6. 健 常 者 から 分 離 される 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 について 村 田 敏 夫 柳 生 裕 子 山 口 始 青 木 敏 也 鈴 木 武 雄 ( 山 形 県 村 山 保 健 所 検 査 課 ) 三 瓶 美 香 ( 旧 所 属 : 山 形 県 村 山 保 健 所 検 査 課 現 所 属 : 山 形 県 立 河 北 病 院 検 査 部 ) 山 口 一 郎 ( 山 形 県 村 山 保 健 所 長 ) 背 景 と 目 的 大 腸 菌 は 人 や 哺 乳 動 物 の 腸 内 フローラを 形 成 する 細 菌 のひとつとして 宿 主 に 害 を 及 ぼ すことなく 生 息 している しかし 病 原 性 を 有 する 一 部 の 大 腸 菌 が 人 の 下 痢 症 患 者 や 尿 路 感 染 症 患 者 などから 分 離 される 場 合 がある 尿 路 感 染 症 とは 細 菌 ウイルス 真 菌 などの 尿 路 感 染 により 炎 症 を 引 き 起 こした 病 態 を 指 している 原 因 となる 主 な 病 原 体 としては 大 腸 菌 がおよそ 70%を 占 めており その 他 にシトロバクター プロテウス カンジダ アデノウイ ルスなどがある 当 保 健 所 では 食 品 関 係 に 従 事 する 健 常 者 の 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 の 検 査 を 行 っている 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 のほとんどは enterohemolysin と 呼 ばれる 溶 血 素 を 産 生 することから 血 液 寒 天 培 地 における 溶 血 を 指 標 としてスクリーニング 検 査 を 実 施 している その 際 にわれわれは enterohemolysin とは 異 なる 溶 血 素 である α ー hemolysin を 産 生 する 大 腸 菌 を 多 数 分 離 した αー hemolysin は 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 の 主 要 な 病 原 因 子 のひとつであり 赤 血 球 や 尿 細 管 細 胞 に 対 して 細 胞 毒 性 を 示 すことが 知 られている そこで これらの 分 離 株 の 遺 伝 学 的 および 細 菌 学 的 性 状 を 調 べた 結 果 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 である 可 能 性 が 示 唆 された また これまでの 調 査 で α ー hemolysin を 産 生 する 大 腸 菌 が 同 一 の 健 常 者 から 繰 り 返 し 分 離 されており 当 該 菌 がヒトの 腸 管 内 に 長 期 間 定 着 していることが 推 測 された 京 都 大 学 の 山 本 らは 多 くの 病 原 因 子 を 保 有 する 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 が 直 腸 に 存 在 することが 尿 路 感 染 症 の 危 険 因 子 のひとつ であると 報 告 している 1) 以 上 のことから 地 域 の 健 常 者 における 大 腸 菌 の 尿 路 病 原 因 子 保 有 状 況 を 調 査 し 公 衆 衛 生 学 上 の 問 題 点 について 検 討 する 必 要 があると 考 えられた すなわ ち 健 常 者 の 糞 便 から 分 離 された 大 腸 菌 と 尿 路 感 染 症 患 者 の 尿 から 分 離 された 大 腸 菌 ( 以 下 臨 床 分 離 株 )の 性 状 を 比 較 し 尿 路 感 染 症 との 関 連 性 について 推 察 する また 健 常 者 にお ける 追 跡 調 査 を 行 い 大 腸 菌 の 消 長 について 調 べ 尿 路 感 染 症 の 予 防 に 寄 与 することを 本 研 究 の 目 的 とした 対 象 と 方 法 2009 年 3 月 から 2012 年 4 月 までの 間 に 当 保 健 所 を 訪 れた 主 に 食 品 関 係 に 従 事 する 健 常 者 53 名 から 採 取 した 糞 便 を 対 象 とした 1 検 体 から 2 株 ずつ 大 腸 菌 を 分 離 し 合 計 106 株 の 大 腸 菌 について 尿 路 病 原 因 子 の 検 索 および O 型 別 試 験 を 行 った 尿 路 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 分 離 された 健 常 者 のうち 同 一 人 から 複 数 回 検 体 が 採 取 された 3 名 について 追 跡 調 査 を 実 施 した なお 健 常 者 における 尿 路 感 染 症 の 症 状 の 詳 細 については 確 認 していない ま 26
