NGS をはじめよう! これだけは知っておきたい MiSeq ~ 解析原理と必要な試薬キット 装置の使い方 ~ June 27, 2014 米田瑞穂イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
本日の Outline MiSeq の概要 MiSeq のワークフロー 必要な試薬類 解析原理 データ解析 MiSeq Reporter 2
MiSeq とは? 1 ng~1 µg の DNA(RNA) サンプルから調製したライブラリー イルミナ社のデスクトップ型の次世代シーケンサー (NGS) 相補鎖 DNA を合成しながら読み取りを行う Sequencing By Synthesis (SBS 法 ) を用いる 最大 15 Gbases の塩基が解析可能! 2013 年 6 月時点 3
MiSeq で対応可能なアプリケーション 全ゲノム解析 エクソン解析 HiSeq2500 1000 Gb / ラン 6 日 / ラン NextSeq 500 120 Gb / ラン 1 日 / ラン トランスクリプトーム解析遺伝子発現プロファイル解析メチル化解析メタゲノム解析微生物ゲノム解析ターゲットリシーケンシング ChIP-Seq 解析 Small RNA 解析多サンプルアンプリコンシーケンスアンプリコンシーケンスライブラリQC MiSeq v2 試薬 ~8 Gb / ラン ~2 日 (39 時間 ) / ラン MiSeq v3 試薬 ~15 Gb / ラン ~3 日 (55 時間 ) / ラン 4
MiSeq ランのワークフロー 1. ライブラリーの調製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 5
MiSeq のランに必要となるもの 2 サンプルシート 4MiSeq 試薬キット 3 フローセル 1 調製したライブラリー 6
MiSeq Control Software (MCS) 画像案内でランセットアップをサポート MiSeqのラン実施までは タッチパネルを数回操作するだけ 試薬セットの際に動画での手順説明を閲覧可能 ラン中にデータ品質 クラスター数などのパラメーターをディスプレイに表示 7
MiSeq ランのワークフロー 1. ライブラリーの調製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 8
ライブラリーの調製 ライブラリー調製 : アダプターが両端に付いた核酸断片を得る イルミナのライブラリー調製キット 推奨定量方法 - qpcr 1シーケンスされるDNA 2Flowcellとのハイブリ 3Index ( サンプル区別のためのバーコード ) 推奨定性方法 -Bioanalyzer - ゲル電気泳動 2 3 4シーケンスプライマーのハイブリ 4 1 4 3 2 例 : TruSeq DNA HT (Dual Index) の場合 正確なライブラリ品質の確認と定量が 最適なクラスタ密度と高いシーケンスパフォーマンスを得るためには必要不可欠である 9
ライブラリーの品質確認について サポートウェビナーシリーズ 2013 Bioanalyzer を使用した Library QC トラブルシューティング 2013/10/18 イルミナサポートウェビナー (http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss) 10
ライブラリーの調製 DNA ライブラリーの調製方法例 (TruSeq DNA prep の場合 ) アプリケーションごとに最適化された試薬キットの提供 ゲノム DNA (1 ug から ) DNA の断片化数百 bp 2 種類のアダプター付加 DNA ライブラリー 11
主なライブラリー調製キット (2014 年 6 月現在 ) TruSeq Nano DNA TruSeq DNA PCR-Free Nextera DNA Nextera XT Nextera Mate Pair TruSeq Custom Amplicon TruSeq Custom Amplicon Caner Panel Nextera Rapid Capture Exsome Nextera Rapid Capture Custome Enrichment TruSight Tumor TruSight Myeloid TruSight 疾患パネル TruSeq ChIP TruSeq RNA TruSeq Stranded mrna TruSeq Stranded Total RNA TruSeq Small RNA TruSeq RNA Access Library Kit TruSeq targeted RNA Panel 12
シーケンスサンプル調製キット Kit Selector あなたのアプリケーションに適したサンプル調製キットを探す 2014/03/31 クリックして選びながら進みます イルミナサポートウェビナー (http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss) 13
