平間崇 PCR,RT-PCR,real-time PCR 1047 講座研究手法入門 : 生化学的免疫学的実験法 PCR,RT-PCR,real-time PCR 平間崇要旨 PCR は, 基礎研究や臨床検査などの幅広い分野において欠かせない手法として確立している PCR,RT-PCR,

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あきとしありはら
5 years ago
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1 平間崇 PCR,RT-PCR,real-time PCR 1047 講座研究手法入門 : 生化学的免疫学的実験法 PCR,RT-PCR,real-time PCR 平間崇要旨 PCR は, 基礎研究や臨床検査などの幅広い分野において欠かせない手法として確立している PCR,RT-PCR,real-time PCR の基本的原理は共通であり, いずれも DNA 複製を人工的に繰り返すことで, 目的とする塩基配列のみを効率的に増やすことができる PCR は,2 本鎖 DNA を1 本鎖にする Denaturation step と 1 本鎖 DNA に対して相補的なプライマー DNA が結合する Annealing step を交互に繰り返すことで DNA を増幅させる RT-PCR は, 逆転写酵素によって RNA から DNA を合成し, それを鋳型に PCR を行う Real-time PCR は,PCR 反応 1 サイクルごとに増幅された DNA を蛍光色素で測定することにより DNA または RNA を検出かつ定量できる遺伝子検査は年々新しい技術が開発され, 処理能力も格段に進歩しているが, これらの基本は PCR を用いている臨床医も PCR の原理を理解し, 遺伝子検査の適応, 利点, 限界を理解することが重要である平間崇 :PCR,RT-PCR,real-time PCR, 呼吸 32(11): ,2013 キーワード :PCR RT-PCR real-time PCR リアルタイム PCR プライマー Ⅰ. はじめに Ⅱ.PCR 呼吸器学に限らず, 基礎研究や臨床検査などの幅広い分野において,PCR(polymerase chain reaction:dna ポリメラーゼ連鎖反応 ) は必要不可欠な手法として確立しているそのため基礎研究者だけでなく, 臨床医も PCR に代表される遺伝子検査の原理を把握する必要がある本シリーズ第 3 回にあたる本稿では, 臨床で広く用いられる, PCR,RT-PCR (reverse transcription PCR: 逆転写 PCR),real-time PCR( リアルタイム PCR) について解説する埼玉医科大学呼吸器内科 Takashi Hirama Department of Respiratory Medicine, Saitama Medical University, Saitama , Japan. 概要生命の最小単位である細胞では, 細胞分裂の際に DNA 複製が行われる DNA の二重らせん構造は解かれ, その 1 本鎖 DNA が鋳型となり,DNA ポリメラーゼ ( 合成酵素 ) によって新たな DNA が完成する PCR は, この DNA 複製を人工的に繰り返すことで, 目的とする塩基配列のみを効率的に増やすことができる技術である. 原理 PCR,RT-PCR,real-time PCR, これら 3 つの検査法は同じ原理である 2 本鎖 DNA は, 高温環境下で変性し, 1 本鎖 DNA に分かれる (denaturation) 逆に,1 本鎖 DNA は冷却すると, 相補的配列を有する 1 本鎖 DNA と再結合し,2 本鎖 DNA が再生される (renaturation) 相補的配列を有する短い人工合成 DNA( プライマー :primer) を大量に加えておくと,1 本鎖 DNA を冷却したときに, 人工合成 DNA と結合する (annealing) PCR は,

