43.トータルダイエット 法 による 大 阪 市 域 における 日 常 食 からのビオチン 摂 取 量 の 調 査 トータルダイエット 法 による 大 阪 市 域 における 日 常 食 から のビオチン 摂 取 量 の 調 査 村 上 太 郎 ( 大 阪 市 立 環 境 科 学 研 究 所 ) 1. 目 的 ビオチンは 水 溶 性 ビタミンの 一 つであり カルボキシラーゼの 補 酵 素 として 炭 酸 固 定 反 応 に 関 与 し 糖 新 生 脂 肪 酸 合 成 およびエネルギー 代 謝 などにおいて 重 要 な 役 割 を 果 たし ている このためビオチンが 欠 乏 するとこれらの 代 謝 経 路 が 阻 害 を 受 け 生 理 機 能 が 障 害 を 受 けるため 皮 膚 炎 や 感 覚 異 常 などが 引 き 起 こされる[1] ビオチンは 通 常 の 食 事 をしている 場 合 には 欠 乏 症 は 起 こりにくいビタミンと 考 えられて いる しかし 妊 娠 時 における 血 中 ビオチン 量 の 減 少 などの 報 告 から 胎 児 形 成 との 関 わり が 示 唆 されているビタミンである[2, 3] ビオチンは 第 六 次 改 訂 日 本 人 の 栄 養 所 要 量 において 新 たに 所 要 量 が 設 定 された 項 目 であるが 食 事 摂 取 基 準 の 策 定 の 際 には 日 本 人 を 対 象 としたデータが 少 ないため 推 奨 量 が 設 定 されず 目 安 量 のみが 設 定 されているビタミンである また 食 品 中 のビオチン 含 有 量 は 五 訂 増 補 日 本 食 品 標 準 成 分 表 には 収 載 されておらず 日 本 における 個 々の 食 品 中 のビオチン 含 量 については 渡 邊 らによる 報 告 があるのみである[4-6] このため 食 事 摂 取 基 準 の 策 定 のためには 日 本 人 を 対 象 としたビオチン 摂 取 量 の 情 報 の 蓄 積 が 必 要 である 本 研 究 では トータルダイエット 調 査 法 を 用 いて 大 阪 市 におけるビオチン 摂 取 量 の 調 査 を 行 った トータルダイエット 調 査 法 は 残 留 農 薬 やPCBなどの 残 留 汚 染 物 質 の 摂 取 量 調 査 [7-10]として 用 いられてきた 方 法 であるが 近 年 はビタミンや 脂 肪 酸 などの 栄 養 成 分 についてもトータルダイエット 調 査 法 が 利 用 されている[11, 12] 分 析 法 には 江 口 らの 乳 酸 菌 による 微 生 物 学 的 定 量 法 [13]を 用 いた 微 生 物 学 的 定 量 法 は 理 化 学 機 器 による 定 量 法 と 比 較 して 精 度 が 懸 念 されるため 調 査 試 料 の 測 定 に 先 立 って 分 析 法 の 妥 当 性 の 確 認 を 行 った 調 査 用 試 料 については 食 品 群 ごとに 分 析 法 の 併 行 再 現 精 度 と 標 準 品 の 添 加 回 収 率 を 求 め 本 調 査 における 分 析 値 の 信 頼 区 間 を 不 確 かさとして 示 した 2. 方 法 2.1. 試 料 大 阪 市 における 国 民 栄 養 調 査 の 摂 取 量 をもとに 大 阪 市 内 で 購 入 した 191 品 目 の 食 品 を 残 留 農 薬 の 摂 取 量 調 査 に 準 じて 13 の 食 品 群 に 分 類 した 食 品 を 必 要 に 応 じて 調 理 した 後 に 混 合 し 飲 料 水 として 水 道 水 を 加 えた 14 の 食 品 群 をビオチンの 分 析 に 用 いた 表 1に 今 回 使 用 したトータルダイエット 調 査 用 の 試 料 の 分 類 と 食 品 群 ごとの 一 日 摂 取 量 を 示 す 2.2. 抽 出 法 試 料 1 g を 50 ml 遠 沈 管 に 採 取 し 4.5 N 硫 酸 25 ml を 加 え オートクレーブにより 121, 60 min. 