MiSeq ランのワークフロー 1. サンプルの準備と 解析する DNA ライブラリーの作製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 14
Illumina Experiment Manager とは? Illumina Experiment Manager (IEM) は サンプルシートを作成するためのツールです フリーソフトウェア (MyIllmina からダウンロード可能 ) ウィザードベースで作成 不適切なインデックスの組み合わせを通知 15
サンプルシートとは? サンプルシート : (.csv) - ランの条件 - データ解析の条件 - マニフェスト - ゲノム 作成はライブラリー調製の前 16
サンプルシートの作成 17
サンプルシートの作成 Category の選択 Workflow の選択 18
サンプルシートの作成 Targeted Resequencing TruSeq Amplicon PCR Amplicon Metagenomics 16S rrna Enrichment Amplicon - DS Small Genome Sequencing RNA Sequencing Other Resequencing Plasmids Assembly Targeted RNA Small RNA RNA-Seq Library QC FASTQ Only ChIP-Seq 19
サンプルシートの作成 ライブラリー調製に用いたキットの情報 Run のサイクル数 条件を入力する 20
サンプルシートの作成 Index の組み合わせが悪い等の場合 Warning が表示される 21
サンプルシートの作成 入力完了 : Valid 22
サンプルシートの作成 23
MiSeq ランのワークフロー 1. ライブラリーの調製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 24
MiSeq のランに必要となるもの 2 サンプルシート 4MiSeq 試薬キット 3 フローセル 1 調製したライブラリー 25
MiSeq 試薬キット 簡便に使える 使い切りタイプの試薬セットを使用 わずかな操作だけでシーケンス実施可能 26
アプリケーションに応じた MiSeq 試薬の使い分けが有効 MiSeq 試薬タイプ V2 50 cycle V2 300 cycle V2 500 cycle 試薬量 最大対応リード長 リード数 50 bp 2x26+23 bp 15 M 300 bp 2x151+23 bp 15 M 500 bp 2x251+23 bp 15 M 主な用途 ショートリードのシーケンス (Small RNA の発現プロファイリング ) Library QC Nextera XT キットを使った各種アプリケーション PCR アンプリコンの解析 TruSeq Custom Amplicon との併用 ロングリードのアンプリコンシーケンス 小型ゲノムの De novo アセンブリー など MiSeq 試薬タイプ V3-150 cycle V3 600 cycle 試薬量 最大対応リード長 リード数 150 bp 2x76+23 bp 25 M 600 bp 2x301+23 bp 25 M 主な用途 RNA-seq ( トランスクリプトーム ) 少数検体の Exome など ロングリードのアンプリコンシーケンス 微生物の de novo アセンブリー HLA 解析 など dual index 分 27
MiSeq ラン ~ クラスター形成 ~ クラスター形成は シーケンスの際に DNA を検出可能な充分量に増やす目的で行う 各クラスターは増幅された異なる DNA を含む クラスター形成では以下の主要なプロセスを経る 1. ライブラリーのフローセルへのハイブリダイズ 2. ライブラリーの増幅 3. Linearize 4. シーケンスプライマーのハイブリダイズ クラスター 1. フローセル表面に DNA 結合 2. ブリッジ PCR で増幅 3. クラスターの形成 28
SBS シーケンシングケミストリー Sequencing By Synthesis (SBS) 法 ( サンガー法の改良法 ) 可逆的ターミネーターを用いて一塩基ずつシーケンスする 3 末端に保護基があるためDNA 合成が一塩基ずつストップしながら行われる 1 反応に蛍光ラベルされた 4ヌクレオチドを加える ( 蛍光の種類で塩基を特定 ) 高精度で信頼があり ホモポリマー領域も正確に解析可能 PPP HN O O 3 保護基 O N 切断部位 蛍光色素 5 1 サイクル 1 ヌクレオチド取り込み 2 蛍光検出 3 保護基を除去 4 蛍光色素を除去 DNA O HN O O 3 OH O N X 次のサイクルへ 29
SBS シーケンシングケミストリー T C A 蛍光をカメラで取得 C T G G G G G G A 蛍光標識した ddntps を DNA ポリメラーゼと一緒に添加 一塩基取り込み 取り込まれなかったヌクレオチドは 洗い流される 蛍光標識を励起 蛍光標識と 3 の保護基を除去 次のサイクルへ... 30
