Trap) 抗体 ADCC Antibody dependent cell-mediated 抗体依存性細胞傷害 ( 作用 ) cytotoxicity AMD Age-related macular degeneration 加齢黄斑変性 ALP Alkaline phosphatase アルカリホスファターゼ AST Aspartate aminotransferase アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ ALT Alanine aminotransferase アラニンアミノトランスフェラーゼ AUC Area under the concentration-time 濃度 - 時間曲線下面積 curve AUC 0- Area under the concentration-time curve (from time 0 to infinity) 濃度 - 時間曲線下面積 (0 から無限大時間 ) AUC (0-x) Area under the concentration-time 濃度 - 時間曲線下面積 (0 からx 時間 ) curve over x h bfgf Basic fibroblast growth factor 塩基性線維芽細胞増殖因子 BSA Bovine serum albumin ウシ血清アルブミン CDC Complement dependent cytotoxicity 補体依存性細胞傷害 ( 作用 ) CHO Chinese hamster ovary チャイニーズハムスター卵巣 CL Clearance クリアランス C max Maximum serum or plasma (drug) 最高血清 / 血漿中 ( 薬物 ) 濃度 concentration CV Choroidal neovascularization 脈絡膜新生血管 CTAD Sodium citrate, theophyline, adenosine, dipyridamole クエン酸ナトリウム テオフィリン アデノシン ジピリダモール ECG Electrocardiogram 心電図 EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid エチレンジアミン四酢酸 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酵素免疫測定法 ERG Electroretinogram 網膜電図 F Bioavailability バイオアベイラビリティ FA Fluorescein angiography フルオレセイン蛍光眼底造影 FSH Follicle stimulating hormone 卵胞刺激ホルモン GD Gestation day 妊娠日 GGT Gamma-glutamyl transferase ガンマーグルタミルトランスフェラーゼ GLP Good laboratory practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準 hrf Human rheumatic factor ヒトリウマチ因子 HRP Horse radish peroxidase 西洋ワサビペルオキシダーゼ HUVEC Human umbilical vein endothelial ヒト臍帯静脈内皮細胞 cells IC 50 Concentration inducing 50% of inhibition 50% 阻害濃度

5 2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 5 of 略語 英語名称 日本語名称 ICH International conference on 日米 EU 医薬品規制調和国際会議 harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use Ig Immunoglobulin 免疫グロブリン IM Intramuscular 筋肉内 IOP Intraocular pressure 眼圧 IP Intraperitoneal 腹腔内 IU International unit 国際単位 IVT Intravitreal 硝子体内 IV Intravenous 静脈内 K D (Equilibrium) Dissociation 解離定数 constant LH Luteinizing hormone 黄体形成 ( 化 ) ホルモン LLOQ Lower limit of quantitation 定量下限 LOAEL Lowest observable adverse effect 最小毒性量 level LYO lyophilized 凍結乾燥剤 MRT Mean residence time 平均滞留時間 OAEL o observed adverse effect level 無毒性量 OIR Oxygen-induced retinopathy 酸素誘発虚血性網膜症 PEG Polyethylene glycol ポリエチレングリコール PDGF Platelet-derived growth factor 血小板由来増殖因子 PlGF Placental growth factor 胎盤増殖因子 PS20 Polysorbate 20 ポリソルベート 20 SC Subcutaneous 皮下 SCID Severe combined immunodeficiency 重症複合免疫不全 Sprague Dawley - S.D. Standard deviation 標準偏差 t 1/2 Terminal elimination half-life 終末相における消失半減期 TK Toxicokinetics トキシコキネティクス T max Time to reach maximum (serum/plasma) concentration 最高 ( 血清 / 血漿中 ) 濃度到達時間 VEGF Vascular endothelial growth factor 血管内皮増殖因子 VEGFR Vascular endothelial growth factor 血管内皮増殖因子受容体 receptor V ss Volume of distribution at steady state 定常状態における分布容積

6 2..1 緒言 Bayer Yakuhin, Ltd. Page of 参考文献一覧 1) Takahashi H et al., Clin Sci 2005:109: ) Alitalo K et al., Cancer Cell 2002:1: ) Miller JW et al., Diabetes Metab Rev 1997:13: ) Saishin Y et al., J Cell Physiol 2003:195: ([ 参考 ] 参照 ) 5) Kwak et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2000:41: ) Krzystolik MG et al., Arch Ophthalmol 2002:120: ) Aiello LP et al., Proc atl Acad Sci USA 1995:92: ) Qaum T et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2001:42: ) Carmeliet P et al., at Med 2001:7: ) Rakic JM et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2003:44: ) Holash J et al., Proc atl Acad Sci USA 2002:99: ) Cursiefen C et al., J Clin Invest 2004:3: ([ 参考 ] 参照 ) 13) Cao J et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2010:51: ([ 参考 ] 参照 )

7 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 1 of 薬理試験の概要文の目次 まとめ 効力を裏付ける試験 In vitro における作用 VEGF Trap と VEGF ファミリー関連リガンドの結合 HUVEC における VEGF-A 15 依存性受容体リン酸化の阻害作用 VEGF 誘発カルシウム動員の阻害作用 VEGF Trap の補体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害作用 In vivo における作用 マウスにおける脈絡膜新生血管及び VEGF 誘発血液網膜関門破綻に対する VEGF Trap の抑制作用 網膜下マトリゲルモデルラットにおける VEGF Trap による CV の形成抑制 CV の退行 並びに CV に付随する炎症及び線維化の抑制 サルにおける VEGF Trap による実験的 CV の形成抑制並びに既存の活動性病変の血管漏出の速やかな抑制 VEGF Trap 投与による糖尿病ラットにおける網膜血管漏出の改善 VEGF Trap による網膜虚血マウスにおける病的な血管新生の抑制 VEGF Trap による角膜傷害マウスにおける炎症及び血管新生の抑制 副次的薬理試験 正常及び担癌マウスにおける遊離型 VEGF Trap 及び VEGF Trap 複合体の濃度 並びに抗腫瘍効果との相関性 安全性薬理試験 中枢神経系 心血管機能 げっ歯類における血圧に及ぼす VEGF Trap の影響 : 遊離型 VEGF Trap の血中濃度との相関性 カニクイザルにおける心血管機能に及ぼす VEGF Trap の影響 血栓形成 呼吸機能... 2

8 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 2 of 創傷治癒 薬力学的薬物相互作用 考察及び結論 図表 参考文献一覧... 54

9 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 3 of 薬理試験の概要文 まとめ 血管内皮増殖因子 (VEGF) は 眼血管新生など血管新生を特徴とする様々な疾患を初めとして 生理的及び病的な新生血管の形成に重要な役割を果たしている 1) また 病的新生血管において VEGF は血管透過性の亢進や浮腫を誘発することも知られている 2) VEGF Trap( アフリベルセプト ) は 血管内皮増殖因子受容体 -1(VEGFR-1) の第 2 Ig ドメインと血管内皮増殖因子受容体 -2(VEGFR-2) の第 3 Ig ドメインを ヒト免疫グロブリン G1 (IgG1) の定常領域 (Fc) に融合させた組換えたん白質である VEGF Trap は分子量 97 キロダルトン (kda) のたん白質に % 程度の糖鎖が付加された 総分子量 5kDa の二量体糖たん白質である チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)K1 細胞で発現させた組換え VEGF Trap を ろ過及びクロマトグラフィーで精製し 硝子体内投与 (IVT) 用に製剤化した VEGF Trap-Eye を製造する VEGF Trap はヒト VEGF に対し高い親和性を有しており VEGF-A 15 及び VEGF-A 121 各アイソフォームに対する解離定数 (K D) はそれぞれ 0.5pM 及び 0.3pM である VEGF Trap は VEGF に結合して複合体を形成することにより VEGF とその細胞表面受容体との相互作用を阻害する ヒト胎盤増殖因子 -2(PlGF-2) 及び VEGF-B も VEGFR-1 のリガンドであるが VEGF Trap は PlGF- 2(K D:39pM) 及び VEGF-B(VEGF-B (10-108) の K D:1.92pM) に対しても高親和性で結合する ( 表 VGFT-MX VGFT-MX-01 参照 ) VEGF Trap は VEGF による血管透過性亢進及び血管新生を阻害することが非臨床薬理試験において示されている In vitro において VEGF Trap はヒト ウサギ ラット及びマウスの VEGF-A に高親和性で結合し ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) の VEGF 誘発による受容体リン酸化及びカルシウム動員を阻害する In vivo においては 既報の成績 3,4,5) や後述のとおり VEGF Trap の全身又は硝子体内 (IVT) 投与で 異常な血管漏出及び病的な血管新生が効果的に抑制され 脈絡膜新生血管 (CV) 糖尿病網膜症 虚血性網膜症及び角膜傷害などの眼性血管疾患の動物モデルに付随する炎症性反応が回復した 特に サルのレーザー誘発 CV モデルにおいて既に形成されている脈絡膜病変部位の血管漏出が VEGF Trap 単回硝子体内投与により 速やかに回復した また マトリゲル網膜下投与により誘発した CV ラットモデルにおいて VEGF Trap は新生血管の退行を促進することが示された VEGF Trap は全身投与でも 病的血管新生や血管漏出を伴う他の in vitro 及び in vivo モデル 例えば 乾癬 ) 角膜移植拒絶 7) 及び腫瘍増殖 8) などのモデルにおいて 薬理効果を発揮することが確認されている 腫瘍の同種又は異種移植マウスモデルを用いた用量反応性試験において 腫瘍増殖を著明に抑制するのに必要な VEGF Trap の皮下投与量は 2.5mg/kg( 週 2 回 ) 以上であった 8) 効果が認められた投与量における血中 遊離型 ( 非結合型 )VEGF Trap 濃度は 投与期間中 VEGF Trap 複合体の最大濃度 (1~2μg/mL) を超えるレベルで維持されていた VEGF は 血管の様々な病態に関わるほかに 血圧調節にも関与することが知られており VEGF 阻害作用を有する薬剤を その薬理効果を示す用量で全身投与すると VEGF 阻害剤のクラスエフェクトとして血圧上昇がみられることが知られている 9,10) VEGF Trap も同様に げっ歯類への単回皮下投与で 収縮期血圧と拡張期血圧に用量に相関した上昇が認められた ラットでは 0.5mg/kg 以上で血圧の用量比例的な上昇がみられ 10mg/kg 以上で最大上昇値 15~20mmHg に達した 血圧上昇の持続期間は作用用量範囲 (0.5~25mg/kg) で用量に応じて延長し また遊

