超好熱性アーキアは遺伝子工学技術 開発にとっての金山である! 九州大学 大学院農学研究院石野良純
アーキアの分子生物学 1 1973 年 1988 年 2012 年 遺伝子組換え技術の開発 PCR 法の開発 ゲノム編集技術の開発 全て原核微生物の分子生物学から始まっている 新たな金 ( 発見 ) を掘り起こす可能性大 アーキア研究は分子生物学者にとっては金山である
超高温環境の遺伝子資源を利用 2
アーキアの遺伝情報維持と伝達機構 3
frequency in the cells C 塩基の脱アミノ化と遺伝子変異の発生 U G A C C T G 4 Deamination Uracil G Hx C C T G A Hx Hypoxanthine G Hx C C C G Replication G X Xanthine A:T G:C point mutation
損傷塩基の二つの修復経路 5 BER (Base Excision Repair) DNA glycosylase 5 3 G OH C A T C T G T A 3 5 AP endonuclease DNA polymerase DNA ligase 5 3 G A C A T C T G T A 3 5 AER (Alternative Excision Repair) Endonuclease V 5 3 G Hx C A T C T G T A 3 5?
超好熱性生物の優れた損傷塩基修復機構 6 超好熱性アーキア Pyrococcus furiosus Thermococcus kodakarensis 生育 100 C 85 C AER Endonuclease V (EndoV) Endonuclease Q (EndoQ)
P. furiosus のエンドヌクレアーゼ V 7 32 P 5 3 49 nt Hx T 49- EcoEndoV PfuEndoV PfuEndoV D35A 32 P 5 3 26 nt Hx T EndoV 26- reaction temp. 37 C 60 C 8 M Urea-PAGE PfuEndoV はヒポキサンチン塩基の一塩基下流のリン酸ジエステル結合を切断する Kiyonari, S. et al. (2014) J. Biochem., 153, 325 333.
アーキアの EndoV はヒポキサンチン特異的 Hx U X mismatch AP P. furiosus + 8 A. fulgidus + nd nd M. musculus (mouse) + + nd E. coli + + + + + T. maritima + + nd + + nd: not determined Archaeal EndoV has high specificity to Hypoxanthine
P. furiosus 細胞内には別の切断酵素がある 9 P. furiosus cell extracts cell extracts fractions cation exchange chromatography substrate cleavage assay cell extracts 32 P 5 3 24 mer Hx T PfuEndoV 26 mer 49 mer product 26 25 24 (nt) 8 M urea-12% PAGE
purified fraction (Mr, 10 3 ) 00 80 70 90 60 50 40 30 25 20 MonoS Frac. 48 10% SDS-PAGE silver staining 新規 DNA 切断酵素の探索 10 candidate proteins obtained from MS analysis PF0041 PF0053 PF0124 PF0251 PF0258 PF0279 PF0301 PF0875 PF0988 PF1123 PF1140 PF1257 PF1385 PF1414 PF1551 PF1615 PF1717 PF1776 PF1862 oxidative cyclase ATP dependent RNA helicase hypothetical protein hypothetical protein endonuclease IV ABC transporter cobyric acid synthase hypothetical protein hypothetical protein hypothetical protein translation initiation factor eif-2, subunit alpha nol1-nop2-sun family nucleoar protein DNA polymerase, bacteriophagetype annotated as flap endonuclease 1 (rad2) hypothetical protein hypothetical protein translation initiation factor eif-2, subunit gamma hypothetical protein DNA-binding protein Gene cloning & expression in E. coli Cleavage assay PF0988 PF1862 PF1551
Preparation of recombinant PF1551 PF1551 がそれだった! 11 Detection of the PF1551 protein in P. furiosus cells Mr ( 10 3 ) 212 158 116 97.2 66.4 55.6 42.7 34.6 Mr ( 10 3 ) 175 80 58 46 27.0 30 20.0 14.3 12% SDS-PAGE CBB stain 25 17 12% SDS-PAGE Western blotting
Hx + + 新規酵素の損傷塩基特異性は広い 12 U AP G/T ss ds ss ds ss ds ds ss ds ss ds + + + + + + + + + X (nt) 26 25 24 23 5 -Cy5/ 32 P 24 Hx U X 25 27 5 - - - - - TGACGACA TGTAGC - - - - - 3 3 - - - - - ACTGCTGTACA TCG - - - - - 5 (nt) 27 26 8 M urea-12% PAGE
新規酵素の金属依存性の損傷塩基への結合 13 dsdna *A/T *Hx/T *Hx/T Metal Mg Mg no metal PF1551 EMSA protein-dna DNA 4% PAGE Incubation 60 C 10 min 50 mm 1 mm 0.01% 1 mm 5 nm 0 50 nm Tris-HCl, ph 8.0 DTT Tween20 MgCl 2 dsdna PfuEndoQ Metal-, Hxdependent DNA binding
新規酵素をエンドヌクレアーゼ Q と命名 14 A novel endonuclease, which hydrolyses the phosphodiester bond at 5 of the lesion was identified in P. furiosus Endonuclease Q (EndoQ) DnaQ, RecQ..EndoQ (discovered in Q-shu Univ)
