Product code: MIS-MSNL001 NuLigand CoA-BAP System ER kit 1. Description Nuclear receptors are ligand-inducible transcriptional factors and regulate the transcriptional activity of various target genes. At the start of the initiation step of transcription, nuclear receptors interact with coactivators (TIF2, SRC1, ACTR, CBP/p300 etc.) in an agonist-dependent manner. By using the interaction of the nucler receptor with a coactivator, we have development a novel rapid ligand screening in vitro method which is easy to use and has high sensitivity. This method, called by us the CoA-BAP (coactivator-bacterial alkaline phosphatase) system, is applicable to most nuclear receptors and is suitable for high-throughput screening because of the entire experimental operation is carried out on a microplate. The CoA-BAP system- ER kit is designed for the ligand screening of human estrogen receptor (ER ), which contain TIF2-BAP (BAP-conjugated TIF2) as coactivator and ER as nucleic receptor. Principal of a screening method www.cosmobio.co.jp
2. Product Components This contains sufficient reagents for 96wll reactions. Product Components Storage Condition 150-160 l ER 1 tube -80 *1 150-160 l TIF2-BAP 1 tube -80 *1 50 l 1M DTT 1 tube -80 10 l 10-2 M 17- Estradiol 1 tube -20-80 100 l NPP *2 1 tube -20-80 100ml BufferA 1 bottle 2 8 100ml BufferB 1 bottle 2 8 10ml 0.1M Carbonate buffer 1 tube 2 8 10ml 1M Tris-HCl (ph8.0) 1 tube 2 8 3ml 0.5N NaOH 1 tube 2 8 96well microplate 1 plate room temperature plate sealer 1 pice room temperature *1; Avoid repeating freeze-thaw cycles. *2; NPP (p-nitrophenyl phosphate) is substrate for alkaline phosphatase. Assay Procedure The following procedure is designed for 96well reactions. Once reagents have been added to the plate, take care NOT to let plate DRY at any time during assay. 3.1 Immobilization of ER on Microplate Wells Place a microplate on ice Pipette 100 l of ice-cold 1xER solution(see 4) into each well Cover plate with a plate sealer Incubate overnight at 2 5 www.cosmobio.co.jp
Remove the plate sealer Wash three times with 180 l of ice-cold buffer A-DTT (See 4) Note. Plate shaking is not need. 3.2 TIF2-BAP and Sample Incubation Pipette 100 l of ice-cold 1xTIF2-BAP solution(see 4) into each well Pipette 1 l of sample into each well Incubate 60min at 4 3-3. Plate Washing Wash three times with 180 l of ice-cold buffer B Note. Plate shaking is not need. Blot plate onto paper towels or other absorbent material 3-4. Substrate Incubation and Absorbance Measurement Pipette 100 l of substrate solution into each well (See 4) Incubate 30 120 min at 30 Stop enzymatic reaction by adding 25 l of 0.25N NaOH Measure absorbance on an ELISA plate reader set at 405nm ( or 410nm). 4. Reagent Preparation Buffer A-DTT Prepare just before use Add 50 l of 1M DTT to 100ml of ice-cold buffer A Mix gently 1 ER solution (Prepare just before use) Thaw a ER tube on ice to. Don t use Vortex mixer Add ER solution (about 150-160 l) to 10ml of ice-cold 0.1M Carbonate buffer Mix gently TIF2-BAP solution (Prepare just before use) Thaw a TIF2-BAP tube on ice. Don t use Vortex mixer www.cosmobio.co.jp