10 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 4 of 54 離型 VEGF Trap の血漿中濃度と相関していた 血中の遊離型 VEGF Trap 濃度がおよそ 1μg/mL を下回ると血圧はベースラインレベルに回復した サルにおける VEGF Trap の反復皮下投与又は静脈内投与時の安全性薬理エンドポイントを評価した結果 中枢神経系又は心電図 (ECG) パラメータに影響は認められなかった ウサギを用いた電気的傷害誘発血栓症モデルにおいて VEGF Trap は 30mg/kg までの反復静脈内投与で静脈及び動脈血栓形成に影響を及ぼさなかった ラットにおける VEGF Trap 250mg/kg までの単回静脈内持続投与により 呼吸機能パラメータに影響は認められなかった しかしながら ウサギの切開創及び切除創モデルにおいて VEGF Trap は反復静脈内投与により 検討したすべての用量 (0.3~30mg/kg) で創傷治癒を抑制した いずれの動物モデルでも 創傷治癒パラメータに対する VEGF Trap の影響はおおむね用量依存的で 0.3mg/kg 投与群では投与初期の観察時点で軽微な抑制がみられた 一方 3 及び 30mg/kg 投与群では創傷治癒の抑制はより顕著で 試験期間中持続した このように 高用量投与群で創傷治癒のより強くかつ持続的な抑制がみられたが これは遊離型 VEGF Trap の平均血漿中濃度と相関しており 投与後すべての評価時点で遊離型 VEGF Trap 濃度が VEGF Trap 複合体濃度よりも高かった これに対して 0.3mg/kg 投与群では遊離型 VEGF Trap の平均血漿中濃度は一時的に VEGF Trap 複合体濃度を上回ったのみであった 上記のように VEGF Trap が血圧 創傷治癒及び腫瘍増殖に及ぼす影響は 眼内の病的な血管新生及び血管漏出を阻害するのに必要な VEGF Trap 硝子体内投与量を大きく上回る投与量を全身投与したときに認められる そのような影響が生じ得る投与量 ( 全身投与 ) における血中遊離型 VEGF Trap 濃度は 臨床試験で硝子体内投与後に予想される濃度 あるいはサルの VEGF Trap 硝子体内投与 ( 体重補正 ) 後の濃度 ( 表 ) をはるかに上回る濃度 (1~2μg/mL 以上 ) に達している したがって VEGF Trap 硝子体内投与は 眼外組織において VEGF が介在する生物学的作用のプロセスには意味のある影響を及ぼさないと考えられる

11 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 5 of 効力を裏付ける試験 VEGF-A( 単に VEGF として記される場合もある ) は VEGF/PDGF( 血小板由来増殖因子 ) 遺伝子ファミリーの一つであり 正常な血管形成や様々な病態において 血管透過性亢進及び血管新生を誘導する その他の VEGF ファミリーには VEGF-B VEGF-C VEGF-D VEGF-E 及び PlGF などがある VEGF-A は主に 2 つの膜貫通型の受容体型チロシンキナーゼ VEGFR-1 及び VEGFR-2 に結合し 活性化することで作用を発揮する 3 つめの関連する受容体 VEGFR-3 は主にリンパ管形成の調節に関与しているが この受容体には主に VEGF-C 及び VEGF-D が結合し VEGF-A の結合は弱い ) VEGF-A は主として VEGFR-2 を介したシグナル伝達により 血管内皮に作用を及ぼすと考えられている 1) VEGFR-2 がリガンドを介して二量体を形成することにより受容体が自己リン酸化され ホスファチジルイノシトール 3' キナーゼ /Akt などの経路を介してシグナルが下流に伝達される VEGFR-2 は主に血管内皮細胞の細胞表面に存在しており 細胞の生存 遊走や増殖に重要な役割を果たしている VEGF-A は当初 内皮のバリア機能を低下させ 様々な病態において水や高分子を血管外へ滲出させる血管透過性因子として発見された 2) VEGFR-1 は VEGF-A やその類縁分子である PlGF 及び VEGF-B にも結合する VEGFR-1 の VEGF-A に対する親和性は VEGFR-2 よりも高いが 同様の条件下で比較すると VEGF-A を介した VEGFR-1 の自己リン酸化は VEGFR-2 よりも弱い VEGFR-1 活性化が血管内皮で弱いことは VEGFR-1 の直接的な血管透過性亢進作用及び血管新生作用が弱いことと一致する 12) しかし VEGFR-2 とは異なり VEGFR-1 は内皮前駆細胞のほか ある種の周細胞 平滑筋細胞や白血球など内皮細胞以外の様々な細胞にも発現している 特に VEGF 及び PlGF は 様々な病態で白血球 特に単球の強力な化学走化性因子及び活性化因子として機能する したがって 内皮細胞への直接作用による血管新生と血管透過性亢進に加え VEGF と PlGF は血管の構造及び機能の調節に関与する様々な細胞に対して VEGFR-1 を介して作用を及ぼすことが可能である 12) PlGF は VEGF と異なり 正常な血管形成には重要な役割を担っていないと考えられているが 様々な病態において病的な血管新生や血管漏出を惹起することが知られている 13,14) また VEGF と同様 PlGF はヒトの CV 膜中に存在し 動物での実験的 CV 形成に寄与していることが確認されている 15) さらに VEGF-B も動物モデルにおいて 網膜及び脈絡膜での血管新生や血液網膜関門の破綻に関与することが報告されている 1) VEGF Trap は ヒト VEGFR-1 の第 2 Ig ドメインとヒト VEGFR-2 の第 3 Ig ドメインを ヒト IgG1 の定常領域に融合した組換えたん白質である VEGF Trap は VEGF-A に強く結合することで VEGF-A とその受容体との相互作用を阻害し VEGF-A の生物学的作用を抑制する また VEGF Trap は他の VEGFR-1 リガンドである PlGF にも結合する VEGF Trap のリガンド結合特性を明らかにし VEGF 受容体を発現しているヒト血管内皮細胞を用いて VEGFR-2 の VEGF 依存性リン酸化に及ぼす VEGF Trap の影響を検討した また 眼性血管疾患の様々な動物モデルを用いて 病的な血管漏出及び血管新生に対する VEGF Trap の効果を検討した

12 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page of In vitro における作用 VEGF Trap と VEGF ファミリー関連リガンドの結合 参照項目 : VGFT-MX VGFT-MX VGFT-MX-01 [ 参考 ] Papadopoulos manuscript Oct VEGF Trap はヒト VEGF-A 15 及びヒト PlGF-2 と高親和性で結合する組換え融合たん白質である ヒト由来の VEGFR-1 に結合し得るヒト VEGF/PlGF リガンドファミリーの他のアイソフォーム ( 例えばヒト VEGF-A 121 ヒト PlGF-1 など ) も VEGF Trap に結合することが確認されている さらに VEGF Trap はマウス ラット ウサギなどのヒト以外の動物種の VEGF 及び PlGF に対しても同等の親和性で結合することから これらの動物種を用いて非臨床薬理試験及び毒性試験を実施することが可能である なお カニクイザル VEGF-A に対する VEGF Trap の結合親和性については検討していないが サルの VEGF-A のアミノ酸配列はヒトと同一であることから ヒト及びサルの VEGF-A と VEGF Trap の結合作用に差はほとんどないと考えられる VEGF Trap と VEGF ファミリーの 12 のリガンドとの結合について検討するため 表面プラスモン共鳴法 (BiaCore 法 ) を用いて解離定数 (K D) を求めた リガンドには ヒト VEGF-A 15 ヒト VEGF-A 121 ヒト PlGF-1 ヒト PlGF-2 ヒト VEGF-B (10-108) ヒト VEGF-C ヒト VEGF-D マウス VEGF-A 14 マウス VEGF-A 120 マウス PlGF-2 ラット VEGF-A 14 及びウサギ VEGF-A 15 を用いた BiaCore 法による測定は デキストラン被覆チップ (CM-5) を使用した BiaCore 3000 又は 2000 装置を用いて実施した アミンカップリング法を用いて Protein A を CM-5 チップにカップリングさせた VEGF Trap の結合親和性を BiaCore 法を用いて測定するため まずアミンカップリングさせた Protein A の表面に VEGF Trap(0.25μg/mL) を注入した (100μL/ 分 ) 後 さらに VEGF Trap の表面に様々な濃度の VEGF ファミリーのリガンドを注入した (50 又は 100μL/ 分 ) 得られたデータは Scrubber 2 software を用いて処理し Biaevaluation 4.1 software により解析した VEGF Trap は 検討した 12 リガンド中 10 のリガンドに対し特異的に結合した 一方 ヒト VEGF-C 及びヒト VEGF-D に対しては測定可能なレベルの結合を示さなかった また VEGF Trap はヒト マウス ラット ウサギ由来の VEGF-A に対して 高親和性 (K D 値は 1pM 未満 ) で結合した また ヒト及びマウス PlGF に対しても VEGF Trap は高親和性を示した リガンドと VEGF Trap の結合に対する K D 値を表 に示す ( 参照 )

13 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 7 of 54 表 VEGF Trap と VEGF ファミリー関連リガンドの結合 (BiaCore 法 ) に関するパラメータ Ligand ka (M -1 s -1 ) kd (s -1 ) K D (pm) Human VEGF-A x x Human VEGF-A x x Human PlGF x10.81x Human PlGF-1.73 x10 2.4x Murine VEGF-A x x Murine VEGF-A x x Murine PlGF-2 1.4x x Rat VEGF-A x x Rabbit VEGF -A x x Human VEGF-B (10-108) 3.52 x x Human VEGF-C B 1. B B Human VEGF-D B B B Abbreviations used: ka = Association rate constant, kd = Dissociation rate constant, K D = Equilibrium dissociation constant. 1. B= no detectable binding HUVEC における VEGF-A 15 依存性受容体リン酸化の阻害作用 参照項目 : VGFT-MX-0801 ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) は VEGF 受容体を発現していることから 外因性 VEGF の添加により in vitro にて培養し増殖を誘導することができる HUVEC を用いて VEGF Trap の VEGF-A 15 依存性 VEGFR-2 リン酸化阻害能を評価した ヒト VEGF-A 15(1nM) を様々な濃度の VEGF Trap( nM) とインキュベートした後 HUVEC に添加して VEGFR-2 のチロシンリン酸化を誘導した HUVEC に添加してインキュベートした後 HUVEC を溶解し 抗 VEGFR-2 抗体を用いて免疫沈降した 得られた抗体 -VEGFR-2 複合体を用いて S ゲル電気泳動を実施した 電気泳動後 たん白を PVDF 膜に転写し マウスの抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体を添加した 次に HRP 標識したヤギの抗マウス抗体とインキュベートした後 リン酸化 VEGFR 2 を ECL(enhanced chemiluminescence) 検出システムにより可視化した VEGF Trap の濃度が VEGF-A 15 濃度に対し化学量論比以下 ( モル比 1:1 以下 ) では 遊離型 ( 非結合型 )VEGF-A 15 により受容体リン酸化が誘導されるが モル比が 1:1 以上では 受容体リン酸化の阻害が認められた ( 参照 )