た 比 較 対 照 のため 県 内 の 一 医 療 機 関 から 譲 渡 された 尿 路 感 染 症 患 者 47 名 の 尿 から 分 離 し た 大 腸 菌 47 株 についても 同 様 に 病 原 因 子 の 検 索 を 行 った 大 腸 菌 の 分 離 同 定 は 検 体 を DHL 寒 天 培 地 に 塗 抹 培 養 後 大 腸 菌 様 コロニーを 確 認 培 地 または 同 定 検 査 試 薬 (BBL クリスタル) に 移 植 し 生 化 学 的 性 状 を 確 認 して 行 った また 溶 血 反 応 の 有 無 は EHT 寒 天 培 地 ( 極 東 製 薬 )を 使 用 して 確 認 した 分 離 株 の O 型 別 は デンカ 生 研 の 抗 血 清 を 用 いて 判 定 した 表 1に 示 す 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 の 病 原 因 子 である hlya(α ー hemolysin) usp(uropathogenic specific protein) cnf1( 細 胞 壊 死 毒 素 ) sfad/e(s 線 毛 ) papc(p 線 毛 ) KpsMTⅡ(K 抗 原 )の 検 索 は 既 報 に 準 じ PCR 法 で 行 った 2) 表 1 尿 路 病 原 因 子 とその 働 き 尿 路 病 原 因 子 ( 遺 伝 子 ) 毒 素 接 着 因 子 等 作 用 hlya α-hemolysin 細 胞 毒 性 (β 溶 血 ) usp uropathogenic specific protein DNase 活 性 cnf1 cytotoxic necrotizing factor type1 細 胞 壊 死 毒 素 sfad/e S 線 毛 接 着 因 子 ( 細 胞 への 付 着 ) papc P 線 毛 接 着 因 子 ( 細 胞 への 付 着 ) kpsmtⅡ K 抗 原 免 疫 防 御 作 用 ( 高 分 子 化 合 物 ) 結 果 1. 健 常 者 から 分 離 された 大 腸 菌 の 尿 路 病 原 因 子 の 検 索 および O 型 別 試 験 結 果 健 常 者 53 名 の 糞 便 から 分 離 された 大 腸 菌 106 株 について 尿 路 病 原 因 子 を 検 索 した( 表 2) 53 名 中 45 名 (85%)から 分 離 された 87 株 (82%)が いずれかの 病 原 因 子 を 保 有 していた hlya は 9 名 から 15 株 (14%) usp は 40 名 から 78 株 (74%) cnf1 は 8 名 から 15 株 (14%) sfad/e は 10 名 から 16 株 (15%) papc は 14 名 から 22 株 (21%) kpsmtⅡは 42 名 から83 株 (78%)で 保 有 していた 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 の O 型 別 は O74 が 9 株 と 最 も 多 く ついで O6 が6 株 O18 が 4 株 であった 87 株 中 49 株 は OUT であり その 他 O1 O55 な どが 分 離 された 対 象 (53 名 ) 分 離 株 (106 株 ) 表 2 健 常 者 から 分 離 された 大 腸 菌 の 尿 路 病 原 因 子 の 保 有 率 結 果 ( 内 訳 ) hlya usp cnf1 sfad/e papc kpsmtⅡ 45 名 /53 名 保 有 者 数 ( 延 数 ) 9 40 8 10 14 42 (85%) 保 有 率 (%) 17 75 15 19 26 79 87 株 /106 株 分 離 株 数 ( 延 数 ) 15 78 15 16 22 83 (82%) 分 離 率 (%) 14 74 14 15 21 78 * 分 離 株 (47 株 ) * 患 者 対 象 は47 名 表 3 臨 床 分 離 株 の 尿 路 病 原 因 子 の 保 有 率 結 果 ( 内 訳 ) hlya usp cnf1 sfad/e papc kpsmtⅡ 44 株 /47 株 分 離 株 数 ( 延 数 ) 11 35 11 11 17 38 (94%) 分 離 率 (%) 23 75 23 23 36 81 2. 臨 床 分 離 株 の 尿 路 病 原 因 子 の 検 索 および O 型 別 結 果 膀 胱 炎 などの 尿 路 感 染 症 患 者 47 名 の 尿 から 分 離 した 47 株 について 尿 路 病 原 因 子 を 検 索 し 27
