PowerPoint プレゼンテーション

応用微生物学 ( 第 3 回 ) 有機酸

ATP 消費 ATP 消費 NADH 生成 ATP 生成 ATP 生成 NADH 消費 NADH 消費

講義内容 1. 生産菌と有機酸の種類 2. 具体例 ( 学問的レベルのものも含む ) (2-1) 酢酸 (2-2) 乳酸 (2-3) クエン酸 (2-4) コハク酸 (2-5) イタコン酸 (2-6)3- ヒドロキシプロピオン酸

酢酸バクテリア Acetobacter pasteurianus Acetobacter xylinum Moollera thermoacetica 乳酸バクテリア Lactobacillus Bifidobacterium イタコン酸カビ Aspergillus terreus プロピオン酸 Propionibacterium クエン酸カビ Aspergillus niger コハク酸バクテリア Escherichia coli( 遺伝子改変株 ) Actinobacillus succinogenes Corynebacterium glutamicum( 遺伝子改変株 )

酢酸菌酢酸菌属 (Acetobacter) 細菌の一群. グラム陰性, 偏性好気性の桿菌で, しばしば鎖状に連なり, 非運動性. 2~11% の酢酸による強酸性のもとでアルコールを酸化できる点で, 近縁のシュードモナス属菌と区別される. 酢酸グルコン酸ソルボースの製造など, 発酵工業に重要. 代表種は Acetobacter aceti. [ 株式会社岩波書店岩波生物学辞典第 4 版 ]

http://web.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~oubi/detail2.html

ピロロキノリンキノン [ 英 pyrrolo quinoline quinone] PQQ と略記.4,5 ジヒドロ 4,5 ジオキソ 1H ピロロ [2,3 f] キノリン 2,7,9 トリカルボン酸の略称. キノン補酵素の一つ. 還元型は PQQH 2 と表される.NAD,FAD に次ぐ第三の酸化還元補酵素として 1979 年に構造決定された. 発見当初はメトキサチンともよばれた. メタンおよびメタノール資化菌, 酢酸菌などのアルコールデヒドロゲナーゼ ( メタノールデヒドロゲナーゼ ) およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ,Pseudomonas や Acinetobacter のグルコースデヒドロゲナーゼなどの非共有結合型補酵素として働く. 酵素との結合には Ca 2+ が必要 ( 他の二価金属イオンでも代替可 ) とされる.PQQ の検出定量にはグルコースデヒドロゲナーゼのアポ酵素が用いられる. また, アルカリ溶液中でグリシンニトロブルーテトラゾリウム塩を用いる染色法でも検出される. モル吸光係数 ε 249nm は 18400M -1 cm -1. 酸化還元電位 (PQQ/PQQH 2 ) は +90mV(pH7.0).PQQ の生合成には少なくとも 6 個の遺伝子が関与し, チロシンとグルタミン酸が縮合して環化と酸化を受けると考えられているが, 詳細な生合成経路は不明. [ 株式会社岩波書店岩波生物学辞典第 4 版 ]

http://www.marukan.com/quality/step/index.html#7

http://iio-jozo.livedoor.biz/archives/50045696.html http://nadachemistry.web.fc2.co m/bunkasai/2012/2012-11.pdf

食酢醸造過程の微生物学的解析

伝統的発酵食品製造の特徴衛生的作業以外の無菌操作を積極的には行わない複数の微生物による機能を統合的に利用微生物機能の安定的な発現を方向性を持って達成伝統的発酵食品製造 = 集団微生物による物質変換過程解析のモデル系培養法による解析分子生物学的手法による解析上記解析結果を統合した多面的解析

伝統的発酵食品製造 ( 集団微生物による物質変換過程解析のモデル系 ) 酢に着目その理由食酢には伝統がある ( 塩と共に最古の調味料である ) 食酢醸造現場には発酵的多様性がある ( 固体表面 [ 菌膜 ] と液内の2つの部位が存在する ) 目的産物が明快である ( モデル系として適する )

品質表示基準による分類食酢の分類発酵法による分類醸造酢穀物酢米酢米黒酢大麦黒酢果実酢りんご酢ぶどう酢合成酢表面発酵法深部発酵法固定化発酵法固体発酵法米黒酢と穀物酢の醸造過程を解析

穀物酢とは?( 食酢品質表示基準より ) 醸造酢のうち原材料として 1 種又は 2 種以上の穀類 ( 酒かす等の加工品を含む ) を使用したものでその使用総量が醸造酢 1L につき 40g 以上であるものをいう

粕酢製造過程酒粕を熟成湯を加えた後に固形分を取り除く種酢アルコールを添加し酸度を約 1.5% エタノール濃度を約 6% に調整酢酸菌膜を浮かべ 2~3 ヶ月間静置酢酸発酵完了後熟成

mm mm 発酵液のパラメータの変遷 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 エタノールグルコース 1000 800 600 400 200 0 0 7 14 21 28 35 42 Time(Day) 酢酸乳酸 0 7 14 21 28 35 42 Time(Day) エタノールから酢酸への変換が定常的に行われている乳酸の濃度が米黒酢 (Max 150 mm) に比べ低い値で推移