加 水 分 解 を 行 った 室 温 まで 冷 却 した 試 液 を 4.5 N 水 酸 化 ナトリウム 溶 液 に より ph 7.0±1.0 に 調 整 後 100 ml に 定 容 して シリンジフィルターによって ろ 過 除 菌 し たものを 試 験 溶 液 とした 2.3. 定 量 法 ビオチン 含 量 は 乳 酸 菌 (Lactobacillus plantarum ATCC8014)によるマイクロプレート を 用 いた 微 生 物 学 的 定 量 法 で 測 定 した 培 養 には 嫌 気 性 培 養 装 置 を 使 用 し CO 2 濃 度 10%,37 で 17~19 時 間 培 養 した 培 養 終 了 後 のマイクロプレートを 8 連 マイクロピペッ トによって 各 well を 混 和 後 マイクロプレートリーダーにより 600 nm における 吸 光 度 を 210
測 定 した 培 養 後 の 乳 酸 菌 の 濁 度 とビオチン 標 準 品 の 濃 度 の 対 数 をプロットし 4 parameter logistic 解 析 によって 定 量 を 行 った 表 1 トータルダイエット 調 査 試 料 と 各 食 品 群 の 摂 取 量 No. 食 品 群 食 品 数 食 品 例 調 理 法 摂 取 量 (g/day) 1 米 米 加 工 品 4 米 もち 茹 でる 焼 く 161 2 穀 物 いも 種 実 類 22 パン じゃがいも 茹 でる 焼 く 170 3 砂 糖 菓 子 類 19 ビスケット チョコレート 30 4 油 脂 類 8 バター 植 物 油 13 5 豆 類 10 大 豆 豆 腐 茹 でる 焼 く 62 6 果 実 類 13 りんご オレンジ 129 7 緑 黄 色 野 菜 14 ホウレンソウ にんじん 茹 でる 97 8 その 他 の 野 菜 23 たまねぎ きのこ 茹 でる 175 9 嗜 好 飲 料 14 お 茶 ビール 217 10 魚 介 類 24 鮭 えび 焼 く 95 11 肉 卵 類 8 牛 肉 卵 茹 でる 焼 く 148 12 乳 類 11 牛 乳 ヨーグルト 138 13 調 味 料 20 醤 油 酢 57 14 水 1 水 道 水 600 合 計 191 2092 3. 分 析 法 の 妥 当 性 評 価 3.1. 標 準 品 の 定 量 範 囲 の 確 認 マイクロプレート 上 で 0.2~250 pg/ml となるようにビオチン 標 準 の 希 釈 系 列 を 調 製 し プレートごとに 定 量 を 行 った 本 分 析 法 では 変 動 係 数 が 20% 以 下 の 範 囲 を 定 量 範 囲 と 定 め た 3.2. 認 証 標 準 物 質 の 分 析 による 真 度 と 日 間 再 現 精 度 の 評 価 抽 出 操 作 を 含 めた 分 析 法 の 真 度 と 日 間 再 現 精 度 の 確 認 のため ビオチンを 含 むベビーフ ードをマトリクスとする 認 証 標 準 物 質 (NIST SRM1846)を 3 抽 出 4 日 間 の 繰 り 返 し 分 析 を 行 い 測 定 結 果 を 分 散 分 析 よって 解 析 することにより 本 分 析 法 の 真 度 と 日 間 再 現 精 度 を 確 認 した 3.3. 分 析 法 の 頑 健 性 の 確 認 Plackett-Burman 試 験 計 画 法 [14]によって 分 析 条 件 が 変 動 した 時 に 測 定 結 果 が 影 響 を 受 けない 性 能 である 分 析 法 の 頑 健 性 の 確 認 を 行 った 分 析 条 件 の 中 で 結 果 に 影 響 を 与 える 要 因 としては 抽 出 時 の 硫 酸 濃 度 加 水 分 解 時 間 加 水 分 解 後 の ph の 3 要 因 とマイクロプレ ートにおける 定 量 時 の 菌 株 の 前 培 養 抽 出 液 の 希 釈 率 培 養 時 間 測 定 吸 光 度 の 4 要 因 の 合 計 7 要 因 を 抽 出 した 4. トータルダイエット 調 査 試 料 の 分 析 各 食 品 群 の 併 行 再 現 精 度 を 確 認 するため トータルダイエット 調 査 試 料 を 3 抽 出 し マ イクロプレートにおける 定 量 は 抽 出 液 ごとに 2 well ずつ 定 量 を 行 った 各 食 品 群 の 濃 度 と 等 量 のビオチン 標 準 品 を 添 加 し 添 加 回 収 試 験 を 行 った 分 析 値 が 定 量 限 界 以 下 であった 4 群 ( 油 脂 類 )と 14 群 ( 水 )には 0.1 µg/g となるように 標 準 品 を 添 加 した 添 加 回 収 試 験 についても 各 試 料 を 3 抽 出 し マイクロプレートにおける 定 量 は 抽 出 液 ごとに 2 well ずつ 定 量 を 行 った 211
