イタリア中央南部の様々な栽培地で栽培される三つの主要なオリーブ栽培品種内変異とマイクロサテライトマーカーの分析 2012/5/17 12am111s MATRA, Deden Derajat 要約多様なイタリア中央南部栽培地 ( アブルッツォ プーリア カラブリア ウンブリア ) で 3 つの主要な品種 ( 'Carolea' と 'Coratina' と 'Frantoio')70 サンプルのオリーブを収集して 10 のマイクロサテライト座の遺伝子型を分析した 合計で 44 平均で 4.4 遺伝子座が検出された 分子解析では 3 つ栽培品種 'Carolea' と 'Coratina' と 'Frantoio' の遺伝的多様性を明らかにした そして 'Carolea' が多クローン栽培品種で 'Coratina' と 'Frantoio' がおそらく単一クローン状態であった SSR 分析で品種内多形性の解析を通して品種分化および品種内分化を明らかにした 現在オリーブは他の経済的植物材料に比べて 遺伝的変異の研究が進んでいない 本研究では オリーブを経済的に主要な栽培品種にするため 遺伝的変異を明らかにした
緒言 オリーブ果樹 (Olea europaea L.) は 約 1300 のシノニムがあり 680 品種以上が広大な遺伝子プールを示す (http://www.apps3.fao.org/wiews/olive/oliv.jsp) そのような広大な遺伝的変異性によって多くの現象が引き起こされる オリーブの果樹は ヘテロ接合性と遺伝子多型が高いレベルで存在 (Angiolillo ら 1999 と Rallo ら 2000) する さらに 人間によって有用な栄養繁殖における新品種が開発された そのため オリーブ果樹が長寿であることと 品種が多様であることで その変異性を保存し 遺伝的多様性が保たれた この種の生物多様性の増加に貢献している もう一つ要因は遺伝的変異性の広さであり また最終産物が搾汁油であるため 遺伝子変異が見過ごされたことにある このため多クローン栽培品種の異種表現型 ( 栽培品種 - 個体群 ) は単一クローン栽培品種を形成するのよりも時間がかかった 品種内多型が実際には 論文の参考で報告されている (Cipriani ら 2002 と Lopes ら 2004 と Muzzalupo ら 2009a) 体細胞突然変異して栄養繁殖をした同じ品種内を調査した いままでのほうこくではオリーブ品種研究のリファレンスとしてはまだデータが足りなかった (Roselli と Scaramuzzi 1974) 最近いくつかの研究プロジェクトはこの問題を提起しており 別のイタリアの地域で様々な " 標準証明書 " を作ろうとしている 品種内多型は主要な研究になっている これは過去に重要と考えられていなかったが 活発な研究によって現代的なオリーブが生産されるかもしれない ( 例 : 低活性 耐低温性 耐塩性 ) 最近では マイクロサテライトマーカー ( 単純反復配列 ) を用いた新しい方法が導入され 非常に多型が分析でき 信頼でき 役に立つ品種の遺伝子型分類とオリーブ種間の変異性が分析できた (sefc ら 2000 と Rallo ら, 2000 と Carriero ら, 2002 と Cipriani ら, 2002 と Ipek ら, 2009 と Muzzalupo ら, 2009b) 特性分析と個体識別と遺伝子資源収集の管理とオリーブオイルの遺伝的追跡可能度が存在する多クローン品種は問題だが しかし 変異の多様性により遺伝的改良によって新しい遺伝子型を作成し 形質遺伝になる生成形質および耐性または抵抗性の遺伝物質の材料とできる可能性がある Mirto-Crosia (Cosenza, Calabria, Italy), Spoleto (Perugia, Umbria, Italy) and Città Sant Angelo (Pescara, Abruzzo, Italy) の CRA Centro di Ricerca per l OLivicoltura e l Industria olearia ( オリーブ栽培とオイル生産研究所, CRA-OLI) 国立植物遺伝資源研究所にオリーブの遺伝子資源収集部門である 実際には様々な約 600 品種がイタリアで収集され 50 品種以上が地中海諸国から Mirto-Crosia (CS) CRA-OLI に収集された CRA- OLI でイタリアのオリーブの遺伝資源収集の目的は 遺伝的多様性の損失を避けることと将来の育種プログラムにとって重要な遺伝的基礎を提供するために 主な国の品種を維持し さらに微遺伝子型を保護することである 本研究の目的は 10 マイクロサテライト遺伝子座における 70 本のオリーブ果樹に属する栽培品種を原産地および分布地と 4 カ所別のイタリア中央南部栽培地について 'Carolea' と 'Coratina' および 'Frantoi のイタリアの主要な栽培品種を比較する 材料および方法 70 本のオリーブ果樹は中央から南側のイタリア ( 表 1 および図 1) の地域から選んだ 原産地および分布地と 3 カ所の栽培地で栽培されている 