食品中のシュウ酸定量分析の検討

群馬県立産業技術センター研究報告 ( 2013) 食品中のシュウ酸定量分析の検討 関口昭博 吉野功 Exaation for the deteration of oxalic acid contents in foods Akihiro SEKIGUCHI, Isao YOSHINO 食品中のシュウ酸の定量を目的に GC 法と HPLC 法を検討した 標準試料について検量線を作成したところ いずれの方法でも高い直線性を示した そこで作業の効率を考えて エステル誘導体化を必要としない HPLC 法で 実サンプルを分析した 水溶性シュウ酸塩であれば ポストカラム BTB-HPLC 法で分析できることが分かったが 不溶性シュウ酸塩は夾雑成分を除くための前処理を工夫しないと分析が難しいことが分かった キーワード : シュウ酸 ガスクロマトグラフィー 液体クロマトグラフィー In order to detere oxalic acid contents in foods, we tried GC and HPLC analysis. In both analysis standard curves of oxalic acid exhibited high linearity. Therefore, in view of efficiency of work, we analyzed actual samples by HPLC which doesn t require esterification. Soluble oxalate could be detered by post-column BTB-HPLC method. However insoluble oxalate was found to be difficult to detere without pretreatment of removing contaant. Keywords: oxalic acid, GC, HPLC 1 はじめにシュウ酸はエグ味の主成分と言われ 山芋やコンニャク芋 ホウレンソウなどに多く含まれている有機酸の仲間である 最近は消費者クレームに対する原因解明のための分析 シイタケ栽培の生育指標のための基礎データ収集など シュウ酸分析の依頼がある しかしシュウ酸の定量分析に関しては対応できていなかった シュウ酸以外のリンゴ酸や乳酸などの有機酸は ポストカラム BTB-HPLC 法で定量分析しているが 不溶性シュウ酸塩の分析を目的とした食品からの抽出に塩酸を用いた場合 塩酸の影響が大きく 塩酸の大きなピークと溶出時間が近いシュウ酸の分 バイオ 食品係 離が難しいため このシステムでは分離定量できなかった 有機酸の分析手法として 上記の HPLC 法以外に誘導体化による GC 法が知られている HPLC 法に比べ 分解能が高いというメリットがあるが 誘導体化が必要であり 手間がかかるといったデメリットがある 一方 HPLC 法は 誘導体化の必要はなく 前処理が比較的簡単といったメリットがあり これまでは分析できなかったものの 分析手法として捨てがたい そこで本研究では GC 法 HPLC 法の両方で 特に HPLC 法は 上記の有機酸分析システムとは別の条件で シュウ酸の定量分析を試みた 2 実験方法