5. 結 果 と 考 察 5.1. 標 準 品 の 定 量 範 囲 の 確 認 培 養 後 の 乳 酸 菌 の 濁 度 とビオチン 標 準 品 の 濃 度 の 対 数 をプロットしたところ シグモイ ド 曲 線 の 関 係 が 得 られた さらに 本 標 準 曲 線 の 定 量 範 囲 を 確 認 するため 25 回 の 標 準 曲 線 の 各 濃 度 における 平 均 と 濃 度 における 変 動 係 数 の 関 係 を 図 1 示 す 本 分 析 法 では 変 動 係 数 が 20% 以 下 の 標 準 品 の 定 量 範 囲 は 2~125 pg/ml であった 抽 出 時 の 希 釈 率 から 計 算 すると 食 品 1 g あたりの 定 量 限 界 は 0.2 ng であった 標 準 曲 線 を 直 線 で 近 似 をしている 江 口 らの 方 法 でのマイクロプレートにおける 標 準 品 の 定 量 範 囲 は 2~50 pg/ml であり シグモイド 曲 線 で 近 似 を 行 うことにより より 広 い 定 量 範 囲 で 定 量 が 可 能 なことが 確 認 された また 江 口 らの 方 法 では 自 動 分 注 装 置 により 分 注 操 作 を 行 っているが 手 動 での 分 注 操 作 でも 本 定 量 法 が 適 用 できることが 確 認 された ビオチン 標 準 曲 線 変 動 係 数 標 準 品 の 定 量 範 囲 図 1 マイクロプレートにおける 標 準 品 の 定 量 範 囲 5.2. 真 度 と 日 間 再 現 精 度 の 確 認 真 度 の 確 認 のため 認 証 標 準 物 質 を 3 抽 出 ずつ 4 日 間 の 繰 り 返 し 分 析 を 行 った 分 析 の 結 果 の 平 均 値 と 日 間 再 現 精 度 の 不 確 かさは 0.444±0.060 µg/g であり 認 証 標 準 物 質 の 認 証 値 0.411±0.067 µg/g と 比 較 すると 回 収 率 は 108±16%であり 良 好 な 結 果 を 示 した 5.3. 分 析 法 の 頑 健 性 の 確 認 7 要 因 が 頑 健 性 試 験 で 設 定 した 範 囲 内 で 全 て 変 動 した 場 合 のバラつきと 日 間 再 現 精 度 を 比 較 したところ 7 要 因 が 全 て 変 動 した 場 合 でも 測 定 結 果 には 有 意 な 影 響 を 与 えないこと が 確 認 された 個 々の 変 動 要 因 を 比 較 すると 抽 出 時 の 要 因 と 比 較 してマイクロプレート における 定 量 時 の 要 因 が 測 定 結 果 に 大 きな 影 響 を 与 える 傾 向 が 確 認 された 5.4. 各 群 の 併 行 再 現 精 度 と 回 収 率 各 食 品 群 の 併 行 再 現 精 度 は 1.4%~12.7%であり 良 好 な 結 果 であることが 確 認 された 各 食 品 群 の 添 加 回 収 試 験 時 に 4 群 ( 油 脂 類 ) 9 群 ( 嗜 好 飲 料 )と 14 群 ( 水 )では 添 加 回 収 率 が 低 いことが 確 認 された D.M. Mock らの 報 告 によると 乳 中 のビオチン 分 析 時 に 牛 血 清 アルブミンの 添 加 によって 加 水 分 解 時 のビオチンの 安 定 性 が 上 がるということが 報 告 されている[15] このため 回 収 率 が 低 いことが 確 認 された 3 群 には 牛 血 清 アルブミンを 10 mg/g 添 加 し 添 加 回 収 試 験 を 行 うことによりにより 回 収 率 が 改 善 された このため タンパク 質 の 含 有 量 が 低 いと 考 えられる 食 品 中 のビオチンの 分 析 には 牛 血 清 アルブミンの 添 加 が 必 要 であると 考 えられた 各 食 品 群 の 回 収 率 は 78~110%であり 良 好 な 結 果 を 示 した 212