'Carolea' と 'Coratina' および Frantoi の幼葉のサンプルを採取した 植物材料が取得された農場は Mirto-Crosia (Cosenza, Calabria), Città Sant Angelo (Pescara, Abruzzo), と Spoleto (Perugia, Umbria). に属する Andria (Bari, Apulia) から個人農場の材料も採取した 遺伝子マーカーにおけるオリーブ果樹の材料を分析したリストは表 1 に示されている 幼葉から Murry と Tompson(1980) が開発し さらに Muzzalupo と Perri(2002) によって改良された CTAB プロトコルによってゲノム DNA を抽出した 10 マイクロサテライト遺伝子座が選択され さらに前論文からも適当に特性分析と個体識別を分析する (Baldoni ら, 2009; Ipek ら, 2009; Muzzalupo ら, 2009a,b; Rekik ら, 2008)
使用する遺伝子座は Carriero ら (2002) の研究によって 4 遺伝子座 (GAPU59 GAPU71A GAPU71B と GAPU103A) Cipriani ら (2002) によって 4 遺伝子座 (UDO09 UDO12 UDO28 および UDO39) および Sefc ら (2002) によって 2 遺伝子座 (DCA9 と DCA18) である さらに Badoni ら (2009) の結果とデータをするためにマーカー (GAPU71B GAPU103A DCA9 DCA18) の 4 つの遺伝子座である Muzzalupo ら (2006) によって 25μL PCR 反応液を含む 25ng 全 DNA 1.5mM MgCl 2 10mMTris-HCl(pH 8.0) 0.2mM dntp 0.25M forward と Reverse プライマー 0.05 U Taq DNA ポリメラーゼ (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) である Thermal cycler GeneAmp PCR system Model 9600 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて GAPU59 GAPU71A GAPU71B GAPU103A UDO09 UDO012 UDO28 UDO39 プライマーを採用した PCR 反応条件 : 最初に 94 C 3 分の予備加熱を行い 次いで 94 C 30 秒 60 C 40 秒 72 C 60 秒のサイクルを 40 回行った後 最後に 72 C 5 分の伸長反応を行った さらに DCA9 プライマーを採用した PCR 反応条件 : 最初に 95 C 5 分の予備加熱を行い 次いで 95 C 20 秒 50 C 30 秒 72 C 30 秒のサイクルを 35 回行った後 最後に 72 C 5 分の伸長反応を行った 増幅産物は 2100 Bio-Analyzer instrument (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) を用いて DNA 7500 LabChip kit を行って検出し 2100 BioSizing software (version A.02.12) を用いて増幅断片長を決定した (Muzzalupo et al., 2007b) 遺伝子座数 (Na) 頻度 (fa), ヘテロ接合度の期待値 (He), ヘテロ接合度の実測値 (Ho) および遺伝的類似度 (Genetic Identity/g.i) POPGENE32 ソフトウェア (Yeh ら 1997) を用いて算出した Brookfield (1996) によってヌル対立遺伝子 (r) を算出した定式を以下に示す : Brenner and Morris (1990) によって SSR 座あたり対立遺伝子頻度 (power of discrimination-pd) を算出した定式を以下に示す : g.i.(nei,1993) による類似性マトリックスを開発した NTSysPc v2.1 を用いて UPGMA 法によって分子系統樹を作成した
表 1 マイクロサテライトマーカーにおけるオリーブ遺伝子型の分析結果 本研究ではすべての 10 のマイクロサテライトマーカーにおける多形性の分析を成功し 44 の遺伝子座あたり 平均 4.4 が作成され 3 の遺伝子座の GAPU71A および GAPU71B から 6 の遺伝子座の DCA09 および UDO28 を検出した ( 表 2) この研究結果は Lopes ら (2005) の結果より低く Muzzalipo ら (2009a) 結果より高い UDO39 座以外 ヘテロ接合性実測値結果は接合性期待値が高い UDO39 の方は接合性実測値が低い ヌル対立遺伝子率が高いかもしれない (r=0.23) 識別能の SSR 座は 0.459 の GAPU71B から 0.748 の DCA18 まで及んでいる さらに 識別能の SSR 座の結合は 0.99997 であり 同じ遺伝子型の中で二つ品種を区別する可能性は 1 対 10000 である 図 1 イタリア南側における 4 カ所別栽培された栽培所サンプルを収集した地図 表 2 SSR 座データを取り込んだ Carolea,Coratina, および Frantoio 遺伝子座あたり 遺伝子座数 (Na) ヘテロ接合度の期待値 (He), ヘテロ接合度の実測値 (Ho) ヌル対立遺伝子 (r) を表示した