14 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 8 of VEGF 誘発カルシウム動員の阻害作用 参照項目 : VGFT-MX-0801 HUVEC を用いて ヒト VEGF-A 15 と VEGFR-2 の結合及びその後のカルシウム動員の活性化に対する VEGF Trap の抑制能について検討した 独立した 3 試験において 50pM の VEGF-A 15 により誘導されるカルシウム動員に対する VEGF Trap の抑制能について検討した Fluo-4( カルシウムインジケーター ) で標識した HUVEC に VEGF Trap(54.9pM-40nM) を添加し さらに VEGF 15(50pM) を添加しカルシウム動員を刺激した 細胞における蛍光強度変化は FlexStation(Molecular Devices 社 ) を用いて発光波長 525nm で記録し データは各種濃度の VEGF Trap の平均ピーク蛍光強度を用いて解析した VEGF Trap はカルシウム動員を効果的に抑制し 細胞内カルシウム動員を 50% 抑制する濃度 (IC 50) は 1.2~1.7nM であった ( 参照 ) VEGF Trap の補体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害作用 参照項目 : VGFT-MX VEGF Trap の作用における Fc 介在性エフェクター機能の役割を検討するために 数種の細胞アッセイを用い 補体依存性細胞傷害 (CDC) 作用及び抗体依存性細胞傷害 (ADCC) 作用を検討した ADCC: 初代培養 HUVEC 及び腫瘍細胞株 ( 肺癌 Calu 大腸癌 DLD 1 線維肉腫 HT1080 類表皮癌 A431 細胞株 ) と様々な濃度の VEGF Trap( 最終濃度 0.85pM~50nM)[± ヒト VEGF-A 15 (10nM)] をインキュベートした さらに エフェクター細胞としてヒト末梢血リンパ球を添加し インキュベートした 細胞溶解性は 培養液中に放出された LDH (lactate dehydrogenase) を測定することにより評価した CDC: 様々な濃度に VEGF Trap を希釈し ( 最終濃度 0.85pM~50nM) ADCC アッセイと同様の標的細胞に添加した [± ヒト VEGF-A 15(10nM)] さらに 補体を含むヒト正常血清を添加し インキュベートした 細胞の生存を alamarblue 蛍光色素により検出した VEGF Trap(0.85pM~50nM)[±VEGF-A 15(10nM)] は 初代培養 HUVEC 及び腫瘍細胞株 ( 線維肉腫 HT1080 肺癌 Calu- 大腸癌 DLD-1 類表皮癌 A431 細胞株 ) のいずれにおいても ADCC 作用を示さなかった 同様に VEGF Trap(0.85pM~50nM)[±VEGF-A 15(10nM)] は 初代培養 HUVEC 及び腫瘍細胞株 ( 線維肉腫 HT1080 肺癌 Calu- 大腸癌 DLD-1 類表皮癌 A431 細胞株 ) のいずれにおいても 本アッセイの陽性対照であるリツキシマブ ( 抗 CD20 IgG1 抗体 ) が CD20 抗原を発現するバーキットリンパ腫由来 Daudi 細胞に殺細胞作用を示す条件下で CDC 作用を誘発しなかった ( 参照 ) 以上の結果より VEGF Trap は in vivo において CDC 作用及び ADCC 作用のいずれも発揮しないと考えられることから in vivo における VEGF Trap の作用は VEGF Trap が VEGF 又はその他の VEGFR リガンドに結合し リガンドの受容体への結合を妨げることにより発揮されていると考えられる 細胞アッセイにおける VEGF Trap の作用について 表 にまとめる

15 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 9 of 54 表 In vitro における VEGF Trap の作用 Cellular assay VEGF Trap activity Location in CTD Study number Human VEGF-A 15 (1 nm) dependent VEGFR2 phosphorylation Human VEGF-A 15 (50 pm) induced calcium mobilization Complement-dependent cytotoxicity (VEGF Trap (0.85 pm to 50 nm) ± 10nM human VEGF-A 15) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (VEGF Trap (0.85 pm to 50 nm) ± 10 nm human VEGF-A 15) Abbreviation: IC 50 = Concentration inducing 50% of inhibition. Complete inhibition at an equimolar concentration of VEGF Trap (1 nm) VGFT-MX-0801 Inhibition IC 50 = nm VGFT-MX-0801 o effect VGFT-MX o effect VGFT-MX In vivo における作用 非臨床試験に加えて 臨床試験や疫学的データからも VEGF Trap-Eye が滲出型 ( 新生血管 ) 加齢黄斑変性 (AMD) 及び糖尿病網膜症やその他の虚血性網膜症などの眼性血管疾患の治療薬になり得ることを支持する根拠が示されている このような眼性血管疾患では 2 つの共通する特徴 すなわち 血管漏出に伴って二次的に生じる網膜浮腫と異常血管の増殖がみられる 異常な血管透過性亢進及び血管新生に対する VEGF Trap の抑制効果を様々な眼性血管疾患動物モデルを用いて検討した VEGF Trap は 遺伝子導入による VEGF の過剰発現マウス 又は外因性 VEGF 硝子体内投与マウスにおける網膜の血管漏出を抑制し 糖尿病モデルラットにおいて網膜血管透過性を正常化することが確認された また VEGF Trap はげっ歯類及びサルの脈絡膜新生血管 (CV) モデル マウス酸素誘発虚血性網膜症モデル及び縫合糸誘発角膜血管新生モデルで血管新生を抑制した 特に サルのモデルでは レーザー傷害の 15 日後に VEGF Trap を単回硝子体内 (IVT) 投与した結果 活動性 CV 病変における血管漏出が速やかに回復した これらすべての試験において VEGF Trap の全身あるいは硝子体内投与により 血管透過性及び血管新生が効果的に抑制され 評価部位に付随する炎症も著明に改善した マウスにおける脈絡膜新生血管及び VEGF 誘発血液網膜関門破綻に対する VEGF Trap の抑制作用 参照項目 :[ 参考 ] J Cell Physiol 動物は AMD そのものは発症しないが レーザー照射によりブルッフ膜とその上に重なる網膜色素上皮に局所的な損傷を起こすことによって 滲出型 AMD でみられるような脈絡膜新生血管病変を形成させることができる この損傷は 網膜色素上皮層と網膜下腔へ向かう脈絡毛細血管の異常増殖を刺激する ブルッフ膜の損傷は 滲出型 AMD を含むすべての CV の病態に共通してみられる特徴である

16 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 10 of 54 レーザー傷害誘発 CV マウスモデルにおいて C57BL/ マウス ( 成熟 ) の片眼に VEGF Trap (4.92μg) を もう一方の眼に対照のたん白質としてヒト Fc(hFc 4.92μg) をレーザー傷害後直ちに単回硝子体内投与した 投与後 14 日目にマウスを麻酔し フルオレセイン標識デキストランで灌流した後 両眼を摘出して組織学的な評価を行った CV 病変の大きさは脈絡膜フラットマウントの画像解析により測定した VEGF Trap を硝子体内投与したマウスでは hfc を硝子体内投与したマウスと比較して CV 病変面積が小さかった ( 図 ) 高用量の VEGF Trap(25mg/kg) を皮下投与した試験においても hfc を皮下投与した対照群と比較して レーザー傷害マウスモデルの CV 病変の面積は小さかった ( 図 参照 ) 図 レーザー傷害誘発 CV マウスモデルにおける VEGF Trap 単回硝子体内投与後の CV 病変に対する抑制作用 C57BL/ マウス ( 成熟 ) の片眼に VEGF Trap(4.92μg) を もう一方の眼に hfc(4.92μg) をレーザー照射後直ちに硝子体内投与した 投与 14 日目に フルオレセイン標識デキストランで灌流した後 CV 面積を測定した VEGF Trap を投与した眼 (54 傷害部位 /19 眼 ) では hfc を投与した眼 (44 傷害部位 /19 眼 ) と比較して 画像解析により測定した CV 面積が有意に小さかった (P< Student s two-tailed t-test)

17 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page of 54 図 レーザー傷害誘発 CV マウスモデルにおける VEGF Trap 皮下投与後の CV 病変に対する抑制作用 C57BL/ マウス ( 成熟 ) に レーザー照射により片眼当たり 3 ヵ所にブルッフ膜の損傷を誘発した レーザー照射前 レーザー照射後 及び 日目に マウスに 25mg/kg の VEGF Trap 又は hfc を皮下投与した VEGF Trap を投与したマウス (52 傷害部位 /20 眼 ) では hfc を投与したマウス (57 傷害部位 /20 眼 ) と比較して 画像解析により測定した CV の平均面積が有意に小さかった (P< Student s two-tailed t-test) VEGF 誘発血液網膜関門破綻に対する VEGF Trap の抑制効果を評価するため 2 種類のマウスモデルを用いて追加試験を実施した 最初の試験では マウスに VEGF Trap(25mg/kg) 又は hfc を皮下投与し 翌日 10 - M の組換えヒト VEGF 1μL を硝子体内投与した 投与後 時間に網膜の血管透過性を [ 3 H] マンニトールをトレーサーとして評価した VEGF Trap を投与したマウスでは 対照と比べて網膜対肺の漏出比が有意に減少し 血液網膜関門機能の改善が示された ( 図 参照 ) 続く試験では ドキシサイクリンで誘導可能なロドプシンプロモーターの制御下で 光受容体に導入した VEGF 遺伝子が発現されるよう設計したトランスジェニックマウスを用いた (rhovegf マウス ) VEGF の過剰発現を誘導するため rhovegf マウスの飲水にドキシサイクリンを加え ドキシサイクリン投与の 1 日前及び 2 日後に VEGF Trap 又は対照のたん白質である hfc を同様に皮下投与した 2 回目の VEGF Trap 投与 1 日後に [ 3 H] マンニトールをトレーサーとして網膜血管透過性を測定した 本試験においても 同量の hfc を投与した対照群のマウスと比較して VEGF Trap 投与マウスでは VEGF 誘発血液網膜関門の破綻が抑制されることが示された ( 図 参照 )

18 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 12 of 54 図 マウスにおける VEGF Trap 皮下投与後の VEGF 誘発血液網膜関門破綻に対する抑制作用 C57BL/ マウス ( 成熟 ) に 25mg/kg の VEGF Trap 又は hfc を皮下投与し 翌日 1μg(10 - M) の VEGF を硝子体内投与した 投与後 時間に網膜の血管透過性を [ 3 H] マンニトールをトレーサーとして評価した VEGF Trap を投与したマウス (9 匹 18 眼 ) では hfc を投与したマウス (9 匹 18 眼 ) と比較して網膜対肺の漏出比が有意に減少し 血液網膜関門機能の改善が示された 図 VEGF 過剰発現マウスにおける VEGF Trap 皮下投与後の VEGF 誘発血液網膜関門破綻に対する抑制作用 ドキシサイクリンで網膜での VEGF の発現を誘発したトランスジェニックマウスに 25mg/kg の VEGF Trap 又は hfc をドキシサイクリン投与の 1 日前及び 2 日後に皮下投与し [ 3 H] マンニトールを指標に血管透過性を測定した VEGF Trap を投与したマウス (10 匹 20 眼 ) では hfc を投与したマウス (10 匹 20 眼 ) と比較して網膜対肺の漏出比が有意に減少した