5.5. 摂 取 量 とその 不 確 かさ 各 食 品 群 の 併 行 再 現 精 度 と 回 収 率 の 結 果 から 分 析 値 の 不 確 かさを 算 出 した 食 品 群 ごと の 分 析 値 と 不 確 かさに 摂 取 量 をかけることによって 食 品 群 ごとのビオチンの 摂 取 量 と 分 析 値 の 不 確 かさを 算 出 した( 表 2) トータルダイエット 法 により 大 阪 市 民 の 一 日 摂 取 を 模 擬 してサンプリングされた 食 品 中 のビオチン 含 有 量 (の 推 定 値 )は 70.1 µg/day であり 本 分 析 法 による 一 日 摂 取 量 の 測 定 値 の 不 確 かさは 1.7 µg/day であった 食 品 群 ごとのビオ チンの 寄 与 率 を 求 めたところ 肉 卵 類 群 からの 寄 与 率 が 最 も 高 く その 寄 与 率 は 約 50% であった これまでの 報 告 では 東 京 都 でのトータルダイエット 試 料 を 用 いたビオチンの 摂 取 量 につ いての 報 告 がある[12] この 報 告 の 一 日 のビオチン 摂 取 量 は 45 µg/g であり この 報 告 を 根 拠 として 日 本 におけるビオチン 摂 取 量 の 目 安 量 が 定 められている 渡 邊 らによって 平 成 14 年 度 の 国 民 栄 養 調 査 の 摂 取 量 情 報 から 個 々の 食 品 の 分 析 値 をもとに 求 めたビオチンの 一 日 摂 取 量 の 推 測 値 は 男 性 107.8 µg/g 女 性 91.6 µg/g と 高 く 推 測 されている[16] 今 回 の 調 査 の 分 析 値 はこれまでの 2 つの 調 査 の 間 の 値 であった 調 査 方 法 の 違 いにより 今 回 の 調 査 との 摂 取 量 の 差 が 生 じたことも 考 えられるが 今 後 は 食 品 の 選 択 によるビオチン 摂 取 量 の 推 測 値 への 影 響 についても 検 討 する 必 要 がある 表 2 食 品 群 ごとのビオチンの 一 日 摂 取 量 と 測 定 値 の 不 確 かさ No. 食 品 群 摂 取 量 ± 不 確 かさ (μg/day) 1 米 米 加 工 品 2.3 ± 0.4 2 穀 物 いも 種 実 類 3.5 ± 0.2 3 砂 糖 菓 子 類 1.2 ± 0.0 4 油 脂 類 0.0 ± 0.0 5 豆 類 4.5 ± 0.3 6 果 実 類 1.7 ± 0.1 7 緑 黄 色 野 菜 2.9 ± 0.2 8 その 他 の 野 菜 2.7 ± 0.2 9 嗜 好 飲 料 1.4 ± 0.1 10 魚 介 類 6.8 ± 0.4 11 肉 卵 類 35.2 ± 1.6 12 乳 類 4.0 ± 0.2 13 調 味 料 3.8 ± 0.2 14 水 0.0 ± 0.0 合 計 70.1 ± 1.7 6. まとめ 乳 酸 菌 によるビオチンの 微 生 物 学 的 定 量 法 についての 真 度 日 間 再 現 精 度 頑 健 性 を 確 認 し 本 分 析 法 が 多 様 なマトリクスの 食 品 に 適 用 できることを 確 認 した 調 査 試 料 につい ては 併 行 再 現 精 度 と 回 収 率 の 結 果 から 分 析 値 の 不 確 かさを 求 め 本 調 査 の 分 析 値 について の 信 頼 区 間 として 示 すことができた 分 析 値 についての 信 頼 区 間 を 示 すことにより 調 査 間 の 比 較 をする 際 には 分 析 に 起 因 する 誤 差 を 確 認 することができる 今 後 の 研 究 では 調 査 年 や 調 査 地 域 の 違 うトータルダイエット 試 料 を 分 析 することにより 食 品 選 択 に 関 する 誤 差 やビオチン 摂 取 量 の 年 次 変 化 を 見 積 もることができると 考 える 今 後 もビオチン 摂 取 量 に 関 する 情 報 を 蓄 積 することにより ビオチン 推 奨 量 の 策 定 の 際 には 有 効 利 用 できると 考 える 213