DGGE 法 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE; 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動 ) 法は, 同じ長さの二本鎖 DNA 断片を塩基配列の違いに基づいて分離する電気泳動法である. この特徴を利用して, 遺伝子の変異の検出や微生物群集構造解析など,DNA 多型の解析をすることができる. 尿素やホルムアミドなどの変性剤により二本鎖 DNA は解離して一本鎖となる. 変性剤に対する二本鎖の安定性はその塩基配列によって異なり,GC 塩基含量が多い領域ほど安定性が高い ( 解離しにくい ). そこで DGGE に用いる DNA 断片には GC 塩基含量に富んだ DNA(GC クランプ ) を付加し, 完全に一本鎖に解離することを防ぐ. また, ポリアクリルアミドゲルには低濃度から高濃度の勾配がついた変性剤が含まれる. この変性剤濃度勾配ゲルを用いて GC クランプを付加した二本鎖 DNA 断片を泳動すると, ゲル上の一定の位置で二本鎖 DNA の一部が解離するために泳動速度が落ち, 移動しなくなる.DNA 断片の塩基配列が違うと, 解離の起こる変性剤濃度が異なるため, 泳動の止まる位置も異なる. 従って, 塩基配列の異なる複数の DNA 断片を同時に泳動すると, 配列の異なる断片を別々のバンドとして分離することができる. 同じ目的に活用されている TGGE( 温度勾配ゲル電気泳動 ) 法と比較すると,DGGE 法はシャープなバンドパターンが得られるため, ゲル内における分解能の高さが特徴である. 全細菌に普遍的に存在しかつ種の推定が可能な遺伝子, 例えば 16S rrna 遺伝子を標的とした PCR 法を組み合わせた PCR-DGGE 法を用いることで, 試料中のすべての細菌を対象とした群集構造解析が可能となる. 電気泳動の結果得られたバンドの数は存在する細菌の種類数に相当し, 泳動停止位置は細菌種に固有のものであることから, 電気泳動のバンドパターンを比較することで, 試料中の細菌群集構造の変化相違を追跡することができる. http://www.e-cew.co.jp/microbe-contents/21dgge.html

http://www.e-cew.co.jp/microbe-contents/21dgge.html

酢酸菌膜の DGGE 解析 ( 細菌 ) Day 0 1 7 14 21 28 35 42 10 17 3 推定された微生物種 ( 相同性 ) 1 Acetobacter pasteurianus (100%) 2 Acetobacter pasteurianus (98%) 3 Lactobacillus acetotolerans (100%) 1 2 乳酸菌は殆ど検出されない酢酸菌膜中の主要微生物は A. pasteurianus であり酢酸菌膜の微生物叢に大きな変化は見られない

CFU/g(pellicle) 酢酸菌膜中の生菌数の測定 10 7 1.0E+07 10 6 1.0E+06 10 5 1.0E+05 10 4 1.0E+04 10 3 1.0E+03 10 2 1.0E+02 GYP MRS GMP 0 7 14 21 28 35 42 Time(Day) GYP 培地 ( 主に酢酸菌 ): CaCO 3 を添加クリアゾーンを形成するコロニーを計測 MRS 培地 ( 主に乳酸菌 ): CaCO 3 を添加培地を重層して嫌気状態で培養しクリアゾーンを形成するコロニーを計測 GMP 培地 ( 酵母カビ ): 抗生物質 Streptomycin を添加コロニーを計測 GYP 培地のカウント数が酢酸発酵後期まで維持される酢酸発酵の前半で乳酸菌が多く存在

酢酸菌膜の DGGE 解析 ( 乳酸菌特異的なプライマーを使用 ) 3 4 Day 0 1 7 10 14 17 21 28 35 42 1 2 5 推定された微生物種 ( 相同性 ) 1 Lactobacillus plantarum (100%) 2 Lactobacillus brevis (100%) 3 Lactobacillus acetotolerans (99%) 4 Lactobacillus acetotolerans (99%) 5 Lactobacillus coleohominis (97%) 酢酸菌膜中に乳酸菌が検出された酢酸発酵過程を通して菌膜中に Lb. acetotolerans が存在している Lb. acetotolerans 以外の乳酸菌の菌叢に変化が見られる

DGGE プロファイル ( 単離株との比較 ) 酢酸菌 Gluconacetobacter xylinus A. aceti A. pasteurianus Day28(A. pasteurianus) 単離株 (GYP 培地 ) 乳酸菌 Day 単離株 (MRS 培地 ) :Lb.acetotolerans

穀物酢の纏めと今後の展開培養法と分子生物学的手法による結果の違い ( 特に乳酸菌 ) より多面的な解析を行う必要性分子生物学的手法により存在が示唆された菌株の単離特性解析定量 PCR 存在部位時間特異的な菌 ( 叢 ) の代謝特性の変化