19 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 13 of 網膜下マトリゲルモデルラットにおける VEGF Trap による CV の形成抑制 CV の退行 並びに CV に付随する炎症及び線維化の抑制 参照項目 :[ 参考 ] Invest Ophthalmol Vis Sci Sprague-Dawley 系成熟ラットに 33G 針を用いて 75% のマトリゲル溶液を網膜下に投与し CV を誘発した 本モデルでは マトリゲル投与後 4 日目に新生血管の伸展がみられ 10 日目までにはマトリゲル投与領域に脈絡膜毛細血管から伸長した血管網が広範に形成される VEGF Trap が本モデルの CV 形成を抑制するかどうかを検討するために VEGF Trap(12.5mg/kg) をマトリゲル投与後 2 日目及び 日目に皮下投与した 対照群の動物には ほぼ等モルの hfc( 分子量 58kDa).25mg/kg を対照たん白質として皮下投与した 10 日目に動物を安楽死させ 蛍光色素 (DiI) を投与して血管を視覚化し CV 範囲を定量した 対照群ではすべての眼に高度の CV 形成が認められた (CV の面積 :2.35± μ m 2 平均値 ± 標準偏差 n=12) が VEGF Trap 投与群では CV 形成は全く認められなかった (CV の面積 :0± μm 2 n=12)( 参照 ) また マトリゲル投与後 10 日間 CV を形成させ 一方の群の眼を摘出し治療前の CV のベースラインとした 残りの動物に VEGF Trap(12.5mg/kg) 又は等モル濃度の hfc(.25mg/kg) を 及び 1 日目に皮下投与した マトリゲル投与後 20 日目に眼を摘出し CV を評価した マトリゲル投与後 10 日目ですべての眼に CV が認められ 20 日目では hfc 投与群の CV の形成範囲は拡大した 一方 VEGF Trap 投与群の CV の面積 (37.10± μm 2 n=14) は 10 日目の治療前対照群の面積 (244.50± μm 2 n=1) の 15% にとどまり 14 例中 例の眼には CV が全く認められなかった 以上の結果から VEGF Trap は 10 日目から 20 日目の間に新たに生じる CV を抑制するのみでなく 既に形成された CV 病変も退行させることが示された 同じ処置を施した動物から作製した眼の切片をヘマトキシリン エオジン染色した結果 20 日目の網膜下病変部位の総容積 ( 血管及び血管以外のすべての構成要素 ) は hfc 投与群 (7.5± μm 3 n=8) と比較して VEGF Trap 投与群 (2.0± μm 3 n= 10) で明らかに小さく ヘマトキシリン エオジン染色された細胞含有量も少なかった 一連の切片におけるビメンチン 平滑筋アクチン及び CD45 の免疫染色でも hfc 投与群と比較し VEGF Trap 投与群の病変部位では 筋線維芽細胞及び白血球は少なく また網膜下病変のコラーゲン沈着も著明に減少していることがマッソントリクローム染色により確認された ( 表 ) これらの結果は VEGF Trap がマトリゲルの網膜下沈着による CV 形成を抑制するのみでなく 異所性の新生脈絡膜血管の退行も誘導することを示している さらに VEGF Trap は筋線維芽細胞及び炎症性細胞の網膜下病変部位への浸潤も抑制した ( 参照 )

20 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 14 of 54 表 CV 病変における CD45 ビメンチン αsma 及びトリクローム染色の半定量的解析 Stain Type Day 10 Matrigel* Day 20 Matrigel + hfc* Day 20 Matrigel + VEGF Trap* P value Day 10 vs Day 20 hfc P value Day 20 hfc vs Day 20 VEGF Trap CD ± ± ± 0.49 <0.01 <0.05 Vimentin 3.75 ± ± ± 0.45 <0.05 <0.05 αsma # 3.42 ± ± ± 0.35 >0.05 <0.001 Trichrome 2.50 ± ± ± 0.33 <0.01 <0.05 半定量的解析 : 各染色の範囲及び強度について 独立した 2 名の観察者がスコア ( 代表的な切片において スコア 0 を 染色なし スコア を 最も広範囲で濃い染色 とみなした スケール 0- のスコア ) により盲検下で評価した * Mean ± (n=) Kruskal-Wallis test and Dunn test. # αsma = α smooth muscle actin サルにおける VEGF Trap による実験的 CV の形成抑制並びに既存の活動性病変の血管漏出の速やかな抑制 参照項目 : VGFT-TX 成熟カニクイザルを用いて レーザー誘発 CV に対する VEGF Trap 投与の効果について検討した サルの網膜に細く強力なレーザーを 9 ヵ所照射し 形成される活動性 CV 病変をフルオレセイン蛍光眼底造影 (FA) により 照射前 1 回 並びに照射後 及び 29 日目に評価した 予防効果試験では VEGF Trap をレーザー傷害の 1 週間前から静脈内投与 (3 又は 10mg/kg 週 1 回 ) 又は硝子体内投与 ( 又は 500μg 2 週間に 1 回 ) した 治療効果試験では 活動性 CV が既に形成されているレーザー傷害後 2 週間目に VEGF Trap を単回硝子体内投与 (500μ g) した 対照群のサルにはプラセボをレーザー傷害の 1 週間前から週 1 回静脈内投与又は 2 週間に 1 回硝子体内投与した 各群には それぞれ 匹 ( 雄 3 匹 / 雌 3 匹 ) の動物を割り当てた CV 病変を FA により視覚化し 盲検下で評価者によりグレード 1( 過蛍光なし ) からグレード 4 ( レーザー照射部位の境界を越えて広がる後期漏出と鮮明な過蛍光 ) に分類した プラセボを硝子体内又は静脈内投与した群では レーザー傷害後 15 日目に活動性 CV 病変 ( グレード 4) がレーザー傷害部位のそれぞれ 32.4% 及び 45.4% に認められた ( 表 ) 一方 VEGF Trap を静脈内又は硝子体内投与した群では グレード 4 の病変は全くあるいはほとんど形成されなかった さらに 活動性 CV 病変形成後に VEGF Trap(500μg) を単回硝子体内投与すると 投与後 2 週間でグレード 4 の病変の割合が 44% から 0% に低下した ( 表 及び図 ) VEGF Trap 硝子体内投与の忍容性は良好であり 前眼部及び硝子体に炎症性細胞は全く認めないか 又は認めたとしても微量 (trace~1+) であった ( 参照 )

21 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 15 of 54 表 サルのレーザー傷害後 及び 29 日における各群のグレード 4 の割合 Group Day 15 Day 20 Day 29 Intravenous Prevention Placebo (0 mg/ml, 4.78 ml/kg) mg/kg (0.9 mg/ml, 4.35 ml/kg) mg/kg (2.09 mg/ml, 4.78 ml/kg) Intravitreal Prevention Placebo (0 mg/ml, 0.05 ml/eye) µg/eye (1 mg/ml, 0.05 ml/eye) µg/eye (10 mg/ml, ml/eye) µg/eye (10 mg/ml, 0.05 ml/eye) $ Intravitreal Regression 500 µg/eye (1 x) (10 mg/ml, 0.05 ml/eye) 予防効果試験では VEGF Trap をレーザー傷害の 1 週間前から静脈内投与 (3 又は 10mg/kg 週 l 回 ) 又は 硝子体内投与 ( 又は 500μg/eye 2 週間に 1 回 ) した 治療効果試験では VEGF Trap をレーザー傷害の 2 週間後に単回硝子体内投与 (500μg) した 両試験の対照群の動物には レーザー傷害の 1 週間前からプラセボを週 1 回静脈内投与又は 2 週間に 1 回硝子体内投与した 投与群及び対照群には それぞれ 匹 ( 雄 3 匹 / 雌 3 匹 ) の動物を割り当てた フルオレセイン蛍光眼底造影 (FA) を用いて CV 病変を視覚化し 盲検下で評価者によりグレード 1( 過蛍光なし ) からグレード 4( レーザー照射部位の境界を越えて広がる後期漏出と鮮明な過蛍光 ) に分類した 上表は 評価の各時点 ( レーザー傷害後 及び 29 日目 ) における臨床的に重度 ( グレード 4) と判断された投与群及び対照群の病変の割合 ( 平均値 ) を示す $ この増加は投与群 1 匹の両眼のみにみられたグレード 4 の病変に起因した なお 当該動物でみられた異常 反応の原因は不明であった

22 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 1 of 54 Day 15 Day 20 Day µg-single Placebo 図 形成されたグレード 4 病変に対する VEGF Trap 硝子体内投与の治療効果 IVT 治療効果試験 : プラセボ ( 反復 ) 又は VEGF Trap( 単回 500μg) 投与群におけるレーザー傷害 15, 20 及び 29 日後の後期フルオレセイン蛍光眼底造影画像を示す プラセボ群 ( 上段 ) の動物では いずれの観察時点においても 9 つの傷害処置部位のほとんどでグレード 4 の血管漏出が認められた VEGF Trap 群 ( 下段 ) では VEGF Trap 投与前である傷害 15 日後では 9 つの傷害部位すべてでグレード 4 の漏出がみられたが 20 日後 (VEGF Trap 投与 5 日後 ) ではグレード 4 は認められなかった 傷害 29 日後でも血管漏出の再発はみられなかった サルにおいて 硝子体内投与後の血漿中遊離型 VEGF Trap 濃度は 静脈内投与後に比べ明らかに低かった ( 表 参照 ) 50μg/eye を硝子体内投与後の血漿中遊離型 VEGF Trap 濃度は 定量下限未満であった 250 及び 500μg/eye 硝子体内投与後の血漿中濃度は用量依存的であり 硝子体内投与後 24 時間で最大濃度に達し 次回投与前には検出限界付近又はそれ以下に低下した 一方 3 及び 10mg/kg 静脈内投与後の血漿中遊離型 VEGF Trap 濃度は すべての測定時点において 500μg/eye 投与後よりも高かった ( 表 参照 ) VEGF Trap 投与による糖尿病ラットにおける網膜血管漏出の改善 参照項目 : VGT-C-007 VEGF の過度の発現が 糖尿病における網膜血管新生と黄斑浮腫の発症に中心的な役割を果たすと考えられている 糖尿病の網膜内で起こり得る変化を検討するため 2 種の動物モデル すなわち糖尿病 ( ストレプトゾトシン処置 ) ラットにおける網膜浮腫 並びにマウス虚血誘発網膜血管新生 ( 参照 ) に対する VEGF Trap の効果を評価した Sprague Dawley 系雄性成熟ラットに 10mM クエン酸緩衝液 (ph4.5) に溶解したストレプトゾトシン (0mg/kg) を単回腹腔内投与することにより糖尿病を誘発した 24 時間後に高血糖が認められない動物は試験から除外した ストレプトゾトシン処置 1 週間後に血糖値を再測定し 糖

23 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 17 of 54 尿病の状態を確認した 糖尿病の発症が確認された動物の片眼に VEGF Trap(3μg/3μL) を単回硝子体内投与し もう一方の眼に対照たん白質の hfc を投与した 投与後 48 時間に エバンスブルー色素 (45mg/kg) を静脈内投与し 2 時間後に網膜の色素濃度を測定して網膜血管透過性を評価した 網膜におけるエバンスブルー色素の平均濃度は 非糖尿病ラットに比較して 糖尿病ラットで約 3 倍上昇した ( 図 ) 一方 VEGF Trap を硝子体内投与した糖尿病ラットでは hfc を硝子体内投与した糖尿病ラットに比べてエバンスブルー色素濃度が有意に減少し 非糖尿病ラットと同程度まで低下した VEGF Trap 硝子体内投与 48 時間後の血中に遊離型 VEGF Trap は検出されなかった また VEGF Trap 硝子体内投与 1 週間後の血管漏出の評価においても 網膜血管透過性の正常化が認められた ( 参照 ) 図 VEGF Trap 硝子体内投与によるストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットの網膜におけるエバンスブルー色素漏出の抑制 雄性成熟ラットにストレプトゾトシンを投与し糖尿病を誘発した 非糖尿病群のラットにはストレプトゾトシンの代わりにクエン酸緩衝液を投与した 糖尿病誘発 1 週間後 片眼に VEGF Trap(3μg/3μL) を単回硝子体内投与し もう一方の眼に対照のたん白質 hfc(3μg/3μl) を投与した 48 時間後にエバンスブルー色素の血管外漏出を指標として網膜血管透過性を評価した VEGF Trap は 糖尿病モデルにおける網膜血管透過性亢進を有意に改善した (unpaired t-test) 図中の値は平均値 ± 標準誤差 VEGF Trap による網膜虚血マウスにおける病的な血管新生の抑制 参照項目 : VGT-C-013 VEGF Trap の抗血管新生作用を 酸素誘発虚血性網膜症 (OIR) のマウスモデルを用いて検討した OIR は 幼若マウスを生後 7 日目から高酸素環境に一時的に曝露することで生じさせた ( 高酸素症 ) 高酸素環境下では 中心網膜内の微小血管系の発達が低下する 幼若マウスを生