7. 参 考 文 献 [1] J. Zempleni, D.M. Mock, J Nutr Biochem, 10 (1999) 128. [2] J. Zempleni, D.M. Mock, Proc Soc Exp Biol Med, 223 (2000) 14. [3] D.M. Mock, J.G. Quirk, N.I. Mock, Am J Clin Nutr, 75 (2002) 295. [4] 渡 邊 敏 明 ほか, 日 本 栄 養 食 糧 学 会 誌 50 (1997) 8. [5] 谷 口 歩 美, 日 本 栄 養 食 糧 学 会 誌, 58 (2005) 14. [6] 渡 邊 敏 明 ほか, 日 本 栄 養 食 糧 学 会 誌, 49 (1996) 15. [7] J. Chen, J. Gao, J AOAC Int, 76 (1993) 1193. [8] E.L. Gunderson, J AOAC Int, 78 (1995) 1353. [9] E.L. Gunderson, J AOAC Int, 78 (1995) 910. [10] T. Tsuda, T. Inoue, M. Kojima, S. Aoki, J AOAC Int, 78 (1995) 1363. [11] J. Chen, J. Gao, J AOAC Int, 76 (1993) 1206. [12] 齋 東 由 紀, 牛 尾 房 雄, 栄 養 学 雑 誌, 62 (2004) 165. [13] 江 口 秀 敏 ほか, ビタミン 64 (1990) 6. [14] Y. Vander Heyden, A. Nijhuis, J. Smeyers-Verbeke, B.G. Vandeginste, D.L. Massart, J Pharm Biomed Anal, 24 (2001) 723. [15] D.M. Mock, N.I. Mock, S.E. Langbehn, J Nutr, 122 (1992) 535. [16] 渡 邊 敏 明, 谷 口 歩 美, 日 本 臨 床 栄 養 学 会 雑 誌, 27 (2006) 304. 8. 本 研 究 に 関 する 報 告 学 会 発 表 :トータルダイエット 法 による 大 阪 市 民 のビオチン 摂 取 量 の 調 査 村 上 太 郎, 山 野 哲 夫, 中 間 昭 彦, 森 義 明 第 62 回 日 本 栄 養 食 糧 学 会 大 会 (2008.5.2-4) 論 文 投 稿 :Estimation of the dietary intake of biotin and its measurement uncertainty using total diet samples in Osaka, Japan Taro Murakami, Tetsuo Yamano, Akihiko Nakama, Yoshiaki Mori Journal of AOAC international (in press) 9. 経 費 使 途 明 細 品 目 金 額 ( 税 抜 き) 1 ビオチン 認 証 値 付 き 標 準 物 質 56,850 2 ビオチン 標 準 3,570 3 ビオチン 定 量 用 培 地 8,440 4 微 量 遠 心 機 27,000 5 試 験 管 ミキサー 25,000 6 8 チャンネルマイクロピペット 58,000 7 マクロピペット 29,955 8 多 連 式 マイクロプレートミキサー 52,000 9 試 料 粉 砕 用 ホモジナイザー 138,600 10 微 生 物 培 養 用 プレート 32,000 11 マイクロウェルプレート 31,700 12 シリンジフィルター 26,000 13 遠 沈 管 立 て 17,031 14 理 化 学 機 器 の 割 引 -29,955 1~14の 合 計 金 額 消 費 税 1.05 \500,000 214