SBS シーケンシングケミストリー Quality scores (Q Scores) がすべての塩基に割り当てられる サイクル 1-4 = T G C T Q scores はそれぞれの塩基が不正確にbase callされる可能性を示す Q Score Probability of error Q30 1 in 1000 Q20 1 in 100 31
シーケンスの原理 サポートウェビナーシリーズ 2013 イルミナ SBS (Sequencing By Synthesis) ケミストリーのご紹介 2013/07/19 イルミナサポートウェビナー (http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss) 32
トラブルシューティング 装置の洗浄 7 月 11 日 ( 金 ) 予定 トラブルシューティング編 :NGS 困ったときのお助けツール Online Truobleshooter 7 月 25 日 ( 金 ) 予定 トラブルシューティング編 : MiSeq でフォーカスエラーが出た! どうしたら良い? 8 月予定 ラン間のサンプル持ち込みを最大限に防ぐための MiSeq のメンテナンス ~ テンプレート洗浄のプロトコール ~ 登録リンク :http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn 33
MiSeq ランのワークフロー 1. サンプルの準備と 解析するライブラリーの作製 2. Illumina Experiment Manager (IEM) を用いたサンプルシートの作成 3. クラスター形成 MiSeq によるシーケンシング 4. MiSeq Reporter によるデータ解析 34
MiSeq Reporter (MSR) とは? MiSeq のパイプラインで二次解析以降を担当するソフトウェアです 画像取得 MiSeq Control Software(MCS) /Real Time Analysis (RTA) 一次解析 MiSeq Reporter (MSR) 二次解析 画像解析ベースコール FASTQの作成ワークフローに従った各解析レポート表示 Or SAV 別の Windows PC 上でラン中 ラン後に確認 35
MiSeq 一次解析と二次解析 Analysis Type Outputs Outputs Sequencing (MCS) Images/TIFF files Primary Analysis (RTA) Intensities Base Calling Secondary Analysis (MSR or BaseSpace) Alignments and Variant Detection 36
MiSeq Reporter (MSR) 基本ワークフロー リシーケンス アンプリコン 16Sメタゲノム De novo アセンブル Enrichment Targeted RNA Small RNA ライブラリー QC イメージ解析 ベースコール 一次解析 リシーケンス アンプリコン 16S メタゲノム de novo アセンブル Enrichment Targeted RNA Small RNA ライブラリー QC 二次解析 37
MiSeq Reporter について Reference Guide http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/mis eq_reporter.ilmn MiSeq Reporter Theory of Operation http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/mis eq_reporter/documentation.ilmn サポートウェビナーシリーズ 2013 MiSeq Reporter アップデート 2013/11/01 http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss 38
MiSeq Reporter (MSR) ワークフロー概要 * 全てのワーフクローで出力されるわけではありません *Resequencing Enrichment Metagenomics ワークフローが出力に対応 レポートに含まれる内容 : リードの統計 カバレッジ ライブラリー断片長のサマリー SNV Insertion / deletion duplicate % など + 解析オプションや使用したソフトウェアのバージョン情報 39
Summary MiSeq は 簡単に操作を行うことができ ロングリードのアンプリコンシーケンスや エクソン解析など様々なアプリケーションに対応可能な装置 使いきりタイプ MiSeq 試薬キットをシーケンスを行う配列長 用途に合わせて選択し クラスター形成からシーケンシングまで簡単な操作で実施可能 MiSeq Reporter によって データの二次解析まで実施することが可能 40
サポートウェビナーにご参加いただきありがとうございました 本日のセッション終了後のご質問は techsupport@illumina.com で承ります 41