24 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 18 of 54 後 12 日目に高酸素環境下から室内の通常酸素環境下に戻すと 網膜が低酸素状態となり 増殖糖尿病網膜症や未熟児網膜症などの虚血性網膜症と同様に血管新生が刺激される 生後 14 日目 ( 室内酸素に戻した 2 日後 ) に VEGF Trap(0.5μg 5mg/mL 100nL/eye) 又は同量の対照たん白質 (hfc) を幼若マウスに単回硝子体内投与し 3 日後 ( 生後 17 日目 ) に網膜を採取した 高酸素に曝露した対照群のマウスの網膜では 内境界膜を貫通する血管のふさ状分岐と 特に視神経乳頭周辺の網膜表面における無秩序な血管の伸長を特徴とする病的な新生血管がみられた これに対して VEGF Trap を投与した群のマウスでは 網膜の病的な新生血管の形成が抑制されていた ( 図 ) この用量 (0.5μg) の VEGF Trap は 中心網膜の無血管領域における血管再生範囲も減少させた 一方 生後 15 日目に低用量 (0.24μg.82mg/mL 20nL/eye) の VEGF Trap を硝子体内投与した群では 病的な網膜血管新生は抑制されたが 正常に血管再生された中心網膜の範囲は生後 19 日目までに拡大した ( 図 )( 参照 ) 結論として 高用量の VEGF Trap による強力な VEGF の阻害は 病的な血管新生を完全に抑制するが 正常な網膜血管の再生も若干遅延させた これに対して 低用量の VEGF Trap は 正常な網膜血管の再生を遅らせることなく むしろ促進する一方 病的な血管新生は抑制した この結果は 病的に形成される血管は正常の血管よりも VEGF 阻害に対して感受性が高いことを示唆している

25 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 19 of 54 図 OIR マウスにおける VEGF Trap 硝子体内投与後の網膜の病的な血管新生及び血管再生 レクチン染色の網膜フラットマウントの画像より 異常な血管を含む網膜の大きさを測定して病的な血管新生の範囲を定量した ( 上段 ) フラットマウントの画像は ikon Eclipse 顕微鏡 Adobe Photoshop 及び Scion Image を使用して取り込んだ 中心網膜の無血管領域も同様の方法で測定した ( 下段 ) VEGF Trap 又は hfc 0.5μg 又は 0.24μg の硝子体内投与の効果をそれぞれ左列及び右列に示す 投与条件盲検下で 評価者がすべての画像を撮影及び解析した (n=4 試験ごとに各治療群で検討した網膜数 ) データは平均値 ± 標準誤差で示し unpaired t-test を用いて解析した (**p<0.01 ***p<0.001 ****p<0.0001) P= 生後日数 VEGF Trap による角膜傷害マウスにおける炎症及び血管新生の抑制 参照項目 :[ 参考 ] J Clin Invest マウスの角膜実質内に留置した縫合糸により誘発した角膜傷害により 高度の血管新生反応がみられる 本モデルでは VEGF-C と VEGF-D による VEGFR-3 の活性化を介して生じるリンパ管新生が 血管新生と同時に生じる 最初の試験では Balb/C マウス ( 成熟 ) に VEGF Trap (12.5mg/kg) 又は同量の対照たん白質 (hfc) を 縫合糸傷害時に単回腹腔内投与し 7 日後に角膜を評価した

26 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 20 of 54 その結果 VEGF Trap を投与したマウスでは hfc 投与マウスとは異なり血管新生のみならず角膜リンパ管新生も完全に抑制されることが明らかになった 4) ( 血管 + リンパ管面積 :VEGF Trap 投与群 2.3±1.5% hfc 投与群 49±12%)( 参照 ) 本モデルでは 血管新生及びリンパ管新生に先行して 血管炎症並びに傷害された角膜への白血球 ( 主にマクロファージと好中球 ) の遊走が生じる VEGF-A や関連リガンドの PlGF は 白血球の細胞表面に存在する VEGFR-1 を介して 白血球の強力な化学走化性因子として機能することが知られている 活性化した白血球は VEGF-C 及び VEGF-D を発現する したがって 局所的に発現が上昇した VEGF-A や PlGF による白血球の傷害部位への遊走を VEGF Trap が抑制することにより VEGF Trap は間接的にリンパ管新生を抑制する可能性が考えられた これを確かめるために 角膜傷害後の白血球浸潤に対する VEGF Trap の阻害能を評価する試験を再度実施した VEGF Trap 投与群 (188±14) では 対照の hfc 投与群 (909±17) と比較して角膜切片中の炎症性細胞数が減少した さらに 角膜傷害前の放射線照射による全骨髄由来細胞の全身的な枯渇 [ 血管面積 : 放射線照射群 18.4±4% 対照 ( 非照射 ) 群 49.±10.4% リンパ管面積 : 放射線照射群 1.4±3.2% 対照群 ( 非照射 )38±12.23%] あるいはリポソーム封入クロドロネートによるマクロファージの局所的な枯渇 [ 血管面積 : リポソーム封入クロドロネート群.3±5.8% 対照 ( リン酸緩衝液 ) 群 42.3±.3% リンパ管面積 : リポソーム封入クロドロネート群 10.8±2.5% 対照 ( リン酸緩衝液 ) 群 38.8±4.7%] により 血管新生及びリンパ管新生が有意に抑制されることも示された これらの結果から VEGF-A 及び PlGF は 血管新生やリンパ管新生に必要なシグナルを供給及び増幅させる白血球 / マクロファージの動員を介して 角膜傷害の病態生理学的反応に重要な役割を果たしていると考えられる なお 最近の報告によると VEGF Trap は bfgf による角膜の血管新生を抑制し 17) またマウス角膜移植後の VEGF Trap 投与により 血管新生 リンパ管新生及び炎症を抑制するのみならず 同種移植角膜の生着も改善することが明らかにされている 7,18,19)

27 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 21 of 副次的薬理試験 正常及び担癌マウスにおける遊離型 VEGF Trap 及び VEGF Trap 複合体の濃度 並びに抗腫瘍効果との相関性 参照項目 :[ 参考 ] Proc atl Acad Sci USA 乾癬 ) 角膜移植拒絶反応 7) 及び腫瘍異種移植 8) などの動物モデルを用いた非臨床試験において VEGF Trap 全身投与による病的な血管新生の治療及び他の生物学的作用について評価した 腫瘍の同種又は異種移植モデルでは 用量反応性試験を実施し VEGF を完全に中和するのに必要な VEGF Trap の用量及び血中濃度を検討した それらの試験の一つでは 担癌マウスと正常マウスの両方で 遊離型 VEGF Trap 血中濃度と VEGF に結合した VEGF Trap(VEGF Trap 複合体 ) の濃度を比較し 腫瘍増殖に対する効果との相関性を検討した ( 参照 ) B1F1 マウス黒色腫細胞株 A73 ヒト横紋筋肉腫細胞株又は MMT マウス乳癌細胞株を皮下に移植した SCID マウスに VEGF Trap 及び 25mg/kg を週 2 回皮下投与 (1~2 週間 ) し 血漿中遊離型 VEGF Trap 及び VEGF Trap 複合体の濃度を ELISA 法で測定した その結果 腫瘍の種類によらず遊離型 VEGF Trap 濃度は 検討した用量範囲において用量に応じて上昇し 2.5mg/kg でおよそ 10μg/mL のレベルに 25mg/kg ではおよそ 100μg/mL に達した 一方 VEGF Trap 複合体濃度は低用量域で漸増し 図 に示すとおり 2.5mg/kg 以上の用量で最大濃度である 1~2μg/mL に達した 一方 VEGF Trap は 2.5mg/kg 以上の用量で腫瘍の増殖を抑制した すなわち 抗腫瘍効果のみられる用量では 遊離型 VEGF Trap 濃度は VEGF Trap 複合体の最大血漿中濃度を超えていた

28 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 22 of 54 図 VEGF Trap の用量と遊離型 VEGF Trap 及び VEGF Trap 複合体の血漿中濃度の関連並びに腫瘍増殖に対する効果との相関 マウスの皮下 ( 脇腹 ) に B1F1 マウス黒色腫細胞株 (A) A73 ヒト横紋筋肉腫細胞株 (B) 又は MMT マウス乳癌細胞株 (C) を移植し 腫瘍がおよそ 100 mm 3 に増殖した後 VEGF Trap 及び 25mg/kg を週 2 回 1~2 週間皮下投与した 血漿中の遊離型 VEGF Trap(Free Trap 図中青線 ) と VEGF Trap 複合体 (VEGF Trap Complex 図中緑線 ) を測定した 腫瘍の種類に関係なく遊離型 VEGF Trap レベルは検討範囲内の用量で 用量に応じて増加し 2.5mg/kg で 10μg/mL に達し 25mg/kg でおよそ 100μg/mL に上昇した 一方 VEGF Trap 複合体は 2.5mg/kg 以上の用量で最大濃度 1~2μg/ml に達した 腫瘍容積 ( 図中赤線 ) は 2.5mg/kg 以上の用量では一貫して減少し この用量 (2.5mg/kg) は 遊離型 VEGF Trap の血漿中濃度が VEGF Trap 複合体濃度を超える最低用量である (n=/ 群 )

29 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 23 of 54 図 VEGF Trap の用量と遊離型 VEGF Trap 及び VEGF Trap 複合体の血漿中濃度の関連 マウスに移植した腫瘍の重量が体重の 3% 未満である場合 腫瘍から産生される VEGF はマウスの内因性の VEGF と比較して少量であることが示唆される (A 及び B) マウス (A) 又はヒト (B) 腫瘍がおよそ 100 mm 3 に増殖した後 VEGF Trap 及び 25mg/kg を週 2 回 1~2 週間投与した 血中の遊離型 VEGF Trap と VEGF Trap 複合体を試験終了時に測定した マウス由来腫瘍の移植モデルでは いずれの場合も最終腫瘍容積によらず 血中の VEGF Trap 複合体濃度はおよそ 1μg/mL であった 一方 ヒト由来腫瘍の移植モデルでは VEGF Trap 複合体濃度はおよそ 0.1μg/mL であった 遊離型 VEGF Trap 濃度は徐々に増加し 2.5mg/kg の用量で VEGF Trap 複合体濃度を超え 25mg/kg でおよそ 100μg/mL に達した (n=/ 用量 ) (C) マウス及びヒトの腫瘍型を示す マウス (Lewis 肺癌 B1F10 黒色腫 ) 又はヒト (SK-EP Wilm 腫瘍及び HT1080 線維芽肉腫 ) 由来の腫瘍を移植したマウスでも同様の結果が得られた VEGF Trap 複合体濃度は VEGF Trap の投与量の増加に伴い上昇し 2.5mg/kg 以上で最大濃度の約 1~2μg/mL に達した この用量レベルでは 遊離型 VEGF Trap の血中濃度は VEGF Trap 複合体濃度よりも高かった ( 図 ) VEGF Trap を同投与スケジュールで正常なマウスに投与したときの遊離型及び結合型の VEGF Trap 濃度は担癌マウスでの濃度と同等であった したがって 予想以上に多くの内因性かつ生体内利用可能な VEGF が通常でも正常組織により産生されており ( 約 0.00μg/g 組織 / 日 ) 腫瘍異種移植由来の VEGF は比較的少量にとどまることが示唆された