た( 表 3) 47 株 中 44 株 (94%)がいずれかの 病 原 因 子 を 保 有 していた 健 常 者 から 分 離 され た 株 の 病 原 因 子 の 保 有 率 と 比 較 すると すべての 病 原 因 子 において 臨 床 分 離 株 の 方 がやや 高 い 傾 向 を 示 した( 表 2 表 3: 網 掛 け) O 型 別 では O25 と O74 が 共 に 6 株 ずつ O6 が4 株 で あった 47 株 中 21 株 は OUT であった 3. 同 時 に 複 数 の 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 について 同 時 に 複 数 の 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 健 常 者 および 臨 床 分 離 株 で 多 数 認 められた( 図 1) どちらも usp+kpsmtⅡを 保 有 する 株 が 最 も 多 く 健 常 者 からの 分 離 株 では 55 株 (52%) 臨 床 分 離 株 では 17 株 (36%)であった 次 いで 今 回 調 査 した 6 種 類 すべての 病 原 因 子 (hlya+usp+cnf1+ sfad/e +papc+ kpsmtⅡ)を 保 有 する 株 がどちらも 2 番 目 に 多 かった 健 常 者 では 15 株 臨 床 分 離 株 では 6 株 の 大 腸 菌 が 6 種 類 すべての 病 原 因 子 を 保 有 していた ま た 臨 床 分 離 株 では 5 種 類 の 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 5 株 4 種 類 の 病 原 因 子 を 保 有 す る 大 腸 菌 が 1 株 分 離 されており 健 常 者 由 来 の 株 と 比 較 してより 多 くの 病 原 因 子 を 保 有 する 傾 向 が 認 められた 健 常 者 分 離 株 106 株 臨 床 分 離 株 47 株 80 70 60 株 50 数 40 略 号 hly usp cnf sfa pap kps 病 原 因 子 hlya usp cnf1 sfad/e papc kpsmtⅡ 30 20 10 0 図 1 大 腸 菌 が 保 有 する 尿 路 病 原 因 子 4. 健 常 者 における 追 跡 調 査 による 大 腸 菌 の 消 長 について 同 一 人 から 複 数 回 採 取 された 3 名 について 追 跡 調 査 をした 結 果 を 表 4 に 示 す 3 名 から 分 離 された 大 腸 菌 は いずれも hlya を 含 む 6 種 類 すべての 病 原 因 子 を 保 有 しており 分 離 され た 期 間 中 保 有 する 病 原 因 子 に 変 化 はみられなかった 被 検 者 A は 2009 年 4 月 から 11 月 まで の 7 か 月 間 被 検 者 B は 2009 年 4 月 から 2010 年 5 月 までの 1 年 1 か 月 間 また 被 検 者 C は 2009 年 6 月 から 2010 年 9 月 までの 1 年 3 か 月 間 にわたり 分 離 された また 被 検 者 C は 2010 年 10 月 から 2011 年 6 月 までのあいだ 当 該 菌 が 分 離 されなかったが 2011 年 7 月 から 10 月 までの 4 か 月 間 再 度 分 離 された 28