GC 法については ブチルエステル誘導 1) 体化法を用いた 誘導体化は常法に従った シュウ酸やその他の有機酸標準試料をそれぞれ誘導体化後 GC に注入し 溶出時間および検量線の直線性を確認した 2) HPLC 法については 沖らの方法に準じて行った ( 以下 HPLC-UV 法 ) GC 法同様に溶出時間および検量線の直線性を確認した 誘導体化の手順 GC 条件および HPLC 条件はそれぞれ下記に示した 標準物質での分析が GC 法 HPLC-UV 法ともに良好だったことから 作業の効率を考え 誘導体化を必要としない HPLC-UV 法に絞って実サンプルの分析を検討した 実サンプルはキャベツ 春菊 ホウレンソウ ( 市内小売店で購入 ) の 3 点を分析した 食品からの抽出は 1 N 塩酸または蒸留水の 2 つの抽出溶媒を検討した 試料の 40 倍量の1N 塩酸または蒸留水を加え 121 で 30 分間加熱した後 0.45μ m のメンブランフィルターでろ過したものを HPLC に供した その結果 シュウ酸がゼロとの報告があるキャベツ 3) でシュウ酸が検出されたため 水抽出のサンプルに限って HPLC-BTB ポストカラム法 ( 以下 BTB 法 ) でも分析した Scientific 製 ) 昇温条件 : 50 (2) 10 / 170 1.2 / 230 検出器 : 水素炎イオン化検出器 (FID) 検出器温度 : 240 < HPLC 分析条件 > HPLC-UV 法 装置 : 高速液体クロマトグラフ ( 島津製作所 ) カラム : Unison UK-C18(4.6mmI.D. 250mmL. Imtakt 社製 ) カラム温度 :37 移動相 :20mM H 3PO4 流速 : 0.6mL/ 検出器 : フォトダイオードアレイ検出器検出波長 : 210nm 注入量 : 5 μ L BTB 法 装置 : 高速液体クロマトグラフ ( 日本分光 ) カラム : Excelpak CHA-E11 ( 300mmL. 4.6mmI.D. Yokogawa analytical systems ) を 2 本連結 移動相 :3mM 硫酸 移動相流速 : 0.5ml/ 反応試薬 : BTB 溶液 ( 0.1mM BTB, 15mM リン酸二ナトリウム ph9.6 ) 反応試薬流速 :0.5ml/ カラム温度 : 55 注入量 : 20 μ l 検出器 : UV/VIS 多波長検出器 ( 検出波長 :445nm) < 誘導体化の手順 > 標準試料 100mg に 1-ブタノール2mL 無水硫酸ナトリウム 2 g 濃硫酸 0.2mL を加え 100 30 分でエステル化を行った その後 水 5 ml とヘキサン 5 ml を加えよく混合し ヘキサン層を取り出した 残った水層にヘキサン 5 ml を加え同様に抽出した これを 3 回繰り返し 集めたヘキサン層をヘキサンで 20mL にした ここに無水炭酸ナトリウムを 0.5g 加えて硫酸を除き 1μ L を GC に注入した < GC 条件 > 装置 : キャピラリーガスクロマトグラフ ( 島津製作所 ) 注入口温度 : 220 注入量 : 1.0 μ L キャリアガス流量 : 1.5ml/ ( He ) カラム : DB-WAX ( 30m 0.25mmI.D 0.25 μ m J&W < 標準試料 > GC 法では シュウ酸の他 測定対象食品等に含まれていると考えられるギ酸 酢酸 乳酸 フマル酸 コハク酸 リンゴ酸 ピログルタミン酸 クエン酸 α-ケトグルタル酸の 10 種類を用いた 濃度はいずれも約 100mg を精秤し誘導体化を行ったが 標準品は塩や水和物となっているものも多く 酸として 60~100mg であった またシュウ酸の検量線は 0 50 100 200mg をそれぞれ誘導体化して作成した HPLC-UV 法では これまでの経験からシュウ酸と溶出時間が近いと思われるグルコン酸 酒石酸 ギ酸 リンゴ酸 乳酸 酢酸の 6 種類を用いて ピークの重なりを検証した シュウ酸の検量線は 0.1mg/100mL~ 500mg/100mL で作成した

面積値 3 結果 3.1 GC 結果標準試料 10 成分のクロマトグラムを図 1の A と B に分けて示した シュウ酸標準品の検量線を図 2 に示した 分離は良好で 検量線も 200mg までの誘導体化であれば 直線性が得られることが分かった 実サンプルを想定した場合 ホウレンソウのように シュウ酸を 100 g あたり 1000mg 程度含有する食品だとしても 試料採取量が 10g 以下であればこの検量線内で測定可能であるため 実質的には 200mg までの検量線で十分と思われる 図 2 の横軸は 誘導体化後の GC に注入した検体中のシュウ酸濃度を示した ちなみに図 1の A にあるようにピログルタミン酸とα-ケトグルタル酸は2 本のピークが現れた 分解によるものと思われるが 誘導体化 そして高温での GC 分析が検体に大きな負荷を与えていることがわかった コハク酸 Intensity ピログルタミン酸 ( 分解?) シュウ酸 α-ケトグルタル酸 ( 分解?) 図 1A 有機酸標準品のクロマトグラム ( GC 法 ) シュウ酸を含めた 4 成分 それぞれのクロマトグラムを重ね書き Intensity 酢酸乳酸フマル酸リンゴ酸クエン酸 ギ酸シュウ酸 図 1B 有機酸標準品のクロマトグラム ( GC 法 ) シュウ酸を含めた 7 成分 それぞれのクロマトグラムを重ね書き 3500000 3000000 R² = 0.9945 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 ppm 図 2 シュウ酸標準品の検量線 ( GC 法 ) 横軸はシュウ酸 0 50 100 200mg をブチルエステル化 ヘキサン抽出し 20mL にメスアップ後の濃度 3.2 HPLC 結果標準試料 7 成分のクロマトグラムを図 3 に示した 分離はベースライン付近でグルコン酸および酒石酸と重なる部分があるが グルコン酸は 食酢でみられる成分であり 酒石酸はブドウ酒でみられる成分であるなど シュウ酸を含んだ試料にはあまり見られない成分のため 影響は少ないと考えた 図 4に 1N 塩酸で調製したシュウ酸標準液のクロマトグラムを示した 食品からの抽出に用いる塩酸の影響については シュウ酸と塩酸の溶出時間の差は約 0.5 分で ベースライン分離はできていないが BTB 法とは比較にならないほど改善した 塩酸の影響の度合いは 塩酸とシュウ酸それぞれの濃度との相対的な関係によるが 図 4 に示したように たとえば 1N 塩酸であれば シュウ酸 7.5mg/100mL までの定量にはほとんど影響がないと思われた 個々の食品のケースで注意する必要はあるが 本研究の条件では 塩酸の影響は小さいと判断した また比較した他の 6 つの有機酸試料がいずれも 50mg/100mL であるのに対して シュウ酸は 5mg/100mL であり 210nm における吸光強度が高く 感度が良いことがわかった ( 図 3 ) これは夾雑成分の多い実試料を分析する上でも有利な点である 検量線は図 5 に示したように 200mg/100mL までは直線性が得られた しかし 50mg/100mL 以下になると測定値が低くなる傾向があった 理由は分からないが より正確にデータを得るには サン