(A) Asaia sp. colonizes the gut epithelium of Anopheles sp.( はまだら蚊 ), Ae. aegypti( しまか属の蚊 ), and S. titanus, establishing a specific association with the insect epithelium( 上皮細胞 ) mediated by an extracellular polysaccharidic matrix that surrounds Asaia sp. cells. Crotti E et al. Appl. Environ. Microbiol. 2010;76:6963-6970 ウィキ

http://www.thefreshloaf.com/node/10375/lactic-acid-fermentation-sourdough

マロラクティック発酵 ( 本当は呼吸とよぶべき ): 酵母がおこなうアルコール発酵に対してこちらの主役は乳酸菌です主な葡萄由来の有機酸は酒石酸とリンゴ酸ですがマロラクティック発酵はこのうちのリンゴ酸が乳酸菌によって乳酸と炭酸ガスに分解されるものですリンゴ酸は Malic acid 乳酸は Lactic acid なので Malo-Lactic Fermentation 略して MLF などとも呼ばれますこの発酵による効果はワインの酸味が柔らかくなることです ( 乳酸はリンゴ酸よりも酸味が弱く穏やか ) また発酵中にいくつかの副産物が生成され香味がより複雑になります ( その結果フレッシュさは一部失われる ) さらに微生物的に不安定な ( つまり微生物に食べられやすい ) リンゴ酸がなくなるためワインの微生物安定性が増します http://www.kikkoman.co.jp/manns/story/dictionary/dekiru.html

マロラクティック発酵 ( はっこう ) 酵母がおこなうアルコール発酵に対してこちらの主役は乳酸菌です主な葡萄由来の有機酸は酒石酸とリンゴ酸ですがマロラクティック発酵はこのうちのリンゴ酸が乳酸菌によって乳酸と炭酸ガスに分解されるものですリンゴ酸は Malic acid 乳酸は Lactic acid なので Malo- Lactic Fermentation 略して MLF などとも呼ばれますこの発酵による効果はワインの酸味が柔らかくなることです ( 乳酸はリンゴ酸よりも酸味が弱く穏やか ) また発酵中にいくつかの副産物が生成され香味がより複雑になります ( その結果フレッシュさは一部失われる ) さらに微生物的に不安定な ( つまり微生物に食べられやすい ) リンゴ酸がなくなるためワインの微生物安定性が増します http://www.kikkoman.co.jp/manns/story/dictionary/dekiru.html

http://microbiochem.weebly.com/ferm.html

ここから

Three main metabolic events that replenish TCA intermediated and predispose the cells to product formation 1.Fast uptake of glucose based on simple diffusion. 2.Unrestricted metabolic flow through glycolysis, making precursors for synthesis of TCA cycle intermediates readily available. 3.Uncoupled NADH re-oxidation resulting in lower levels of ATP and therefore decreased anabolic reactions.

Front Bioeng Biotechnol. 2014; 2: 16. The two-component ArcAB system consists of themembrane-associated sensor kinasearcb and the cytoplasmic response regulator ArcA (Figure2A). ArcB has three cytoplasmic domains (H1,D1,andH2) and two transmembrane. Phosphorylation of H1 is inhibited by oxidized quinones within the cytoplasmic membrane and stimulated by lactate, acetate, and pyruvate. Phosphorylation of H1 leads via several steps to formation of phosphorylated ArcA. This modified protein regulates the expression of numerous genes involved in energy metabolism. It represses genes contributing to respiration and activates those involved in fermentation. For example, the TCA cycle, almost exclusively contributing to anabolic reactions under anoxic conditions, is upregulated in an arca deletion strain during nitrate respiration. Therefore, Pettinarietal. (2008) suggested that arca deletion strains could be promising candidates for the production of reduced bioproducts like polyhydroxyalkanoates. The rationale behind this assumption is that the upregulation of citric acid cycle enzymes under anoxic conditions could potentially lead to elevated concentrations of NADH or NADPH. Beside the above described functions, the ArcAB system is also involved in aerobic hydrogen peroxide resistance and microaerobic redox regulation.

The FNR regulatory protein is the second global regulator for energy metabolism in E. coli. It is part of the Crp-Fnr superfamily and contains a helixturn-helix motif with a nucleotide-binding domain. Expression of fnr is not coupled to growth conditions. Consequently, equal amounts of FNR are available in the cell under oxic and anoxic conditions. Three different forms of FNR occur within the cell: (i) the apoenzyme (apofnr), (ii) a monomeric FNR with a [2Fe-2S] cluster, and (iii) the homodimer containing one [4Fe-4S] cluster per monomer. Of these three forms, only the homodimer functions as a transcriptional regulator. The availability of oxygen within the cell leads to monomerization of the homodimer and the loss of the Fe-S cluster. The absence of oxygen causes a rapid increase of the homodimer concentration. FNR regulates gene expression on a transcriptional level. In summary, FNR activates the expression of genes involved in anaerobic fermentation and respiration, whereas it causes a downregulation of genes essential for aerobic respiration. Front Bioeng Biotechnol. 2014; 2: 16.

Km: 2.45mM www.frontiersin.org February2013 Volume4 Article 23