日本臨床細胞学会関東連合学術集会 2012 年 9 月 8 日高崎 呼吸器細胞診検体の液状化処理と 非小細胞肺癌の診断 治療のための 遺伝子解析 中西陽子 1 関利美 2 根本則道 1,2 1 日本大学医学部病態病理学系病理学分野 2 日本大学医学部附属板橋病院病理診断科
肺癌診療における細胞診の重要性 検診における早期癌の発見生検困難 手術適応のない進行肺癌の診断 LBC の活用 :ThinPrep2000( オリンパス ) 標本作製以外に残余検体の保存が可能 標的細胞を含む貴重な検体免疫染色遺伝子発現解析遺伝子変異解析診断 治療への情報提供
肺癌診療に求められていること細胞診の役割 良性悪性 非腫瘍腫瘍 小細胞癌非小細胞癌 肺癌薬物療法の進歩治療感受性 副作用の予測に基づく厳密な治療法選択 EGFR 遺伝子変異 ALK 融合遺伝子 腺癌扁平上皮癌大細胞癌その他 細胞形態とともに細胞が持つ分子レベルの情報
LBC 免疫染色 肺癌の組織型鑑別 日本肺癌学会肺癌診療ガイドライン肺癌の病理 細胞診断ガイドライン 2011 年 6 月より抜粋
TTF-1 CK7 CK18 CEA ThinPrep 法 擦り合わせ法 Calretinin WT1 CK14 ThinPrep 法 擦り合わせ法 肺腺癌すべて 400 5 第 51 回日本肺癌学会総会ワークショップ
カクテル抗体による免疫染色抗体 :NSCLC Cocktail Core Kit ( ハ ソロシ ー研究所 ) ADCC Cocktail 抗体 TTF-1, NapsinA SqCC Cocktail 抗体 P63, CK14 肺腺癌 ThinPrep 標本 (6 か月保存 ) ( 400) TTF-1 陰性肺腺癌 ThinPrep 標本 (3 か月保存 ) ( 400) 6 第 49 回日本臨床細胞学会秋季大会
LBC 免疫染色 染色性に問題ない ThinPrepで塗沫したプレパラートは賦活処理も可能 6か月程度保存(4 ) しても染色可能 ただし 肺癌組織型鑑別には 複数の染色が必要 細胞数が少ない場合は困難 (LBCに限らず)
LBC 遺伝子発現解析による肺癌の組織型鑑別 少数細胞から一度に多数の解析可能
LBC とレーザーマイクロダイセクション一層の細胞を顕微鏡下で観察しながら異型細胞を回収 検体 保存液に浮遊させた細胞検体を自動塗沫 ThinPrep2000( オリンパス ) PALM MBⅢ-N(ZEISS) 組織細胞化学 2010 2011 2012
胸水 10 症例の遺伝子発現解析 ThinPrep 標本 レーサ ーマイクロタ イセクション リアルタイム RT-PCR 症例 7: 胃癌の転移症例 8: 肺扁平上皮癌その他 : 肺腺癌 1 種類のマーカーでは鑑別困難 性別 年齢 病期 細胞診 1 M 65 4 Class V AC 2 M 78 3B Class V AC 3 M 61 3B Class V AC 4 M 77 4 Class V AC 5 F 86 4 Class V AC 6 M 69 3B Class V AC 7 M 64 4 Class V AC 8 M 80 3B Class III 9 M 80 3B Class V Ca 10 F 75 3B Class V AC 症例 内因性コントロール 腺癌扁平上皮癌転移性悪性中皮腫 CK7 CK18 TTF-1 CEA CK6 CK14 CK20 WT1 Calretinin 1 + - + + - - - - - - 2 + + + - - - - - - - 3 + + + - - - - - - - 4 + - + + - - - - - - 5 + + + - + - - - - - 6 + + + - + - - - - - 7 + - + - + - - + - - 8 + - - - - + + - - - 9 + + + - - - - - - - 10 + + + - + - - - - - 10
LBC 遺伝子発現解析肺癌の組織型鑑別 少数の細胞から一度に多数の標的分子を解析できる 免疫染色の結果を予測できる可能性 複数年保存した ThinPrep 検体でも 細胞の同定が可能であれば解析できる 細胞量少なく 診断困難な症例に有用
LBC EGFR 遺伝子変異解析 肺腺癌における EGFR-TKI 治療感受性予測 進行肺癌では細胞診検体のみの場合あり 迅速 高感度 正確な評価結果が求められる 偽陰性の回避 右 :Thinprep2000( オリンパス ) 左 :i-densy TM 5310 (ARKRAY) 細胞同定の重要性
