組換え酵素を用いた配列部位 特異的逐次遺伝子導入方法 Accumulative gene integration system using recombinase 工学研究院化学工学部門河邉佳典 2009 年 2 月 27 日
< 研究背景 > 1 染色体上での遺伝子増幅の有用性 動物細胞での場合 新鮮培地 空気 + 炭酸ガス 使用済み培地 医薬品タンパク質を生産する遺伝子を導入 目的遺伝子の多重化 ( 増幅 ) トランスジェニック動物での場合 マイクロキャリァー 動物細胞 バイオリアクターでの培養 目的遺伝子の多重化 ( 増幅 ) バイオ医薬品等の大量生産 目的遺伝子 バイオ医薬品等の大量生産
2 本技術の特徴 染色体 DNA 上の特定の配列部位特異的に逐次遺伝子導入する
3 本研究で利用した遺伝子組換え酵素のシステム Cre-loxP の組換えシステム 1 認識 組換え酵素 ( バクテリオファージP1 由来 ) 2 環状構造 3 切り出し連結 Cre 目的遺伝子 Cre + loxp 配列 組込み反応 目的遺伝子 組込み反応 目的遺伝子 一度の組込みではなく 多重化させることにより遺伝子増幅として使用する ( 変異 loxp 配列の使用 )
4 選出した変異 loxp 配列の特性 loxp 配列 : 組換え酵素 Cre の認識サイト (34bp) 13bp 8bp 13bp ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT アーム変異の特性 1) 左アーム変異 + 右アーム変異 1) P. Oberdoerffer et al. (2003) Nucleic Acids Research,31, e140- Cre 反応非反応性 loxp 配列のアームの変異により組込反応が促進される スペーサー変異の特性 2) スペーサー 1 スペーサー 2 + Cre 反応 2) P. I. Missirlis et al. (2006)BMC Genomics 7,73- + 特定のスペーサーとのみ反応できる
< 本技術の原理 > 5 組換え酵素 Cre と変異 loxp を用いた遺伝子導入システム CMV プロモーター loxp1 loxp2 目的遺伝子 1 loxp3 P1 ( 動物細胞染色体 ) P2 loxp2 Cre 反応 ( 組込 ) 目的遺伝子 1 非反応性 スペーサー 1 スペーサー 2 右アーム変異 loxp1 目的遺伝子 2 loxp4 左アーム変異 P3 非反応性 Cre 反応 ( 組込 + 削除 ) loxp1 非反応性 目的遺伝子 2 目的遺伝子 1 非反応性
6 動物細胞染色体 DNA 上での部位特異的逐次組込み反応 Phase contrast 各目的遺伝子の発現 GFP 染色体 DNA を鋳型とした PCR 解析 λh Marker NC (water) CHO/P123 (1680 bp) DsRed MERGE φx Marker NC (water) CHO/P123 (840 bp) 目的遺伝子の発現および PCR の結果より目的遺伝子の配列部位特異的な逐次組込み反応を確認した
7 目的遺伝子発現ユニットのみを導入することができる遺伝子導入システム 細胞染色体 目的遺伝子 1 Cre 反応 ( 置換 ) 目的遺伝子 1 非反応性 目的遺伝子 2 Cre 反応 ( 置換 ) 目的遺伝子 2 非反応性 目的遺伝子 1 非反応性
8 動物細胞染色体 DNA 上での逐次置換組込みシステムの結果 各目的遺伝子の組込み置換反応 位相差観察 GFP 染色体 DNA を鋳型とした PCR 解析 DsRed GFP 884b p - Cre φx + water CHO (WT) 810bp 884bp DsRed Merge CHO (WT) - Cre φx + water 810bp 目的遺伝子の発現および PCR の結果より目的遺伝子の配列部位特異的な逐次置換組込み反応を確認した
9 従来の染色体 DNA への遺伝子導入法 : 1 ランダム挿入 2 相同組換え 3 ウイルスベクター法
10 従来技術とその問題点 ~1 ランダム挿入 ~ 目的遺伝子 + 薬剤耐性遺伝子 対応する薬剤を加える 染色体上で遺伝子組込みの起こった細胞が生き残る 目的遺伝子を薬剤耐性遺伝子とともに導入し 薬剤による選別を行うことで 導入した目的遺伝子が染色体に組込まれる 問題点 効率が低い 確実性に欠ける 長い期間が必要である