2 1048 呼吸 32 巻 11 号 (2013 図 PCR 反応 PCR は,DNA を加熱と冷却することで,1 2 本鎖 DNA の変性 (denaturation),2 プライマーと template DNA の結合 (annealing),3 伸長反応 (extension) を繰り返す反応である 2 サイクルの PCR で DNA1 本が 4 本に増幅されるこの denaturation と annealing を利用する PCR 反応液中に, 検出対象となる template DNA,DNA ポリメラーゼ, プライマーを加え, 加熱と冷却を繰り返す PCR で最も重要なものがプライマーであるプライマーとは, 増幅させたい塩基配列の両端の相補的配列を有する人工合成 DNA である一般的に, 各々のプライマーは bp 程度に設計する増幅させたい塩基配列は目的により長さが異なり, 数十塩基対から数万塩基対程度まで増幅が可能である Real-time PCR では bp とする PCR の場合, このプライマーの配列ができるだけ他の塩基配列と異なり, 目的の塩基配列特異的であることが望ましいプライマーの配列によって annealing の温度が決定される配列の特異性を確認するには, 既知の DNA 配列を集めたデータベースと比較を行い, 配列がデータベース中で目的配列とのみ一致することをみるのがよい日本 DNA データバンク (DDBJ) 1) や米国生物工学情報センター (NCBI) 2) の website で,blast と呼ばれるプログラムを用いて比較する. 実際の手順 ) DNA 抽出と精製 1 時間程度で検体から DNA 抽出精製できるキットが多数市販されており, 広く普及している多くのキットのマニュアルはインターネットからダウンロード可能なので, 参考にしていただきたい呼吸器領域では, 主に血液, 喀痰, 肺組織から DNA を抽出するが, 材料にあったキットを使用する必要がある ) PCR 反応液の調整 ( 例 ) Template DNA 1.0 ml Reaction mixture(solution) * (2 ) 12.5 ml 1 total 2 * Reaction mixture(solution) として DNA ポリメラーゼ,dNTP(DNA の原料 ),Mg 塩などを適切な濃度に調製したものが販売されている Template DNA と各プライマーを添加すれば PCR を実施できる ) PCR 反応 ( 図 1) 代表的な反応条件は,PCR を行う機械 ( サーマルサイクラー :Thermal cycler) にあらかじめプログラムされている実際に PCR は, 反応液を調整して, 適切なプログラムを選択し, 機械のスイッチを押すだけである 1 Denaturation step: 反応液を 5 10 秒ほど 94 で加熱し,1 本鎖 DNA にする 2 Annealing step:60 程度まで急速に冷却することで,2 本鎖 DNA になる (1 本鎖 DNA となった template DNA 同士が再結合するより, 高濃度で存在するプライマーのほうが template DNA とより結合しやすい ) 3 Extension/Elongation step:dna ポリメラーゼによって template DNA に相補的な DNA を合成する耐熱性 DNA ポリメラーゼ (Taq) が最も使用されており,70 で 20 秒ほど加熱する現在では,Annealing step と Extension step が一緒になるように温度を設定する 2

平間崇 PCR RT-PCR real-time PCR 1049 図 PCR 機械とアガロースゲルによる電気泳動Ａ Applied Biosystems 社の Thermal cycler(geneamp ) DNA に対して加熱と冷却を均一に実施することができるＢ電気泳動による DNA 断片の確認増幅産物が 300 bp になるようプライマーを設定したため予測された DNA

ウイルスであり宿主細胞に感染すると逆転に増幅できるため 30 サイクル程度で 1 本の DNA が 8 9 写酵素を利用して DNA を合成する RT-PCR ではレ 10 10 倍まで増幅可能な計算となる) トロウイルスのもつ逆転写酵素(遺伝子を単離しそれを ) PCR 生成産物の確認(図 2) 用いて人工合成したもの)を使用して mrna(メッセン PCR

3 平間崇 PCR RT-PCR real-time PCR 1049 図 PCR 機械とアガロースゲルによる電気泳動Ａ Applied Biosystems 社の Thermal cycler(geneamp ) DNA に対して加熱と冷却を均一に実施することができるＢ電気泳動による DNA 断片の確認増幅産物が 300 bp になるようプライマーを設定したため予測された DNA 断片が確認できる step PCR を使用する場合も多い Denaturation step から Extension step までの過程その cdna に対して PCR 法を行う原理 (① ③)を 1 サイクルと呼びサイクルほど実施しヒト免疫不全ウイルス HIV に代表されるレトロウイルたところで終了する(理論上は 1 サイクルで DNA を 2 倍スは RNA ウイルスであり宿主細胞に感染すると逆転に増幅できるため 30 サイクル程度で 1 本の DNA が 8 9 写酵素を利用して DNA を合成する RT-PCR ではレ倍まで増幅可能な計算となる) トロウイルスのもつ逆転写酵素(遺伝子を単離しそれを ) PCR 生成産物の確認(図 2) 用いて人工合成したもの)を使用して mrna(メッセン PCR 反応後のサンプルをアガロースゲルで電気泳動しジャー RNA)や RNA ウイルスから cdna を合成し増幅された DNA 断片が予測された長さであることを確 PCR を実施する認するまた増幅された DNA の配列を確認したい場合実際の手順その解析を行うこともある(増幅された塩基配列の受託解 ) RNA 抽出と精製析を多くの企業が取り扱っている) PCR の長所と短所長所 DNA 抽出から電気泳動まで様々なキットが市 DNA 同様に簡易に RNA を抽出精製できるキットが市販されているためそれらを利用することが多いただし DNA と異なり RNA は非常に不安定な物質であり販されており簡易に短時間で PCR が実施できるように冷凍保存であっても半減期が短いそのため RNA 精製なった後は速やかに使用するか 80 で冷凍保存することが必短所定量が難しく定性での判定となるプライマーの配列によっては非特異的な配列が増幅される場合もあり増幅産物の塩基配列解析が必要な場合もある要である ) RT-PCR 反応液の調整(例 one-step の場合) Template RNA Reaction mixture(solution) Ⅲ RT-PCR 概要 RT-PCR は RNA に対して PCR を実施する手法であ Reverse transcriptase 0.25 ml ml る RNA から逆転写酵素 reverse transcriptase によって cdna を合成し(c は相補的 complementary のこと) total 2 通常の PCR 反応に必要な酵素や材料が含まれる