Add TIF2-BAP solution buffer A-DTT. Mix gently (about 150-160 l) to 10ml of ice-cold Substrate solution (Prepare just before use) Add 0.1ml of NPP solution to 10ml of 1M Tris-HCl (ph8.0) Mix gently Standards Prepare 10-3 g/ml, 10-4 g/ml, 10-5 g/ml, 10-6 g/ml, 10-7 g/ml, 10-8 g/ml, and 0 g/ml 17- Estradiol solutions by diluting with DMSO for Standard curve. Note. Prepare a Standard curve (including a zero/blank) in each experiment. Reference Kanayama T., Mamiya S., Nishikawa J., Nishihara T. (2003) Basis of a high-throughput method for nuclear receptor ligands. J.Biochem (Tokyo)., 133(6):791-797 Nishikawa J., Saito K., Goto J., Dakeyama F., Matsuo M., Nishihara T. (1999) New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicol. Appl. Pharmacol., 154(1):76-83 www.cosmobio.co.jp
Procedure Summary Ligand 1 l ER 100 l Immobilize BAP TIF2 wash 100 l well 4 overnight 180 l 3 substrate NPP) 100 l NaOH 25 l Incubate 4 wash 180 l yellow 0.5-2 microplate reader at 405nm Example Note; The horizontal(x) axis shows the final concentration of Lignds in assay. Distributor TOYO 2CHOME, KOTO-KU, TOKYO, 135-0016, JAPAN http://www.cosmobio.co.jp e-mail : export@cosmobio.co.jp Phone : +81-3-5632-9617 FAX : +81-3-5632-9618
NuLigand シリーズ - エストロゲンレセプター α- 概要 核内受容体は リガンドとの結合によりその立体構造が変化し 転写共役因子と相互作用することが知られています 本キットはこの原理を利用しています本キットはヒトエストロゲンレセプター αに結合する化合物の検索 及び親和性を評価する研究に利用できます マイクロプレート上で全ての操作を実施でき 発色法により 24 時間以内に結果の判定が行えます 測定に必要な全ての試薬がキットに含まれています キットの内容(1 キット 96 ウェル分 ) 試薬名等 容量 数量 保存温度 1. エストロゲンレセプター濃縮液 約 300μl * 1 本 -80 2.TIF2-BAP 濃縮液 約 150μl * 1 本 -80 3.1M DTT 溶液 0.05ml 1 本 -80 4.17β-エストラジオール (10-2 M) 0.01ml 1 本 -20~-80 5.NPP 溶液 0.1ml 1 本 -20~-80 6.DMSO 1.0ml 1 本 -20~-80 7.0.1M 炭酸緩衝液 10ml 1 本 2-8 8. 緩衝液 A 100ml 1 本 2-8 9. 緩衝液 B 100ml 1 本 2-8 10.1M Tris-HCl (ph8.0) 10ml 1 本 2-8 11.0.5N NaOH 3ml 1 本 2-8 12.96 穴マイクロプレート 1 枚 室温 13. プレートシール 1 枚 室温 * ; ロット毎に 液量は変動します 1
準備 1. キットに含まれる試薬等の安定性を確保するために 保存温度に従って保管してくだ さい 以下は 本書の 操作 手順に従って 適切なタイミングで行って下さい 2.17β- エストラジオール希釈系列 (6 濃度 ) の作成 ;17β- エストラジオール (10-2 M) を DMSO で希釈し 10-4 M 10-5 M 10-6 M 10-7 M 10-8 M 10-9 M 溶液を作成して下 さい 3. 緩衝液 A(+DTT); 緩衝液 A 100ml あたり 50μl 1M DTT 溶液を加えて ご使用 下さい 4.1xTIF2-BAP 液 ;TIF2-BAP 濃縮液 1 本を氷上で融解し 全量を氷冷緩衝液 A(+ DTT) 10ml に加え 混和します 混和後は速やかにご使用ください 5.1x エストロゲンレセプター液 ; エストロゲンレセプター濃縮液 1 本を氷上で融解し 全量を氷冷 0.1M 炭酸緩衝液 10ml に加え 混和します 混和後は速やかにご使用く ださい 6. 基質液 ;NPP 溶液 100μl を 1M Tris-HCl (ph8.0) 10ml に加えて 混和します 混 和後は速やかにご使用ください 7. 試料の調製 ; 脂溶性の試料は DMSO に溶解して下さい 水溶性の試料は 蒸留水又は 適切な緩衝液 ( 緩衝液 A 等 ) に溶解してご使用ください 操作 1.1xエストロゲンレセプター液 100μl/ ウエル分注します プレートシールを貼り 遮光のためアルミホイルでプレート全体を包み 4 で一晩静置して下さい * この操作により エストロゲンレセプターがウエルに固定化されます * 分注操作は 低温室 (2-8 ) 又は マイクロプレートを氷上に置いて実施して下さい 2
2. プレートシールを剥がし 氷冷緩衝液 A(+DTT) 180μl/well で 3 回洗浄して下さい 3.1xTIF2-BAP 液 100μl/ ウエル添加します 4. 適当な濃度となるように調製した試料 (Ligand) 1μl を添加し 4 で 1 時間静置して下さい * 反応確認用試料としてDMSO 及び 10-4 ~10-9 M 17βエストラジオール溶液について 実験毎に測定して下さい ( コントロールウエルの設定参照 ) 5. 氷冷緩衝液 B 180μl/well 3 回洗浄して下さい 6. 基質液 100μl/well 加えます 30 で 1 時間反応させます ( 発色の度合いにより 反応時間を調節してください ) 7.0.5N NaOH 25μl/well 加えて反応を停止後 405nm の吸光度を測定して下さい ( 気泡はバラツキの原因となりますので 注射針等でつぶしてから測定下さい ) コントロールウエルの設定 反応を確認する目的のために 試薬ブランク DMSO コントロール ( 陰性コントロール ) 10-4 ~10-9 M 17β- エストラジオール ( 陽性コントロール ) の測定を実施して下さい 試料 分注するウエル位置 (3 ウエル / 試料 ) 試薬ブランク A1,A2,A3 DMSO のみ B1,B2,B3 10-9 M 17β-エストラジオール C1,C2,C3 10-8 M D1,D2,D3 10-7 M E1,E2,E3 10-6 M F1,F2,F3 10-5 M G1,G2,G3 10-4 M H1,H2,H3 * 基質液自身の吸光度を試薬ブランクとします 即ち 操作の 1~5 ステップをスキ ップし 6~7 ステップのみ実施して下さい 3
操作上の注意 TIF2-BAP 濃縮液 エストロゲンレセプター濃縮液を融解する際は ボルテックスを使 わないようにして下さい TIF2-BAP 濃縮液 エストロゲンレセプター濃縮液を繰り返し凍結融解すると 活性が低下します 分割使用される際は 初回融解時に 小分けして保存 (-80 ) 下さい 実施例 縦軸 ; ( サンプルの吸光度 )-( 試薬ブランクの吸光度 ) 横軸 ; 終濃度 ( 試料濃度 x0.01) ER α キット ( 発色条件 30 1~2 時間 ) Abs. 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0-11 -10-9 -8-7 -6-5 -4 Log Dose (M) 17β エストラジオール ( 発色 ;1 時間 ) p ノニフェノール ( 発色 ;2 時間 ) ビスフェノール A ( 発色 ;2 時間 ) 製造元 販売元 ( 有 ) マイクロシステムズ 619-0237 京都府相楽郡精華町光台 1-7 けいはんなプラザラボ棟 4F TEL 0774-95-5203 FAX 0774-95-5139 E-mail:info@misys.co.jp 4