T. kodakarensis の EndoQ 15 Hx U AP G/T non damaged X ss ds ss ds ss ds ds ss ds ss ds + + + + + + + + + + + (nt) 26 25 24 23 (nt) 27 26 8 M urea-12% PAGE TkoEndoQ
Relative activity Relative Activity Relative activity Relative activity 1 0.5 0 1 0.5 0 EndoQ の耐熱性 耐塩性 P. furiosus EndoQ T. kodakarensis EndoQ 75 C 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( ) 50 mm NaCl/KCl NaCl KCl 0 100 200 300 400 500 Salt concentration (mm) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 75 C 45 55 65 75 85 Temperature ( C) KCl NaCl 0 100 200 300 400 500 Salt Concentration (mm) 16 100 150 mm KCl
EndoQ 切断産物はリガーゼで再結合できる 17 5 OH P 3 Cleavage reaction EndoQ Hx T TkoEndoQ + + + DNA Ligase + Incubation + + DNA denaturing Buffer change Annealing Incubation with DNA Ligase (nt) 26 25 24 23 8 M urea-12% PAGE
PfuEndoQ EndoQ のドメイン構成 18 TkoEndoQ N I II III IV Zinc finger 424 C E H E Interaction with PCNA PHP (polymerase and histidinol phosphatase) domain and motifs
生物界における類似分子の分布 19 細菌のヒスチジンホスファターゼ Bacillus subtilis_bsuhpp Thermus thermophilus HB8_Tth HPP Deinococcus radiodurans DraHPP 細菌の Pol III alpha の N 末ドメイン Bacillus subtilis_bsupoliii-alpha Thermus thermophilus HB8 _Tth PolIII-alpha Escherichia coli_ecopoliii-alpha 細菌 アーキアのPolXのC 末ドメイン EndoQ Pyrococcus furiosus DSM 3638 Thermococcus kodakarensis KOD1 Methanosarcina acetivorans C2A Methanopyrus kandleri AV19 Methanococcus maripaludis C6 Methanothermobacter thermautotrophicus str. Delta H Desulfovibrio sp. X2 Bacillus subtilis アーキアの PHP- ドメインタンパク質
EndoQ による損傷塩基修復モデル 20 EndoQ EndoQ EndoV 5 3 5 3 A C Hx G T A C Hx G T T G T C A T G T C A 3 5 3 5 DNA pol Fen 1 5 3 A C A T T G T C A 3 5 DNA Lig 5 3 A C A G T T G T C A 3 5 helicase 5 3 A C T T G T C A 3 5 DNA pol 5 3 A C A G T T G T C A 3 5
cleavage site EndoQ と EndoV の活性比較 21 Property PfuEndoQ PfuEndoV second bond 5 of damage 3 from damage base specificity hypoxanthine + + uracil + xanthine + abasic + mismatch strand specificity ssdna + + dsdna + + ssrna + dsrna + RNA in RNA/DNA + DNA in RNA/DNA + + number of molecules per cell 1 10 3 2 10 2
新技術の特徴 従来技術との比較 22 損傷塩基を認識して作用する酵素はこれまでに多く知られている 損傷塩基を含む DNA 鎖のリン酸ジエステル結合を直接切断する酵素は少ない 損傷塩基の 5 側のリン酸ジエステル結合を直接切断する酵素はもっと少ない 損傷塩基を含む DNA 鎖を切断する耐熱性酵素は少ない
新技術の新規性 23 EndoQ の新規性 損傷塩基の直ぐ 5 - 側のリン酸ジエステル結合をライゲーションによる再結合可能な型に切断する高度耐熱性酵素である 損傷塩基の特異性の範囲が広い (U, Hx, X, AP and?) 熱安定性に優れている DNA 鎖に特異的である 一本鎖 二本鎖とも切断する
想定される用途 24 脱アミノ塩基など 塩基損傷の検出法へ応用できる 損傷塩基の 5 - 側を特異的に切断し 必要に応じて再結合も可能である性質を利用した遺伝子工学の新技術開発に利用できる 上記のような技術を自動化するような装置開発をする場合には 酵素の安定性が特に有利になる
実用化に向けた課題 25 EndoQ は特異的な活性を有するエンドヌクレアーゼなので 遺伝子工学技術開発ツールとしてのポテンシャルを有する EndoQ の特性を生かした新技術開発を目指し それに必要な材料を揃える 脱アミノ化塩基の簡易検出法を考案する際には機械工学関係の協力が必要
企業への期待 26 共同研究開発を歓迎いたします! 遺伝子工学技術を持つ企業との連携が望ましいが 遺伝子ビジネスへの参入を考えられる企業も大歓迎です 当研究室では各種 DNA に作用する酵素を取り揃えています また新規活性をスクリーニングする系も所有しています EndoQ の特性を利用した技術開発のアイデアを思いつかれたら 是非ご相談下さい
本技術に関する知的財産権 27 発明の名称 : 新規 DNA 切断酵素 出願番号 : 日本 特願 2015-515912 米国 14/890,009 欧州 14794422.7 出 願 人 : 九州大学 発 明 者 : 石野良純 石野園子 白石都 米国は 特許許可通知を受け 現在 登録手続き中
産学連携の経歴 28 1995 年 -2000 年 JST ERATO プロジェクト参加 2004 年 -2006 年 JST 委託開発事業参加 2005 年 -2010 年 JST BIRD 事業に参加 2012 年 -2017 年 JST CREST 事業参加 2002 年 -2019 年 企業との共同研究実績 2003 年 -2005 年 NEDO 知的基盤創成研究開発事業参加 2015 年 -2016 年 JST プレベンチャー事業との共同研究 バイオ関連企業 7 社
29 お問い合わせ先 九州大学 学術研究 産学官連携本部 知的財産グループ TEL 092-832-2128 FAX 092-832-2147 e-mail transfer@airimaq.kyushu-u.ac.jp