Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 加工食品中の特定原材料 ( そば ) の分析 Analysis of Allergic Substances (Buckwheat) in Processed Foods Hiroko MATSUMOTO, Kayo HAGINO, Narue SAKAMAKI, Mitsuo NAKAZATO and Kazuo YASUDA Keywords buckwheat allergy allergic substances ELISA method PCR PCR test 緒言 14 4 5 1 11,3) ( ) ELISA ELISA PCR ELISA 4,5) 5 DNA 実験方法 1. 試料. 試薬 ELISA ( ) FASTKIT N ( ) M DNA QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit DNA Applied Biosystems AmpliTaq Gold PCR PCR PCR Cambrex NuSieve GTG agarose SeaKem GTG agarose DNA Amersham Biosciences 50Base-Pair ladder 100Base-Pair ladder TBE PCR 3. 機器 IMF 700G IKA T5 HF93 Oster OsterizerTECAN SUNRISE CLASSIC DTU-18 7930 - UV-1600 Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700 190-003 3-16-5 Tama Branch Institute, Tokyo Metropolitan Institute of Public Health 3-16-5, Shibasaki-cho, Tachikawa, Tokyo 190-003 Japan
18 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 Mupid- 4. そばタンパク抽出法及び ELISA 検査 1) そばタンパク抽出法 : g 38 ml 3 0,500 rpm 30 4 3,000 g 0 0 5 ) ELISA N M 5. そば DNA 抽出法及び PCR 検査 1) そば DNA 抽出法 g 1 g 30 ml DNA QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit DNA DNA ) DNA 試料液の濃度および精製度の測定 DNA 60 nm 80 nm DNA 60 nm 1 DNA 50 ng/µl DNA 60 nm 80 nm 60 nm/80 nm PCR 1..5 DNA 0 ng/µl 0 ng/µl DNA 3) PCR 反応液組成 PCR 1 PCR Applied Biosystems 0. mmol/l dntp 1.5 mmol/l 0. µmol/l F- 0. µmol/l R- 0.05 units/µl DNA DNA 0 ng/µl.5 µl 5 µl 4) PCR 反応条件 95 10 95 30 60 30 7 30 40 7 7 4 5) 電気泳動 0.5 µg/ml NuSieve GTG agarose SeaKem GTG agarose(1:1) 0.5 µg/ml TBE 100V UV31 nm PCR DNA 14bp 17bp 6. 加熱調理実験 ELISA PCR. 7. 加工食品及び麺類中の そば の検査 ELISA PCR DNA 8. そばゆで汁からのそば抗原タンパクのうどんへの移行実験 50 g 4 L 4 3 L 50 g 1 7 1.5 L 3 3 ELISA PCR 結果及び考察 1. 抽出法の検討 1) そばタンパク抽出法 4 1 4 0
55, 004 19 表 1. 各種抽出用器具によるそば抗原タンパク抽出量 抽出用器具 回転数 (rpm) 抽出時間 抽出容器 そば抗原タンパク量 CV (%) (µg/g) 1 ミルサ- 0,000 30sec 3 回 ガラス専用容器 1,489 1.0 ホモジナイザ- 1,000 5min 3 回 ステンレス専用容器 1,374.5 3 シャフトジェネレーター付きホモジナイザー 0,500 30sec 3 回 PP 製遠沈管 1,636.9 4 オスタ - ブレンダ - 16,800 45sec 3 回ガラス専用容器 1,45 5.4 n=3 n=3 94 CV 3 ) そば DNA 抽出法 CTAB CTAB DNA DNA 65 15 DNA DNA QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit. 加熱処理による検査への影響 ELISA ELISA ELISA 100 1.5 ELISA PCR DNA 3. 加工食品中の そば の検査 ELISA ELISA PCR 30 3 表. そばの加熱処理による ELISA 及び PCR 検査結果 加熱処理条件 ELISA 法 水分含量 ( 粗脂肪 ) 生そば100に対するそば抗原タンパク量 (%) (%) N 社キット M 社キット PCR 法 A 生そば 7.6 100 100 + B 蒸す 10 分 31.8 75.3 85.4 + C ゆでる 3 分 63.9 5.9 61.6 + D 炒める 5 分 ( ゆでそば ) 0.(0.06) 9.9 30.1 + E 加圧加熱 10 10 分 ( オートクレーブ ) 3.8 5.8 4. + F 揚げる 180 5 分 (5.1) 3..6 + G 焼く 180 7 分 ( オーブン ) 0.67 1.6 1.4 +