表 4 健 常 者 における 追 跡 調 査 結 果 2009 年 2010 年 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 10 月 11 月 12 月 1 月 2 月 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 被 検 者 A - - - - - - NT - - - - - - 被 検 者 B - - - - - - NT - NT - NT - 被 検 者 C - - - - NT NT - 2011 年 2012 年 10 月 11 月 12 月 1 月 2 月 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 8 月 9 月 10 月 11 月 12 月 1 月 2 月 3 月 4 月 被 検 者 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 被 検 者 B - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 被 検 者 C - - - - - - - - - - - - - - - : 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 を 分 離 -: 分 離 せず NT: 検 査 せず 考 察 健 常 者 の 糞 便 から 尿 路 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 多 数 分 離 された 特 に hlya を 含 む 検 索 した 6 種 類 すべての 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 9 名 から 15 株 分 離 された また 尿 路 感 染 症 患 者 の 尿 由 来 の 臨 床 分 離 株 でも hlya を 含 むすべての 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 6 株 確 認 されている α ー hemolysin は 尿 細 管 上 皮 細 胞 上 にレセプターが 存 在 し 強 い 細 胞 毒 性 を 示 すことが 報 告 されている hlya を 保 有 する 大 腸 菌 は 他 の 複 数 の 病 原 因 子 を 同 時 に 保 有 する 傾 向 が 認 められ 病 原 性 が 高 いと 推 測 される 健 常 者 から 分 離 された 大 腸 菌 のその 他 の 病 原 因 子 保 有 状 況 は usp が 74% cnf1 が14% sfad/e が15% papc が 21% kpsmtⅡが 78% であった 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 の 血 清 型 は O1 O6 O25 など 特 定 の 抗 原 型 を 示 すといわれて いる 3) 今 回 の 臨 床 分 離 株 については O6 O25 O74 が 多 かった また 健 常 者 から 分 離 された 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 は O6 O18 O74 が 多 く 臨 床 分 離 株 と 類 似 していた 健 常 者 からの 分 離 株 と 臨 床 分 離 株 について 病 原 因 子 の 保 有 状 況 を 比 較 すると すべて 臨 床 分 離 株 の 方 がやや 高 い 傾 向 を 示 した 健 常 者 から 分 離 されたこれらの 大 腸 菌 は 病 原 因 子 を 保 有 し 特 徴 的 な O 血 清 型 であったことから 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 であり 尿 路 感 染 症 を 惹 起 する 可 能 性 があると 考 えられた なお 臨 床 分 離 株 の 中 で 病 原 因 子 を 保 有 していない 3 株 が 認 められ たが これらの 株 は 今 回 検 索 した 6 種 類 以 外 の 尿 路 病 原 因 子 を 保 有 している 可 能 性 が 推 測 さ れる 複 数 回 検 体 が 採 取 された 3 名 について 追 跡 調 査 をした 結 果 尿 路 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 長 期 間 分 離 され 腸 管 内 に 少 なくとも 数 か 月 間 にわたり 定 着 していることが 明 らかとな った また 一 度 分 離 されなくなってから 数 か 月 後 に 再 度 菌 が 分 離 された 健 常 者 ( 被 検 者 C)が 認 められた 再 感 染 を 起 こしたか 菌 が 分 離 されなくても 腸 管 内 にわずかに 残 存 し ていた 大 腸 菌 が 体 調 の 変 化 などの 理 由 により 増 殖 し 分 離 されたと 推 測 される 今 回 の 調 査 で 健 常 者 の 腸 管 内 に 尿 路 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 多 数 分 離 されたことから 腸 管 内 の 大 腸 菌 が 尿 路 感 染 症 の 発 症 または 再 発 の 原 因 の 一 つになっている 可 能 性 が 示 唆 された また hlya を 含 む 6 種 類 の 病 原 因 子 を 保 有 する 大 腸 菌 が 健 常 者 の 糞 便 から 長 期 間 分 離 されており 注 意 が 必 要 である 29