面積値 酒石酸シュウ酸リンゴ酸ギ酸乳酸グルコン酸酢酸 図 3 主な有機酸標準品のクロマトグラム ( HPLC-UV 法 ) シュウ酸は 5mg/100mL その他は 50mg/100mL 5μ L 注入 塩酸 図 4 1N 塩酸で調製したシュウ酸標準品のクロマトグラム ( HPLC-UV 法 ) 1 回目 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 R² = 0.9998 実サンプルを HPLC-UV 法で検討した 図 6 に 1N 塩酸で抽出したキャベツのクロマトグラムを示すが シュウ酸の位置にピークが現れた 図には示さないが水抽出でもシュウ酸の位置にピークが現れた しかしキャベツはシュウ酸がゼロとの報告がある 3) そこで水抽出サンプルに限って BTB 法で分析したところ 図 7 のクロマトグラムを得た 図 7 の上がキャベツの水抽出の結果で 下がホウレンソウの水抽出の結果である シュウ酸のピークがキャベツで見られないことから HPLC-UV 法で得られたシュウ酸のピーク ( 図 6 ) には シュウ酸以外の成分が重なっていたことが分かった 抽出に塩酸を使用しなければ水溶性シュウ酸塩に限っては BTB 法でも測定できるため BTB 法で改めて分析したところ キャベツと春菊のシュウ酸含量はゼロで ホウレンソウは 453mg/100g だった 不溶性シュウ酸については 抽出に塩酸を用いるため BTB 法で分析できないのは すでに述べたとおりである そのため新たに HPLC-UV 法を検討し 塩酸の影響を小さくしたが 逆に夾雑成分を除く必要が生じた 結果として 実サンプルのシュウ酸分析は 水溶性シュウ酸塩であれば BTB 法で測定できることが分かったが 不溶性シュウ酸塩は夾雑成分を除くための前処理を工夫しないと難しいことが分かった 夾雑成分を除く方法の一つとして エタノール可溶分を除いた後に 不溶性シュウ酸塩を抽出する方法が報告されている 4) 抽出方法については今後の課題とした 2000000 0 0 50 100 150 200 250 mg/100ml 図 5 シュウ酸標準品の検量線 ( HPLC-UV 法 ) プル中のシュウ酸濃度の近傍の上下 2 点間 で検量線を作成するほうが良いと思われる 3.3 実サンプルの分析結果 図 6 キャベツ 1N 塩酸抽出のクロマトグ ラム ( HPLC-UV 法 )

参考文献 1 ) 松本清編 : 食品分析学 166( 2006) 培風館 2 ) 沖ほか : 日作九支報 77 68-72 ( 2011) 3 ) 大川ほか : 三重大学教育学部研究紀要 自然科学 50 79-87( 1999) 4 ) 村上ほか : 岡山大学農学部学術報告 96 25-28( 2007) 図 7 実サンプルのクロマトグラム ( BTB 法 ) 上 : キャベツ水抽出 下 : ホウレン ソウ水抽出 ( BTB 法 )