呼吸 32 巻 11 号 2013 1050 図 real-time PCR 機械と増幅曲線Ａ Cepheid 社の real-time PCR(SmartCycler ) Ｂ real-time PCR では Ct 値(threshold cycle)として PCR 産物の増幅過程を定量化するここでは肺炎患者の喀痰を使用し 30 種類の病原体に対して real-time PCR

4 呼吸 32 巻 11 号図 real-time PCR 機械と増幅曲線Ａ Cepheid 社の real-time PCR(SmartCycler ) Ｂ real-time PCR では Ct 値(threshold cycle)として PCR 産物の増幅過程を定量化するここでは肺炎患者の喀痰を使用し 30 種類の病原体に対して real-time PCR を実施したところヒト細胞(陽性コントロール)と 4) Mycoplasma pneumoniae が検出され他の 29 種類は検出されていない ) RT-PCR 反応 ① Reverse transcription step 使用する酵素によって多少異なるが 50 で 30 分ほど加熱することで RNA から cdna が合成される ② PCR reaction ①の後は PCR 反応を実施するする励起光源蛍光を検出する検出器 PCR 装置(Thermal cycler)を組み合わせた物である現在では多くの real-time PCR 法が開発されているがその基本となっているのは TaqMan プローブ法と SYBR Green 法である本項ではこの 2 つについて説 Denaturation step Annealing step Extension step を明するサイクルほど実施し DNA 断片を確認する ) TaqMan プローブ法(図 3) Reverse transcriptase を選択する際に one-step か PCR で増幅させる DNA の両端にある 2 つのプライ two-step かを選択することが多い one-step は単一のマーに加えてその間に相補的配列を認識するプローブ反応チューブで①と②を続けて実施する two-step で (probe)を用いるプローブは増幅される DNA に特異は①の後に試薬を入れ替えて②を実施する two-step 的な配列を用いるため目的 DNA が増幅されたことを特のほうが検出感度は向上するがそのぶん煩雑である異的に観察できるプローブは 5 末端に蛍光レポーター RT-PCR の長所と短所と 3 末端に消光クエンチャーを有する PCR で目的の塩長所 RNA の検出ができる(特にインフルエンザウイル基配列の増幅に比例してレポーターが蛍光を発するためスを代表とするウイルス性呼吸器感染症の多くが RNA ウ検出器によって増幅過程を定量的に観察できる Real- イルスであるため RT-PCR は有用な検査法である) time PCR の多くが TaqMan プローブ法またはこれ短所 RNA は分解しやすく同一検体からの再検査が困難なことがあるらに改良を加えた手法で行われている ) SYBR Green 法 SYBR Green は二重らせんを組んでいる DNA と特 Ⅳ real-time PCR 異的に結合する色素である DNA と結合すると青色光を吸収し緑色光を発光する SYBR Green を用いる re- 概要 al-time PCR は配列特異的なプローブを用意する必要が Real-time PCR は PCR による DNA 複製過程をリアなくコスト的にも安価であるため手軽に行うことができルタイムに測定する手法である PCR 産物をサイクルごるしかし SYBR Green は配列非特異的に 2 本鎖とにモニターするため増幅産物の定量ができまた検出も DNA に結合するのでプライマーの設計に特異性が求め兼ねているためアガロースゲルを使用した DNA 断片のられるそのため SYBR Green 法では PCR 後に増確認操作を省けるといった利点がある現在医療におい幅産物を加熱して解離解析を必要とすることがあるて診断目的で利用される PCR の殆どは real-time PCR 実際の手順になっているといっても過言ではない ) DNA 抽出と精製原理 Real-time PCR は増幅産物を蛍光測定によって定量するそのため real-time PCR 装置は蛍光色素を励起 PCR と同様である