尿 路 感 染 症 は 腸 管 内 の 原 因 菌 が 尿 道 に 移 行 し 尿 道 から 膀 胱 へ 侵 入 することにより 成 立 す ると 考 えられる その 対 策 として 局 所 を 清 潔 に 保 ち 尿 路 に 菌 を 移 行 させないことが 重 要 で ある また 原 因 菌 が 尿 路 に 侵 入 した 場 合 は 排 尿 により 洗 い 流 すことが 感 染 予 防 に 有 効 で ある しかし 疲 労 や 過 度 のストレスで 免 疫 力 が 低 下 した 場 合 などに 感 染 が 成 立 すると 推 測 される 尿 路 感 染 症 の 治 療 に 関 しては 原 因 菌 に 有 効 な 抗 菌 薬 を 投 与 すれば 比 較 的 改 善 しや すい 疾 患 である しかし 抗 菌 薬 の 投 与 期 間 が 不 足 したり 抗 菌 薬 の 選 択 が 適 切 でなかった 場 合 には 再 発 するといわれている 代 表 的 な 治 療 薬 であるニューキノロン 系 薬 剤 は 高 濃 度 に 尿 中 に 排 泄 される したがって 抗 菌 薬 が 尿 路 内 で 有 効 な 濃 度 であっても 腸 管 内 において 原 因 菌 を 死 滅 させる 有 効 濃 度 に 達 していないため 原 因 菌 が 残 存 することが 推 測 される 再 発 防 止 のためには 尿 路 内 だけではなく 腸 管 内 の 原 因 菌 を 死 滅 させることも 重 要 な 対 策 の 一 つと 考 えられる 謝 辞 本 研 究 に 助 成 して 頂 きました 財 団 法 人 大 同 生 命 厚 生 事 業 団 に 深 謝 いたします 引 用 文 献 1) 山 本 新 吾 : 尿 路 病 原 性 大 腸 菌 における 病 原 因 子 の 研 究 日 本 細 菌 学 雑 誌 58(2) 441-450,2003 2)Menique Ribeiro TIBA:Genotypic characterization of virulence factors in Eshericia coli strains from patients with cystitis. Rev.Inst. Med.trop.S.Paulo 50(5):255-260 2008 3) 磯 川 貞 之 : 尿 路 感 染 症 惹 起 性 大 腸 菌 の 腎 培 養 細 胞 への 細 胞 障 害 性 近 畿 大 医 紙 第 29 巻 1 号 1-9 2004 経 費 使 徒 明 細 品 名 単 価 ( 円 ) 数 量 金 額 ( 円 ) EHT 血 液 寒 天 培 地 7,560 1 7,560 DHL 寒 天 培 地 5,292 1 5,292 Go Taq Flexi DNA Polymerase 15,750 1 15,750 NucleoSpin Extract Ⅱ 5,145 1 5,145 白 糖 加 SSS 寒 天 培 地 7,455 1 7,455 DHL 寒 天 培 地 5,292 1 5,292 Ampli Taq Gold DNA Polimerase 90,720 1 90,720 ク ライナー ミクロスピッツ 8,232 1 8,232 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 4,179 5 20,895 PCRチュウフ ハ ント 8 連 セハ レートキャッフ 12,285 3 36,855 滅 菌 スホ イト2 号 28,350 1 28,350 BBL クリスタルE/NF 試 薬 18,974 1 18,974 Ultra Pure Agarose 19,278 1 19,278 フィルター 付 チップ ~100μl 7,497 1 7,497 PCRフ ライマー 0.02μmol 脱 塩 1,870 4 7,480 CMナインー5 採 便 管 (ラベル 付 ) 16,275 1 16,275 合 計 301,050 30