図 2 UPGMA 法による Nei s Genetic Identity により 70 のオリーブ遺伝子型の系藤樹を分析した UPGMA 法より類似性マトリックスから系統樹を作成し 別の栽培地域で栽培したサンプルが 3 個別のクラスターを示した 一つ目は 25 サンプルの Carolea 栽培品種および二つ目は 21 サンプルの Coratina 栽培品種および 3 つ目は 24 サンプルの Frantoio である 1 つ目のクラスターは非常に多様な品種内を持てる 'Carolea' である 同じ栽培品種地 (Città Sant Angelo, Abruzzo) では遺伝的類似度が非常に低い CaroleaXXIV を 0.667 示す このサンプルは遺伝的類似度が低いから 栽植か収集かのとき付票を間違えたかもしれない もう 1 つ同じクラスターで Carolea I は低く遺伝的類似度は 0.889 であった Carolea クラスターの中で 0.999 以上の遺伝的類似度により 3 つ目サブクラスターを示した 11 サンプルを含む A サブクラスターと 7 サンプルを含む B サブクラスターと 5 サンプルを含む C サブスラスターはそれぞれ別れた A サブクラスターの中では 8 サンプルが Calabria に起原し 3 サンプルが Andria(Apulia) に起原した このサブクラスターでは Carolea V および Carolea VIII を持っている 1 つ対立遺伝子座が違う B サブクラスターの中では 5 サンプルが Spoleto (Umbria) に起原し 2 サンプルが Andria(Apulia) に起原した. このサブクラスターは非常に同種である CaroleaXI とういう対立遺伝子 1 つだけが異なる 最後に C サブクラスターの中では 5 サンプルが Città Sant Angelo (Abruzzo) に起原し また Carolea XX という 1 サンプルが 1 つ対立遺伝子座が違う
表 3SSR 座データを取り込んだ 70 のオリーブ POPGEN32 を用いて遺伝子座数 ( 塩基対を示す ) および数度を算出した サンプルの中で 低対立遺伝子頻度を持っている遺伝子座を発見した CaroleaXXIV の中で 214bp の GAPU59 座および 197bp の GAPU103A 座を発見し さらに CaroleaVIII の中で 161 の UDO28 座を発見した 212bp の GAPU59 座の中では 0.6429 の非常に高い対立遺伝子座を発見した ( 表 3) Nei s (1973) によると栽培品種内の中で様々なサンプルの遺伝的類似度が高い それから様々な品種内で非常に遺伝的類似度が低いのは Carolea と Coratina が 0.389 および Carolea と Frantoio が 0.270 および Coratina と Frantoio が 0.324 である それでも クラスターの 'Coratina' と 'Frantoio' は両方も遺伝的類似度率が高い ( 約 1.000). 全サンプルは 区別不能で同遺伝子型を示す 結果はマイクロサテライトマーカーによってそれぞれ Coratina および Frantoio が非常に近縁であると示す SSR 分析におけるオリーブ栽培品種の特性分析と個体識別法を開発した 全 SSR 遺伝座は品種内分離を信頼できる結果を示す 本研究では 結合マーカーにおける品種内間変異の特性分析を使用した 分析によりオリーブの栽培品種は明らかに 3 つ分かれ Carolea の栽培品種が多クローンを示し Coratina と Frantoio が単一クローンを示すかもしれない Carolea 栽培品種内では別栽培地 (Abruzzo, Apulia, Calabria, Umbria) における 種子か栄養繁殖か人間の分布によってオリーブを起原したことが同品種の生態型の原因かもしれない この原因は さらに Carolea は 3 つのサブクラスターを持ち A サブクラスターが Calabria 栽培地 (~75%) を構成し, B サブクラスターが Umbria 栽培地 (~71%) を構成し, C サブクラスターが Abruzzo 栽培地 (100%) を構成した これは同じ生態型であるが体細胞突然変異によって 1 か 2 かの対立遺伝子座の相違が起きたと考えられる Carolea 栽培品種内で表現型として区別できない だが 分子遺伝子マーカーによって違いが確認されたから オリーブの品種保証を行うとき 必ず分子マーカーと表現型特性を両方証明する必要がある