30 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 24 of 安全性薬理試験 ICH ガイドライン S7A 安全性薬理試験ガイドライン ( 平成 13 年 月 21 日付医薬審発第 902 号 ) で定義されている in vitro 安全性薬理試験により融合たん白質などの高分子量化合物を評価する必要性は低いと考えられる したがって GLP に準拠した in vivo 試験及び GLP 非準拠の in vivo 試験 ( げっ歯類の血圧に関する 1 試験 ) により VEGF Trap の安全性薬理評価を行った ( 参照 ) 中枢神経系 参照項目 : VGFT-TX VGFT-TX VEGF Trap の中枢神経系に及ぼす影響については 毒性試験で得られた成績から一般症状 直腸温など安全性薬理のエンドポイントを評価した 雌雄カニクイザルに VEGF Trap 及び 30mg/kg を週に 2 回 3 ヵ月間皮下投与した試験において カニクイザルの一般症状及び直腸温への影響は VEGF Trap のいずれの群においても認められず VEGF Trap の投与による中枢神経系への影響は認められなかった ( 表 L VGFT-TX 参照 ) 同様に 雌雄カニクイザルに VEGF Trap 3 10 及び 30 mg/kg を週 1 回 15 週間 その後 27 週まで 1 週おきに静脈内投与した試験 ( 表 J VGFT-TX 参照 ) においても中枢神経系への影響は認められなかった 心血管機能 げっ歯類における血圧に及ぼす VEGF Trap の影響 : 遊離型 VEGF Trap の血中濃度との相関性 参照項目 :[ 参考 ] VGFT-MX C57BL/ マウスに 2.5 及び 25mg/kg の VEGF Trap を Wistar-Kyoto ラットに 及び 25mg/kg の VEGF Trap 又は 5mg/kg の hfc を単回皮下投与したときの血圧に及ぼす影響をテレメトリー法で検討した ( 非 GLP 試験 ) 投与前 48 時間以上の測定記録を血圧と心拍数のベースライン値とし 測定は投与後およそ 3~4 週間まで継続した ( 参照 ) VEGF Trap 2.5 及び 25mg/kg を C57BL/ マウスに単回皮下投与した結果 収縮期血圧及び拡張期血圧いずれも統計学的に有意な上昇を示し 最大上昇は投与後 24~48 時間以内に認められた 2.5 及び 25mg/kg を投与したマウスにおける収縮期血圧の各動物での最大上昇の平均値は それぞれ 14.3±0.7mmHg 及び 17.3±1.1mmHg であった ベースライン値を上回る収縮期血圧の上昇の持続期間は 2.5mg/kg 投与群のマウスで約 7 日であったのに対し 25mg/kg 投与群ではおよそ 21 日間持続した 同様の用量依存的な影響は拡張期血圧にも認められたが 最大上昇幅はわずかに小さかった 血圧上昇の持続時間は血中の遊離型 VEGF Trap の存在と密接に関係しており 血中の遊離型 VEGF Trap 濃度がおよそ 1μg/mL を下回るまで 収縮期血圧と拡張期血圧は投与前ベースライン値を上回る上昇を持続した また VEGF Trap 投与マウスにおいて一時的かつ用量依存的な心拍数の減少が認められたが その作用は統計学的に有意ではなかった ( 図 A 図 B 参照 )

31 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 25 of 54 Wistar-Kyoto ラットに VEGF Trap を 0.5mg/kg 以上の用量で単回皮下投与した結果 収縮期血圧と拡張期血圧いずれにおいても用量依存的で有意な上昇が認められ 投与 2~4 日以内に最大上昇がみられた 最高用量である 25mg/kg の VEGF Trap を投与したときの 収縮期血圧及び拡張期血圧の各動物での最大上昇の平均値は それぞれ 22±1.5mmHg 及び 17.8±1.0mmHg であった 収縮期血圧と拡張期血圧の最大上昇と同程度の上昇が 10mg/kg 投与群でみられていることから 正常のラットでは VEGF Trap による血圧上昇は飽和に達することが示唆された 低用量では血圧の上昇幅は段階的に減少し VEGF Trap 0.5mg/kg での収縮期血圧及び拡張期血圧の最大上昇は それぞれ 4.7±0.mmHg 及び 3.5±0.5mmHg にすぎなかった VEGF Trap 0.15 及び 0.05mg/kg の投与では 血圧の上昇は認められなかった ( 図 参照 ) 血圧上昇の程度とは異なり 血圧上昇の持続時間は 0.5mg/kg 以上のすべての用量で用量に応じて延長し 0.5mg/kg で約 5 日 25mg/kg で 1~17 日であった 血圧への影響の持続時間は 遊離型 VEGF Trap の血清中濃度と明らかな相関を示した 血圧の最大上昇は 遊離型 VEGF Trap 濃度がおよそ 10μg/mL に達するレベルで認められ 遊離型 VEGF Trap 濃度がおよそ 1μg/mL 以下に低下するまで ベースラインを上回る血圧の上昇が持続した ( 図 A 参照 ) 心拍数は 1mg/kg 以上の VEGF Trap を投与したラットで一時的に減少する傾向がみられた ( 投与後 1~4 日目 ) 心拍数の減少幅は投与前と比べて最大 10~25bpm であったが 統計学的に有意ではなかった ( 図 B 参照 ) 心拍数の減少は血圧上昇に伴う反射によるものと考えられ 二次的に誘発された反応であり 毒性学的意義は少ないと考えられた カニクイザルにおける心血管機能に及ぼす VEGF Trap の影響 参照項目 : VGFT-TX VGFT-TX VEGF Trap の心血管系に及ぼす影響については 毒性試験で得られた成績から血圧 ( 収縮期 拡張期 平均血圧 ) 心拍数及び ECG パラメータ (PR QT RR QTc 及び QRS 間隔 ) を評価した 雌雄カニクイザルに VEGF Trap 及び 30mg/kg を週 2 回 3 ヵ月間皮下投与した試験 (2..7.7L VGFT-TX 参照 ) 又は 3 10 及び 30mg/kg を週 1 回 15 週間 その後 27 週まで 1 週間おきに静脈内投与した試験 (2..7.7J VGFT-TX 参照 ) のいずれにおいても 血圧上昇が一部のカニクイザルに認められたものの (2..7.7L VGFT-TX 参照 ) VEGF Trap の投与による血圧 心拍数及び ECG パラメータへの影響は認められなかった ( 表 表 表 表 参照 )

32 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 2 of 血栓形成 参照項目 : VGFT-TX-0012 雄ウサギ (ew Zealand White) の電気的傷害誘発血栓症モデルを用いて 静脈及び動脈の血栓形成に対する VEGF Trap の影響を検討した VEGF Trap 及び 30mg/kg を 3 回 ( 試験 - -3 及び 1 日 )30 分間持続静注した ( 試験第 1 日の投与後に右頸静脈及び下行大動脈に電流を負荷し 血栓形成を誘発させた ) 活性化凝固時間 プロトロンビン時間 活性化部分トロンボプラスチン時間 血液学的パラメータ並びに心拍数 血流量 ( 下行大動脈及び右頸静脈 ) 電流負荷の開始から血栓性閉塞に至るまでの時間経過 又は血栓と共に摘出した血管重量 ( 血栓が存在した場合 ) を評価した結果 VEGF Trap 及び 30mg/kg の投与により 静脈及び動脈の血栓形成に影響は認められなかった ( 表 表 表 表 表 表 表 VGFT- TX-0012 参照 ) 呼吸機能 参照項目 : VGFT-TX-0009 雄ラット (Sprague Dawley) に VEGF Trap 及び 250mg/kg を 30 分間単回持続静注したときの呼吸機能パラメータに対する影響を全身プレチスモグラフィーにより覚醒 非拘束下で検討した テオフィリン (30mg/kg 20 分間単回持続静注 ) を陽性対照薬として用いた 溶媒投与群に比して VEGF Trap は 静注開始 270 分後まで及び投与 7 日後において 検討したいずれの用量でも呼吸機能パラメータ ( 呼吸数 1 回換気量 吸気及び呼気時間 最大吸気及び呼気流量 分時換気量 enhanced pause) に生物学的に問題となる影響を及ぼさなかった ( 表 VGFT-TX-0009 参照 ) 創傷治癒 参照項目 : VGFT-TX VGFT-TX-00 ウサギ (ew Zealand White) の切開創及び切除創治癒モデルを用いて VEGF Trap の創傷修復 治癒に対する影響を検討した 雄ウサギの切開創治癒モデルに対して 試験 及び 日に VEGF Trap を 30 分間持続静注した 試験第 1 日に切開創傷を作製した ( VGFT-TX-0010 参照 ) VEGF Trap 及び 30mg/kg の投与により 用量依存的な血管密度の低下が明確にみられ 3 及び 30mg/kg 群の平均血管密度は試験 4 8 及び 12 日に対照群 ( 生理食塩液投与群及び VEGF Trap の溶媒投与群 ) に比して低かった 30mg/kg 群では 試験 8 及び 12 日に血管密度の低下が最も大きかった 0.3mg/kg 群では試験 4 日においてのみ血管密度が対照群に比し低かった 創傷の伸張強度は 試験 4 8 及び 12 日目に生理食塩液投与群と比較してすべての VEGF Trap 投与群でわずかに低かった ( 表 図 参照 ) VEGF Trap を投与したすべてのウサギで 遊離型 VEGF Trap が初回投与から 9 時間後まで血液中に検出された ( 但し 0.3mg/kg 群のウサギ 1 匹で誤投与があり このウサギの試験 -2 日の 5 分後 ~3 日の成績を評価から除いた ) 0.3mg/kg 群では 遊離型 VEGF Trap の血漿中濃度は初回投与 24~48 時間後においてのみ VEGF Trap 複合体濃度を上回る濃度を維持したのに対して 3 及び 30mg/kg 群の遊離型 VEGF Trap の平均濃度は いずれの測定時点においても VEGF Trap 複合体の平均血漿中濃度と比

33 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 27 of 54 較してそれぞれ 3 倍及び 18 倍以上高い値を示した 各投与群の初回投与 24 時間後の遊離型 VEGF Trap 濃度は それ以降の投与 ( 試験 3 7 及び 日 )24 時間後の濃度と同等であった 試験終了時に 抗 VEGF Trap 抗体が 30mg/kg 群のウサギ 1 匹にのみ確認され このウサギでは遊離型及び VEGF Trap 複合体の血漿中濃度は低下した 雄ウサギの切除創治癒モデルに対して 試験 -2 5 及び 17 日に VEGF Trap を 30 分間持続静注した 試験第 1 日に切除創傷を作製した ( VGFT-TX-00 参照 ) 同モデルにおいても VEGF Trap の 及び 30mg/kg 投与により 創傷治癒及び関連パラメータに対する用量依存的な抑制が認められた 創傷修復 治癒の抑制は 対照群 ( 生理食塩液投与群及び VEGF Trap の溶媒投与群 ) に比し 0.3mg/kg 群では特に試験 8 日に顕著で 線維化反応及び血管新生の低下を特徴としていた 一方 3 及び 30mg/kg 投与群では 血管新生はすべての測定時点 ( 試験 8 14 及び 20 日 ) でほとんど検出されず 線維化反応及び表皮過形成も顕著に減少した その結果 VEGF Trap 3 及び 30mg/kg の静脈内投与により 試験 14 及び 20 日では 対照群と比較して創傷部位の面積が大きく これらの投与量では試験 20 日に開放創の割合が高かった ( 図 図 図 表 図 参照 ) 遊離型及び VEGF Trap 複合体は VEGF Trap を投与したすべてのウサギで初回投与から 144 時間後まで血液中に検出された 0.3mg/kg 群では 遊離型 VEGF Trap 濃度は 初回投与 24 時間後においてのみ VEGF Trap 複合体濃度を上回ったのに対し 3 及び 30mg/kg 群では 最長測定時点である初回投与 144 時間後まで VEGF Trap 複合体濃度を上回るレベルの遊離型 VEGF Trap 濃度が維持された いずれの群においても 初回投与 72 時間後の遊離型 VEGF Trap 濃度はそれ以降の投与 ( 試験 5 及び 17 日 )72 時間後の濃度と同等であった 試験終了時に 抗 VEGF Trap 抗体が 0.3mg/kg 群のウサギ 2 匹 30mg/kg 群に 1 匹に確認され これらのウサギでは遊離型及び VEGF Trap 複合体の血漿中濃度は低下した 薬力学的薬物相互作用 該当試験なし