5 平間崇 PCR,RT-PCR,real-time PCR 1051 表鳥インフルエンザ A(H7N9) 検出用のプライマーとプローブ target(gene) name sequence primer/probe H7(HA gene) CNIC-H7F CNIC-H7R CNIC-H7P N9(NA gene) CNIC-N9F CNIC-N9R CNIC-N9P FluA(M1 gene) InfA F InfA R InfA P 5ʼ-AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA-3ʼ 5ʼ-GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG-3ʼ 5ʼ-FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3ʼ 5ʼ-TGGCAATGACACACACTAGTCAGT-3ʼ 5ʼ-ATTACCTGGATAAGGGTCGTTACACT-3ʼ 5ʼ-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC-BHQ1-3ʼ 5ʼ-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3ʼ 5ʼ-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3ʼ 5ʼ-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3ʼ forward primer reverse primer TaqMan probe forward primer reverse primer TaqMan probe forward primer reverse primer TaqMan probe FAM:Fluorescent Reporter,BHQ-1:Quencher 世界保健機関 (WHO) より引用 ( A 型 (M1 gene),h7(ha gene),n9(na gene) を real-time RT-PCR で検出する ) real-time PCR 反応液の調整 ( 例 :TaqMan プローブ法の場合 ) Template DNA Reaction mixture(solution)(2 ) TaqMan Probe(10 mm).real-time PCR の長所と短所 total 1.0 ml 12.5 ml 10.0 ml 2 長所 :TaqMan プローブ法の場合, プローブによって増幅産物を特異的に識別できる SYBR Green 法の場合, プローブを設計する必要がなく安価である短所 :TaqMan プローブ法の場合,PCR に加えプローブの設計費用を要するため高価になる SYBR Green 法の場合, 非特異的な増幅でも検出されてしまう可能性がある Ⅴ. 実際に real-time RT-PCR を設計するここでは実際に real-time PCR と RT-PCR を組み合わせた real-time RT-PCR を設計してみる例として 2013 年 4 月より中国を中心に感染拡大を続ける鳥インフルエンザ A(H7N9) を検出するシステムを立ち上げてみる. プライマーとプローブの設計 ( 表 1) 自身でプライマーやプローブを設計することも可能であるが, ここでは世界保健機関 (WHO) 3) の推奨する配列を使用する論文やホームページに掲載されている配列の殆どは, それらが特異的配列であるかどうか確認されているため, そのまま応用できることが多い 4) WHO の website から配列をダウンロードする検索サイトで realtime RT-PCR influenza A(H7N9) と入力しても配列を入手できる.real-time RT-PCR 反応液の調整 ( 例 :TaqMan プローブ法の場合 ) Template RNA * TaqMan Probe(10 mm) Reverse transcriptase 0.25 ml Buffer solution(5 ) ml total 2 * template RNA はインフルエンザ陽性の検体が必要なため, 本邦流行前に入手することは不可能であるそのため cdna を合成して, 予測される配列が増幅されるか確認をする現在では, 多くの企業で cdna 合成を受託しており,2 週間ほどで安価に cdna を合成できる. 実際の手順 ) RNA 抽出と精製 RT-PCR と同様である ) real-time RT-PCR 反応 1 Reverse transcription step:50 30 分 2 PCR reaction:40 サイクル Denaturation step:94 10 秒 Annealing step/extension step:62 40 秒 RNA 抽出から real-time RT-PCR まで 2 時間ほどで実施できるようになる現に, 埼玉医科大学でも, 鳥イン

6 1052 呼吸 32 巻 11 号 (2013 フルエンザ A(H7N9) に備えて同様のシステムを構築してある Ⅵ. さいごに遺伝子検査は年々新しい技術が開発され, 処理能力が格段に進歩しているそれに伴い, 新しい検査方法や検査名が次々に登場するため, 遺伝子を操作する機会が少ない者にとっては, それらを理解することに抵抗を感じるしかし, 遺伝子検査の基本は PCR であり, その原理が分ればそれほど困難なものではない本稿が, 遺伝子検査を理解する手助けになれば幸いである文 ) 日本 DNA データバンク (DDBJ)( blastn?lang=ja) ) 米国生物工学情報センター (NCBI)( gov/) ) 世界保健機関 (WHO)( man_animal_interface/influenza_h7 n9/en/) ) Hirama T, et al. Prediction of the pathogens that are the cause of pneumonia by the battlefield hypothesis. PloS one 6:e24474, 2011 献

■リアルタイムPCR実践編

■リアルタイムPCR実践編リアルタイム PCR 実践編 - SYBR Green I によるリアルタイム RT-PCR - 1. プライマー設計 (1)Perfect Real Time サポートシステムを利用し設計済みのものを購入するヒトマウスラットの RefSeq 配列の大部分については Perfect Real Time サポートシステムが利用できます目的の遺伝子を検索して購入してください (2) カスタム設計サービスを利用する

平間崇 PCR,RT-PCR,real-time PCR 1047 講 座 研究手法入門 : 生化学的 免疫学的実験法 PCR,RT-PCR,real-time PCR 平間 崇 要 旨 PCR は, 基礎研究や臨床検査などの幅広い分野において欠かせない手法として確立している PCR,RT-PCR,

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