130 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 表 3. そば 加工食品中のアレルギー物質検査 ELISA 法 No. 品名そば抗原タンパク量 ( µg/g) N 社キット M 社キット PCR 法 1 そば粉 1 170,000 370,000 + そば粉 87,000 30,000 + 3 生そば 19,000 44,000 + 4 揚げそば 45 81 + 5 そば粉入り韓国冷麺 100 100 + 6 そば粉入りパスタ 14,000 6,800 + 7 そば雑炊 ( レトルト ) 10 6 + 8 発芽玄米入りそば粥 ( フリーズドライ ) 634 4,846 + 9 そばまんじゅう 96 100 + 10 そばおやきの皮 ( 野沢菜入り ) 1,700 1,300 + 11 そばおやきの具 ( 野沢菜入り ) 1 14 + 1 そば茶 ( 実 )1 1. ND + 13 そば茶 ( 実 ).1.4 + 14 そばの実入り紅茶 ND ND + 15 そばチップ 650 860 + 16 そばせんべい 1,600 1,700 + 17 そばぼうろ 37 86 + 18 そばかりんとう 63 30 + 19 そばクッキー 1 1,500 1,100 + 0 そばクッキー 15 19 + 1 そばラスク 1,500 970 + そばようかん 80 110 + 3 そばチョコレート 700 410 + 4 そばあめ 1,800,00 + 5 そばはちみつ ND.7 + 6 そば新芽 1.3 1 + 7 そば七味唐辛子 4.6 4.5 + 8 ペットボトル入りそば茶 ND ND + 9 そばビール ND ND + 30 そば焼酎 ND ND - ND:1 µg/g 未満 10 µg/g 100 1 µg/g ELISA PCR DNA DNA DNA PCR 4.ELISA 検査の偽陽性に対する PCR 法での確認 ELISA 4,5) N ELISA N 13.8 µg/g M.6 µg/g PCR 1 ELISA ELISA PCR
55, 004 131 植物プライマー そばプライマー A B C D E F C D E F A 図 1.ELISA 検査で偽陽性を示した試料の PCR 法での確認 A:50bp ladder, B:100bp ladder, C: そば粉 D: 小倉ようかん, E: そばようかん, F: 陽性コントロール 5. 麺類の検査 4 ELISA 4 1 PCR 6. そばゆで汁からのそば抗原タンパクのうどんへの移行 4 5 µg/g まとめ ELISA PCR DNA ELISA PCR 1 µg/g DNA ELISA 表 4. 市販麺類の検査結果 麺の種類 検体数 陽性検体 品名 表示の有無 ELISA 法そば抗原タンパク量 (µg/g) N 社キット M 社キット PCR 法 生うどん ゆでうどん 13 5 8 細生うどん 無 6.9 4.6 + 生うどん 無 1.3 ND / 手打ち生うどん 無 1.5 1.3 / 手練れ生うどん 無 3.4 6.5 / 手打ちうどん ( 生 ) 無 ( 注意喚起 ) ND 1. / ゆでうどん 無 4.7 4.8 + ゆでうどん 無 ND.0 + 中華麺 生ラーメン 無 3.7.4 + 生中華麺 a 無 3.4 1.9 + 15 5 生中華麺 b 無 1. ND / 卵麺 無 1.1 ND / 生中華麺 c 無 1.1 ND / その他の麺 6 1 韓国冷麺有 100 100 + 計 4 13 ND:1µg/g 未満 /: 未試験
10 そば抗原タンパクばゆで汁原液13 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. P.H., 55, 004 µg/g 10 そ100 80 60 希釈量40 0 ゆで汁太麺 µg/g 100 80 60 希40 釈1 ゆ1 で0 3 3. そばゆで汁でうどんをゆでた時のそば抗原タンパクの移行汁図 そばゆで汁原液細麺 0 0 1 3 1 3 処理条件 1. ゆで汁原液でゆでた直後. 水に漬ける 3. 流水にさらす 1 希釈ゆで汁でゆでた直後 水に漬ける 3 流水にさらす 40 003 11 16 004 87 004 5 文献 1) 13 3 15 79 (001) ) 13 3 1 46 (001) 3) 14 11 6 1106001 (00) 4) 53 5-33 003 5) 1 68-76 00