34 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 28 of 考察及び結論 VEGF-A は in vitro における内皮細胞の分裂促進因子であり in vivo で血管新生を誘導することが知られている 1) 胚発生において 血管形成及び血管新生に VEGF は極めて重要である 成体の哺乳動物では VEGF は多くの組織で恒常的に発現しており 血管緊張の調節 並びに器官 特に腎臓における毛細血管の有窓性の維持に関与している 20) また VEGF は血管透過性を著明に亢進させる 2) 加えて 創傷治癒の際に血管新生を促進し 卵胞の成熟 21) や黄体の形成 22) にも関与している 異常な血管透過性や病的血管新生を特徴とする固形癌や多くの眼性血管疾患などの病態において VEGF の発現が亢進していることが知られている 1,2,23) VEGF は 病的血管新生や浮腫形成に関わる重要な構成要素と考えられていることから VEGF の阻害がそれらの病態に対する有望な治療法となる可能性がある 一方 PlGF は 血管形成関連たん白質であり VEGF と相乗的に様々な病態の病的血管新生や過度の血管透過性亢進を誘導すると考えられている 13,14) PlGF は VEGF と同様に滲出型 AMD 患者から採取した新生血管の膜内に存在し AMD のモデル動物では CV 形成を促進することが知られている 15) また VEGF-B も動物モデルにおいて 網膜及び脈絡膜での血管新生や血液網膜関門の破綻に関与することが報告されている 1) VEGF Trap は ヒト VEGFR-1 及び VEGFR-2 の細胞外ドメインのリガンド結合部位とヒト IgG1 の Fc 部位を融合させた組換え融合たん白質である VEGF Trap はヒト VEGF-A 15 と 1:1 の比で結合して複合体を形成する その解離定数 (K D) はおよそ 0.5pM である また ヒト VEGF-A 121 に対する親和性も 1pM 未満であった カニクイザルの VEGF-A たん白質のアミノ酸配列はヒトと同一であり また VEGF Trap は 1pM 未満の K D 値でマウス ラット及びウサギの VEGF-A に結合することが示されている 以上の知見に基づき これらの動物種を薬理試験に用いた VEGF Trap は VEGF 受容体の一部を用いた構造であることから VEGFR-1 に結合する他の VEGF ファミリー 特に PlGF にも結合するが VEGFR-3 を介してシグナルを伝達しリンパ管形成を誘導する VEGF-C 及び VEGF-D に対する結合は検出されなかった VEGF-A VEGF-B 及び PlGF と VEGF Trap が高親和性で結合することにより これらリガンドは細胞表面受容体に作用を及ぼすことができなくなる In vitro において VEGF Trap は HUVEC の VEGFR-2 の VEGF 依存性リン酸化をモル濃度比 1:1 以上で完全に阻害することが示された 一方 細胞系アッセイにおいて VEGF Trap は内皮細胞及び腫瘍細胞株に対して CDC 又は ADCC 活性を示さなかったことから VEGF Trap は in vivo においても CDC 及び ADCC いずれも促進しないと予想される したがって 疾患動物モデルにおいて認められた VEGF Trap の効果は VEGF-A 及び恐らく VEGFR-1 に結合する他の VEGF ファミリーとの結合 並びにその不活化を介したものであると考えられる 検討したすべての眼血管新生モデル及び血管漏出モデルの非臨床薬理試験において VEGF Trap は病的な血管新生又は血管漏出を効果的に抑制することが確認された すなわち げっ歯類の糖尿病性及び虚血性網膜症モデル 角膜傷害モデル 並びに滲出型 AMD に類似した CV のげっ歯類及び霊長類モデルにおいて VEGF Trap は病的血管新生や浮腫形成を抑制した 特に VEGF Trap の硝子体内投与により げっ歯類糖尿病モデルの網膜における血管漏出 並びにサルモデルにおけるレーザー誘発活動性 CV は速やかに回復することが示された さらに VEGF Trap は 上述の動物モデルに付随する眼の炎症を回復させた VEGF-A 及び PlGF は 白血球の亜集団 特にマクロファージ及び好中球の細胞表面に発現する VEGFR-1 を介して白血球の遊走を媒介することが知られていることから VEGF Trap の抗炎症作用は VEGF-A 又は PlGF との結合に基づく可能性が高い 12)

35 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 29 of 54 上述の動物モデルにおいて VEGF Trap は硝子体内への直接投与又は全身投与 ( 皮下 腹腔内又は静脈内投与 ) により効果を示すことが確認されたが 全身投与により眼の病的な血管漏出や血管新生を改善させるには 硝子体内投与よりも高用量の VEGF Trap を投与する必要があった 例えば 硝子体内投与では VEGF Trap 又は 500μg の 2 週に 1 回投与により活動性 CV の形成が抑制されたのに対し 静脈内投与では 3mg/kg 又は 10mg/kg 週 1 回投与で同様の効果が得られた 正常及び担癌マウス並びにヒトのいずれにおいてもこの用量で 全身の内因性 VEGF は効果的に中和されることから この用量を全身投与時の投与量として選択した 8) 特に マウスでは VEGF Trap 2.5mg/kg 以上 ( 皮下投与 週 2 回 ) の用量でのみ ほとんどの異種移植腫瘍の増殖が顕著に抑制された 総じて 腫瘍増殖の最大抑制は 10mg/kg 以上 ( 皮下投与 週 2 回 ) でみられる 同様に テレメトリー法のラットで VEGF Trap による血圧の最大上昇は 10mg/kg 以上の用量 ( 皮下投与 ) で認められた 血圧の最大上昇は遊離型 VEGF Trap の血中濃度がおよそ 10μg/mL に達したときに認められ 遊離型 VEGF Trap の血中濃度がおよそ 1μg/mL を下回るまで 投与前を上回る血圧の上昇が持続した 0.5mg/kg 未満の VEGF Trap では 血圧の上昇は認められなかった 抗 VEGF 抗体であるベバシズマブの ヒトで予想される主な副作用は高血圧であり 血圧維持機構に関与する VEGF/VEGFR シグナル伝達阻害剤のクラスエフェクトとして知られている 9,10) 安全性薬理試験では VEGF Trap の呼吸機能及び血栓形成に対する影響は認められなかった また 毒性試験において VEGF Trap を高用量で数ヵ月間全身投与しても中枢神経系及び心血管機能への影響は認められなかった しかしながら ウサギに VEGF Trap を反復全身投与したとき 検討したすべての用量 (0.3 3 及び 30mg/kg) で切開創傷及び切除創傷の治癒速度の遅延及び治癒範囲の減少が用量に相関して認められた 創傷治癒抑制も VEGF 阻害剤のクラスエフェクトである 24) したがって 血管新生や腫瘍増殖を効果的に抑制する用量で VEGF Trap を全身投与すると 同時に血圧が上昇し 創傷治癒を抑制することが考えられる しかし 硝子体内投与の場合 はるかに低用量で網膜の病的な血管漏出及び血管新生を効果的に抑制することから 前述の作用は生じないと考えられる 硝子体内投与により低用量の VEGF Trap を投与したときの全身曝露量は低く 有効用量の VEGF Trap 硝子体内投与後の VEGF Trap の最大全身濃度は 全身投与で明らかな作用を示すために必要な濃度以下に維持される 例えば マウスを用いて実施した副次的薬理試験において 1mg/kg 以下の VEGF Trap 週 2 回投与では 腫瘍増殖に対する VEGF Trap の効果はほとんどあるいは全くみられず 腫瘍増殖を抑制するためには 10 倍高用量を必要とした 8) 同様に ラットにおける血圧の最大上昇は 10mg/kg 以上の用量で達成されたが 0.5mg/kg 未満では明らかな血圧の変化は認められなかった 対照的に VEGF Trap 3μg の硝子体内投与で糖尿病ラットの網膜血管漏出が効果的に抑制されたが この用量はおよそ 0.012mg/kg に相当し 同じ動物種で血圧に検出可能な変化を生じさせる皮下投与での最低用量の 40 分の 1 であった 実際 この用量の硝子体内投与 48 時間後の血漿中遊離型 VEGF Trap 濃度は 定量下限未満であった ( VGT-C-007 参照 ) さらに VEGF Trap(3μg) の硝子体内投与によって 反対側の眼の血管透過性は正常化しなかったことから 全身循環血中に遊離型 VEGF Trap が薬理学的に有効な濃度で存在していないことを示している 同様に サルの硝子体内投与試験において VEGF Trap 50μg/eye( 両眼投与 ) と極めて低用量で 実験的 CV の形成が効果的に抑制された一方で 評価時点において遊離型 VEGF Trap の全身曝露は検出されなかった ( VGFT-TX 参照 ) サルでのこの用量は 体重換算した全身投与量で外挿すると ヒトではおよそ 2mg/eye( 片眼投与 ) に相当する ( 表 )

36 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 30 of 54 結論として VEGF Trap の硝子体内投与は CV モデル 糖尿病性又は虚血性網膜症モデルなど検討したすべての眼性血管疾患動物モデルにおいて 病的な血管漏出 血管新生及び炎症を効果的に抑制することが確認された 極めて高用量の VEGF Trap を全身投与したときにみられる影響は VEGF 経路の阻害に直接関連する既知のクラスエフェクト ( 例えば 血圧 創傷治癒に及ぼす影響 ) であり 硝子体内投与による低用量投与では 遊離型 VEGF Trap の血中濃度はそのような影響が発現し得る濃度に達しないと考えられる

37 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 31 of 図表 安全性薬理試験の結果 ( 図表 ) を本項に記載した 表 カニクイザルの 13 週間皮下投与毒性試験における体温に及ぼす VEGF Trap の影響 Group/ Dose Pre-dose Treatment Period Week -1 Week 1 Week 13 Male Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Female Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg 表中の値 ( 体温 ) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の動物数 )

38 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 32 of 54 表 カニクイザルの ヵ月間静脈内投与毒性試験における体温に及ぼす VEGF Trap の影響 Group/ Dose Pre-dose Treatment Period Week 4 Week 12 Week 2 Male Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean B mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Female Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg 表中の値 ( 体温 ) は平均値 ± 標準偏差 (1 群 匹 ) 溶媒群からの有意差 A - P 0.05 B - P 0.01 C - P (Dunnett)

39 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 33 of 54 図 A C57BL/ マウスの血圧に及ぼす VEGF Trap の影響 : 遊離型 VEGF Trap の血中濃度との相関性 VEGF Trap 2.5 mg/kg 又は 25 mg/kg を単回皮下投与した 尾静脈から採血し 遊離型 VEGF Trap の血中濃度を ELISA 法により測定した 収縮期血圧の変化 ( 赤線 Y 軸左 mmhg) と遊離型 VEGF Trap の血中濃度のデータ ( 黒線 Y 軸右 μg/ml) を重ねてプロットした