11 従来技術とその問題点 ~2 相同組換え法 ~ 相同組換え neo r tk HSV ( 薬剤応答遺伝子 ) 変異 X 遺伝子 X 遺伝子置換ベクター 目的遺伝子断片の両側に 導入したい染色体部位の遺伝子配列をはさむことで 目的染色体部位に挿入できる 染色体 DNA X 遺伝子標的遺伝子 X 遺伝子の改変 問題点 組込み効率が低い 導入する細胞に大きく依存する
12 従来技術とその問題点 ~3 ウイルスベクター法 ~ 染色体 DNA への効率的な遺伝子導入法 レトロウイルスベクター 宿主細胞の染色体に目的遺伝子を導入することができる 問題点 導入部位の不制御性 感染の危険性 ベクター生産設備 ( 物理的封じ込めレベル P2~)
13 本技術の特徴 従来技術との比較 本技術では 染色体 DNA において組換え酵素 Cre 依存的かつ配列部位特異的に 複数の遺伝子を安定して逐次導入することができる ランダム挿入 相同組換え レトロウイルスベクター 本技術 簡便性 高い 高い ベクター生産設備 (P2) 高い 安全性 高い 高い 感染の危険性 高い 導入部位 ランダム 配列部位特異的 ランダム 配列部位特異的 導入効率 10-4 10-6 高い 数 %
14 想定される用途 1 有用物質生産のための遺伝子導入 1 染色体にあらかじめ loxp 配列を導入しておく ( 相同組換えで部位特異的に loxp 配列を導入しておいても良い ) loxp 配列に複数の目的遺伝子を逐次導入することで 生産性を向上させる 染色体 loxp 目的遺伝子 1 目的遺伝子 2 目的遺伝子 1 2 ホットスポット染色体 DNA 上には ホットスポット という生産性を向上させられる部位がある ホットスポットの探索 あらかじめ薬剤耐性遺伝子を変異させ 薬剤に過敏させておき 薬剤の濃度を上昇させることによりホットスポットを探索する 薬剤耐性遺伝子とともにloxP 配列をホットスポットに導入させることで ホットスポット部位特異的に目的遺伝子を逐次遺伝子導入し 生産性を向上させる
15 想定される用途 2 配列部位特異的に ES 細胞へ複数遺伝子をノックイン ROSA26 遺伝子座 ~ マウス第 6 染色体 ヒト第 3 染色体 ~ PNAS 94:3789-2794, 1997. Nat.Biotechnol. 25:1477-1482, 2007 目的遺伝子や様々なレポーター遺伝子を組み込むために適した遺伝子領域 ( 過去に検討された多くの細胞で 外来遺伝子を安定的に発現できる ) ES 細胞の遺伝子改変に有益な遺伝子座 本技術により酵素的に目的遺伝子が導入された ES 細胞を効率的に樹立することができる 一度 ROSA26 遺伝子下流に変異 loxp 配列を導入した ES 細胞を樹立しておけば Cre 組換え酵素を用い 配列部位特異的に目的遺伝子を複数導入することができる ES 細胞 loxp 配列が組み込まれている ROSA26 遺伝子座に目的遺伝子を導入している 安定発現部位へ導入された分化細胞 遺伝子改変動物の作製 個体を用いた物質生産
16 実用化への課題 現在 動物細胞染色体 DNA で配列部位特異的な逐次遺伝子導入ができることを確認した 今後は 組換え反応効率のさらなる向上のために変異 loxp 配列を探索 目的遺伝子の細胞への供給法 について検討する予定である
17 企業への期待 組換えタンパク質生産 ( 微生物宿主である大腸菌 酵母 真核生物として昆虫細胞から動植物細胞を用いた各宿主 ベクター系 ) 再生医療工学に関わる細胞の遺伝子的改変 ( 幹細胞の分離 培養 分化制御から再プログラム化 ノックアウト トランスジェニック動物作製 ) について部位特異的遺伝子導入を必要とする場合に 本技術の適用が有効と思われる
18 本技術に関する知的財産権 発明の名称 : 組換え酵素を用いた遺伝子増幅方法出願番号 : 特願 2008-034640 出願人 : 国立大学法人九州大学発明者 : 上平正道 河邉佳典 竹之内雄太
19 お問い合わせ先 九州大学知的財産本部技術移転グループ TEL 092-642 -4361 FAX 092-642 -4365 e-mail transfer@imaq.kyushu-u.ac.jp