方法 -QP 法 - 沈渣 沈渣 i-densy TM IS-5310 ( アークレイ ) 1-2mL 腫瘍細胞確認 沈渣 細胞沈渣 DNA 溶液を分注 沈渣 L858R(exon 21) EGFR-TKI 感受性 exon19 deletion EGFR-TKI 感受性 T790M(exon 20) EGFR-TKI 耐性 KRAS codon12,codon13 BRAF V600E 試薬パック チップ 反応チューブを装置にセットしスタート
EGFR 遺伝子変異解析 QP 法による結果と DNA ダイレクトシーケンス法による解析結果 QP 法 EGFR 遺伝子野生型 (WT) EGFR 遺伝子変異型 (L858R) EGFR 遺伝子変異型 (exon19 欠失 ) EGFR 遺伝子変異型 (T790M) Exon 21 L858R Exon 19 deletion Exon 20 T790M DNA ダイレクトシーケンス法 Exon 21 L858R Exon 19 E746V, L747-S752 del Exon 19 E746-A750 del Exon 20 T790M 第 101 回日本病理学会総会
胸水 ( 腫瘍細胞多数 ) 胸水 ( 腫瘍細胞多数 ) DNA 抽出不要 検体採取から結果の評価まで約 90 分 40 400 40 400 胸水 ( 腫瘍細胞少数 ) 気管支洗浄液 ( 腫瘍細胞少数 ) DNA 抽出必須 マイクロタ イセクション細胞転写法 40 400 40 400
検体 EGFR 変異 QP 法 Clamp 法 胸水 N=25 69.8 歳 (51-86) M:F 17:8 気管支洗浄液 N=10 63.9 歳 (48-75) M:F 8:2 細胞診検体からの EGFR 遺伝子変異解析結果 変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M 野生型非腫瘍腫瘍 DNA 抽出後 変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M 野生型非腫瘍腫瘍 DNA 抽出後 0 5 1 1 18/19 19/19 1 0 0 1/1 7/8 8/8 0 5 1-18/18 1 0 0-7/7 シーケンス法 0 5 1-1 0 0 - - 細胞診 Ⅳ:1,Ⅴ:4 Ⅲ:1 Ⅳ:1,Ⅴ:18 Ⅴ:1 Ⅱ:1 Ⅲb:1,Ⅳ:1,Ⅴ:6 DNA 量 (ng/μl) 270.3 ±330.0 検出限界 DNA 量 0.1ng/μL 40.8 ±1.76 10ng/μL 第 101 回日本病理学会総会
剥離した細胞診検体 ( パパニコロウ標本 ) からの EGFR 遺伝子変異解析結果 検体 EGFR 変異 QP 法 Clamp 法 シーケンス法 細胞診 DNA 量 (ng/μl) 検出限界 DNA 量 胸水 46, F 変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M Ⅴ 210.0 10ng/μL 気管支擦過細胞 67, F 変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M Ⅴ 190.5 10ng/μL 胸水 ( ギムザ染色 ) 気管支擦過細胞 ( ギムザ染色 ) 20 400 20 400 第 101 回日本病理学会総会
年齢 性 細胞診クラス QP 法 +Tm 解析 PCR clamp 法シーケンス法 治療 胸水 ( 細胞沈渣 ) 1 65 M Ⅴ L858R L858R L858R ケ フィチニフ ( 継続中 ) 2 78 M Ⅴ WT WT 3 61 M Ⅴ WT WT 4 77 M Ⅴ WT WT 5 86 F Ⅴ WT WT 6 69 M Ⅴ WT WT 7 64 M Ⅴ WT WT 8 80 M Ⅴ WT WT 9 80 M Ⅴ WT WT 10 75 F Ⅴ L858R L858R L858R ケ フィチニフ 11 75 F Ⅴ L858R,T790M L858R,T790M L858R,T790M ケ フィチニフ ( 耐性化 憎悪し死亡 ) 12 72 F Ⅴ UD WT( 生検 ) 13 65 F Ⅴ WT WT 14 66 M Ⅴ WT WT 15 56 M Ⅳ L858R L858R L858R ヘ メトレキセト ( 継続中 ) 16 85 F Ⅴ WT WT 17 67 M Ⅴ WT WT 18 64 M Ⅴ L858R L858R L858R ケ フィチニフ ( 継続中 ) 19 51 F Ⅴ WT