40 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 34 of 54 図 B C57BL/ マウスの心拍数に及ぼす VEGF Trap の影響 VEGF Trap を単回皮下投与した ( 赤矢印は投与時点を示す ) 心拍数のベースラインからの変化 (BPM) をプロットした

41 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 35 of 54 図 Wistar-Kyoto ラットの血圧 ( 収縮期血圧 ) に及ぼす VEGF Trap の影響 VEGF Trap 又は human Fc control protein を単回皮下投与した ( 赤矢印は投与時点を示す ) 収縮期血圧のベースライン値からの変化量を測定日ごとにプロットした (mmhg)

42 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 3 of 54 図 A Wistar-Kyoto ラットの血圧 ( 収縮期血圧 ) に及ぼす VEGF Trap の影響 : 遊離型 VEGF Trap の血中濃度との相関性 VEGF Trap 1mg/kg 2.5 mg/kg 10 mg/kg 又は 25 mg/kg を単回皮下投与した 尾静脈から採血し 遊離型 VEGF Trap の血中濃度を ELISA 法により測定した 収縮期血圧の変化 ( 赤線 Y 軸左 mmhg) と遊離型 VEGF Trap の血中濃度のデータ ( 黒線 Y 軸右 μg/ml) を重ねてプロットした

43 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 37 of 54 図 A Wistar-Kyoto ラットの血圧 ( 収縮期血圧 ) に及ぼす VEGF Trap の影響 : 遊離型 VEGF Trap の血中濃度との相関性 ( 続き ) VEGF Trap 1mg/kg 2.5 mg/kg 10 mg/kg 又は 25 mg/kg を単回皮下投与した 尾静脈から採血し 遊離型 VEGF Trap の血中濃度を ELISA 法により測定した 収縮期血圧の変化 ( 赤線 Y 軸左 mmhg) と遊離型 VEGF Trap の血中濃度のデータ ( 黒線 Y 軸右 μg/ml) を重ねてプロットした

44 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 38 of 54 図 B Wistar Kyoto ラットの心拍数に及ぼす VEGF Trap の影響 VEGF Trap を単回皮下投与した ( 赤矢印は投与時点を示す ) 心拍数のベースラインからの変化 (BPM) をプロットした

45 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 39 of 54 表 カニクイザルの 13 週間皮下投与毒性試験における血圧に及ぼす VEGF Trap の影響 Group/ Dose Treatment Period Week 1 Week 1 Week 5 Week 5 Week 13 Week 13 Systolic Diastolic Systolic Diastolic Systolic Diastolic Male Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Female Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg 表中の値 ( 血圧 mmhg) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の動物数 ) 投与 13 週目に VEGF Trap 15mg/kg 群及び 30mg/kg 群のそれぞれ雌 2 例に 投与前値と比較し血圧上昇 が認められた これらの血圧変化はサルの血圧測定における変動範囲内であり VEGF Trap の投与による影 響とは考えられなかった

46 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 40 of 54 表 カニクイザルの ヵ月間静脈内投与毒性試験における血圧に及ぼす VEGF Trap の影響 Group/ Dose Pre-dose Pre-dose Treatment Period First Second Week 4 Week 12 Week 2 Male Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Female Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean 74.8 D mg/kg VEGF Trap Mean 80.2 D mg/kg 表中の値 ( 平均血圧 mmhg) は平均値 ± 標準偏差 (1 群 匹 ) 溶媒群からの有意差 : A - P 0.05 B - P 0.01 C - P (Dunnett) D - P 0.05 E - P 0.01 G - P (Dunn)

47 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 41 of 54 表 カニクイザルの 13 週間皮下投与毒性試験における心電図に及ぼす VEGF Trap の影響 Group/ Dose Week 13 Heart Interval (msec) rate (bpm) PR QT RR QTc QRS Male Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Female Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg PR = PR 間隔, QT = QT 間隔, RR = R-R 間隔, QTc = QT corrected = QT / SQRT (RR/1000), QRS = QRS 間 隔. 表中の値は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の動物数 )

48 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 42 of 54 表 カニクイザルの ヵ月間静脈内投与毒性試験における心電図に及ぼす VEGF Trap の影響 Group/ Dose Week 2 Heart Interval (msec) rate (bpm) PR RR QRS QT QTc Male Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Female Vehicle Mean VEGF Trap Mean A 3 mg/kg VEGF Trap Mean A 10 mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg PR = PR 間隔, RR = RR 間隔, QRS = QRS 間隔, QT = QT 間隔, QTc = QT corrected by Fredericia s equation. 表中の値は平均値 ± 標準偏差 (1 群 匹 ) 溶媒群からの有意差 : A - P 0.05 B - P 0.01 C - P (Dunnett)

49 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 43 of 54 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の活性化凝固時間 (ACT) プロトロンビン時間 (PT) 及び活性化部分トロンボプラスチン時間 (APTT) に及ぼす影響 Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean ACT (sec) PT (sec) APTT (sec) 溶媒群からの有意差 : :P 0.05 (AOVA/Kruskal-Wallis and Dunnett/Dunn) 表中の値は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 ) プロトロンビン時間において 30mg/kg 群で溶媒群に比較し有意な減少が認められた しかし 溶媒群に対する減少率はわずかであったこと 試験開始前値 (8.13 秒 ) と同様な値であったことから この変化は生理的変動範囲内であり VEGF Trap 投与による影響とは考えられなかった 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の血液学的パラメータに及ぼす影響 Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean WBC (10 3 /μl) RBC (10 /μl) HGB (g/dl) HCT (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) WBC: 全白血球数 RBC: 赤血球数 HGB: ヘモグロビン濃度 HCT: ヘマトクリット値 MCV: 平均赤血球容積 MCH: 平均赤血球ヘモグロビン MCHC: 平均赤血球ヘモグロビン濃度表中の値は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 )

50 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 44 of 54 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の血液学的パラメータに及ぼす影響 ( 続き ) Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean RDW (%) PLT (10 3 /μl) MPV (fl) PLY (%) APLY (10 3 /μl) LYM (%) ALYM (10 3 /μl) RDW: 赤血球分布幅 PLT: 血小板数 MPV: 平均血小板容積 PLY: 多形核好中球相対数 APLY: 多形核好中球絶対数 LYM: リンパ球相対数 ALYM: リンパ球絶対数表中の値は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 ) 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の血液学的パラメータに及ぼす影響 ( 続き ) Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean MO (%) AMO (10 3 /μl) EOS (%) AEOS (10 3 /μl) BSO (%) ABSO (10 3 /μl) MO: 単球相対数 AMO: 単球絶対数 EOS: 好酸球相対数 AEOS: 好酸球絶対数 BSO: 好塩基球相対数 ABSO: 好塩基球絶対数溶媒群からの有意差 : :P 0.05 (AOVA/Kruskal-Wallis and Dunnett/Dunn) 表中の値は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 ) 好酸球相対数において 0.3mg/kg 群で溶媒群に比較し有意な増加が認められた しかし 試験開始前値 (2.2%) と同様な値であったこと 及び用量依存性がみられなかったことから この変化は生理的変動範囲内であり VEGF Trap 投与による影響とは考えられなかった

51 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 45 of 54 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の血液学的パラメータに及ぼす影響 ( 続き ) Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean LUC (%) ALUC (10 3 /μl) RTC (%) ARTC (10 9 /L) LUC: 大型非染色細胞相対数 ALUC: 大型非染色細胞絶対数 RTC: 網状赤血球相対数 ARTC: 網状赤血球絶対数表中の値は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 )

52 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 4 of 54 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の心拍数に及ぼす影響 Time (minutes) Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg Heart rate VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Current Initiation Time Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean A 1 70 Mean Mean A 1 80 Mean Mean A 1 90 Mean Mean Mean Mean A 1 7 Mean A 1 9 Mean A Mean A Mean A 1 A Mean 250 A A: 該当せず -: データなし 表中の値 ( 心拍数 回 / 分 ) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 )

53 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 47 of 54 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の下行大動脈血流量に及ぼす影響 Time (minutes)* -50 Mean -40 Mean -30 Mean -20 Mean -10 Mean Current Initiation Time Mean Mean blood flow Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg 21.8 A A VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg A: 該当せず -: データなし 表中の値 ( 血流量 ml/ 分 ) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 ) *: 血栓形成誘発後も下行大動脈血流量の測定を続けたが 電流を停止する時間及び血栓による閉塞の発現する時間は個体間で差異があったため 血栓形成誘発後の平均血流量については評価しなかった 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の右頸静脈血流量に及ぼす影響 Time (minutes) * -50 Mean -40 Mean -30 Mean -20 Mean -10 Mean Current Initiation Time Mean Mean blood flow Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg 13.7 A A VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg A: 該当せず -: データなし 表中の値 ( 血流量 ml/ 分 ) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 ) *: 血栓形成誘発後も右頸静脈血流量の測定を続けたが 電流を停止する時間及び血栓による閉塞の発現する時間は個体間で差異があったため 血栓形成誘発後の平均血流量については評価しなかった

54 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 48 of 54 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の血栓形成開始から血栓性閉塞に至るまでの時間経過に及ぼす影響 Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean Descending aorta Time to occlusion Right jugular vein A A: 該当せず表中の値 ( 血栓性閉塞に至るまでの時間 分 ) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 ) 表 電気的傷害誘発血栓症ウサギモデルにおける VEGF Trap の血管重量 ( 血栓を含む ) に及ぼす影響 Group/ Dose Vehicle VEGF Trap 0.3 mg/kg VEGF Trap 3.0 mg/kg VEGF Trap 30 mg/kg Mean Mean Mean Mean Descending aorta Vessel weights Right jugular vein 表中の値 ( 血管重量 g) は平均値 ± 標準偏差 (:1 群の例数 )

55 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 49 of 54 表 ラットの呼吸機能に及ぼす VEGF Trap 単回静脈内持続投与の影響 Group/ Dose Respiratory rate (cycles /min) Time after Baseline Treatment T0 T30 T0 T90 T270 Day 7 Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Theophilline Mean ** 32 *** 29 ** mg/kg Tidal (a.u.) volume Vehicle Mean VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg Theophilline Mean * 202 * mg/kg VEGF Trap 又は溶媒は T0 から T30 まで投与した テオフィリンは T0 から T20 まで投与した 表中の値は平均値 ± 標準偏差 (1 群 8 匹 ) 溶媒群からの有意差 : *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 (AOVA and t-test)

56 2..2 薬理試験の概要文 Bayer Yakuhin, Ltd. Page 50 of 54 表 ウサギの切開創治癒モデルにおける創傷の伸張強度に及ぼす VEGF Trap の影響 Group umber Test Maximum Load () Material (%) a) (%) a) (%) a) Day 4 Day 8 Day % acl Mean Vehicle Mean control VEGF Trap Mean * mg/kg VEGF Trap Mean mg/kg VEGF Trap Mean * mg/kg ote: A mean with * indicates a significant difference from Group 2 (control) mean at a confidence level of 95% (AOVA/Kruskal-Wallis and Dunnett/Dunn) ote: a) indicates % inhibition compared to Group 2 (control) 図 ウサギの切開創治癒モデルにおける血管密度に及ぼす VEGF Trap の影響 Group 1: 2.0mg/kg Dexamethasone, Group 2: 0.9% acl, Group 3: vehicle control, Group 4: 0.3mg/kg VEGF Trap, Group 5: 3mg/kg VEGF Trap, Group : 30mg/kg VEGF Trap