WT 20 68 F Ⅴ WT WT 21 66 M Ⅴ WT WT 22 78 M Ⅴ WT WT 23 73 M Ⅴ WT WT 24 56 M Ⅳ WT WT 25 69 M Ⅲ WT ND 気管支洗浄液 ( 細胞沈渣 ) 1 48 M Ⅴ WT WT 2 57 M Ⅴ WT WT 3 67 M Ⅱ WT ND 4 55 F Ⅴ WT WT 5 75 F Ⅳ WT WT 6 70 M Ⅴ WT WT 7 67 M Ⅴ ex19del ex19del ex19del Ope ト セタキセル+カルホ フ ラチン ( 継続中 ) 8 73 M Ⅴ WT WT 9 69 M Ⅴ WT WT 10 58 M Ⅲb WT ND 細胞転写法による過去のパパニコロウ標本 ( 精製 DNA) 1 67 F Ⅴ exon19del exon19del exon19del ヘ メトレキセト +カルホ フ ラチン ヘ メトレキセト エルロチニフ ( 継続中 ) 2 46 F Ⅴ ex19del,t790m ex19del,t790m ex19del,t790m ケ フィチニフ エルロチニフ ( 憎悪し死亡 ) パラフィン包埋組織 ( 精製 DNA) 1 75 F L858R L858R L858R ケ ムシタヒ ン ケ フィチニフ ( 合併症あり 憎悪し死亡 ) 2 80 M WT UD WT 3 67 F ex19del ex19del ex19del ケ フィチニフ ( 継続中 ) 4 67 F ex19del ex19del ex19del ヘ メトレキセト +カルホ フ ラチン ヘ メトレキセト エルロチニフ ( 継続中 ) 5 85 M ex19del ex19del ex19del BSC ( 経過観察中 ) 6 75 M L858R L858R L858R ト セタキセル ( 継続中 ) EGFR 遺伝子変異は各法で同様に検出 野生型症例でパラフィン組織 1 例 clamp 法で検出不可も 本法 シーケンス法では検出可能 感受性変異陽性例 13 例中 EGFR-TKI 治療 7 例 5 例は奏功し継続中 2 例は耐性化後死亡 T790M 変異 第 52 回日本肺癌学会総会
QP 法を用いた KRAS および BRAF 遺伝子変異解析 進行肺癌症例 (2009-2010stage ⅢB, Ⅳ) 生検のパラフィン切片 : 49 例細胞検体 : 18 例 i-densy( アークレイ ) を用いた QP 法と Tm 解析により KRAS codon12,codon13 遺伝子 BRAF V600E 遺伝子の変異解析 その他 38.9% BRAF 変異 4.1% KRAS 変異 22.4% EGFR 変異 34.6% EGFR 変異群 KRAS 遺伝子変異 Codon 12-Ser: tagtggc Codon 12-Asp: tgatggc KRAS or BRAF 変異群 Log-rank p=0.06 その他の群 Log-rank p=0.02 第 101 回日本病理学会総会
LBC EGFR 遺伝子変異解析 肺腺癌における EGFR-TKI 治療感受性予測 迅速 簡便 省スペースなどの技術開発により 右 :Thinprep2000( オリンパス ) 左 :i-densy (ARKRAY) ベッドサイド分子細胞診断 One-day 分子細胞診断 治療に直結する細胞診 第 50 回日本臨床細胞学会秋季大会
LBC ALK 融合遺伝子の検出 肺腺癌 ALK 融合遺伝子陽性クリゾチニブ治療感受性
ALK 肺癌患者の胸水 パパニコロウ /HE ニチレイ ALK 検出キット 摺合せ Abcam ALK(5A4) 1/50 + DAKO FLEX Linker Thinprep Thinprep セルブロック
肺癌診療における細胞診の役割 LBC を活用した 組織型鑑別 EGFR 遺伝子変異解析 ALK 融合遺伝子変異解析今後 分子標的薬の開発と共にさらに増える可能性 LBC Thinprep 法の活用が期待される 今後 細胞診技術に求められること 適切な検体採取 ( 形態や分子のダメージを減らす ) 適切な検体保存 ( あらたな治療標的分子の解析 )
肺癌診療における細胞診の役割 LBC を活用した 組織型鑑別 EGFR 遺伝子変異解析 ALK 融合遺伝子変異解析今後 分子標的薬の開発と共にさらに増える可能性 LBC Thinprep 法の活用が期待される 今後 細胞診技術に求められること 適切な検体採取 ( 形態や分子のダメージを減らす ) 適切な検体保存 ( あらたな治療標的分子の解析 )