肺癌診断における生検材料, 細胞診材料の取扱い 京大総合解剖センター / 病院病理診断科 吉澤明彦
今日の内容 新 WHO 分類, 新肺癌取扱い規約の変更点 その目的 肺癌組織分類 ( 手術材料 ) 肺癌組織分類 ( 生検, 細胞診材料 ) 肺癌診療における生検 細胞診の意義 生検 細胞診材料で診断を行う際の知っておくべき臨床情報 生検 細胞診材料による診断の進め方および診断名 生検 細胞診材料からの遺伝子検査
今日の内容 新 WHO 分類, 新肺癌取扱い規約の変更点 その目的 肺癌組織分類 ( 手術材料 ) 肺癌組織分類 ( 生検, 細胞診材料 ) 肺癌診療における生検 細胞診の意義 生検 細胞診材料で診断を行う際の知っておくべき臨床情報 生検 細胞診材料による診断の進め方および診断名 生検 細胞診材料からの遺伝子検査
肺癌 新 WHO 分類の改訂の趣旨 変更点 手術材料と生検 / 細胞診材料での診断名を別に設けた 肺癌の 7 割は非切除例 遺伝子検査が優先 特に生検材料では 免疫染色が重要視されている 腺癌の亜型の改訂
遺伝子検査 ( 診断 ) と形態学的診断 どちらが大事? 早期肺癌 亜分類 進行肺癌 遺伝子検査
今日の内容 新 WHO 分類, 新肺癌取扱い規約の変更点 その目的 肺癌組織分類 ( 手術材料 ) 肺癌組織分類 ( 生検, 細胞診材料 ) 肺癌診療における生検 細胞診の意義 生検 細胞診材料で診断を行う際の知っておくべき臨床情報 生検 細胞診材料による診断の進め方および診断名 生検 細胞診材料からの遺伝子検査
手術材料での病理診断 肺癌組織分類のおさらい
肺癌組織分類 ( 手術材料 ) 扁平上皮癌 腺癌 神経内分泌腫瘍 大細胞癌 腺扁平上皮癌 多型癌 分類不能癌
扁平上皮癌 Squamous cell carcinoma
扁平上皮癌 (Squamous cell carcinoma) 定義 : 以下のいずれかあるいは両方の特徴を持つ上皮性腫瘍である 角化 細胞間橋 亜分類 角化型 keratinizing type 非角化型 non-keratinizing type 類基底細胞型 basaloid type ( 上皮内癌 squamous cell carcinoma in situ)
扁平上皮癌 (Squamous cell carcinoma) Keratinizing type Basaloid type
扁平上皮癌 (Squamous cell carcinoma) 鑑別 角化型 :IHC 不要 鑑別は炎症性 反応性病変 非角化型 :IHCが必要 鑑別はLCC 類基底細胞型 :IHCが必要 鑑別はSCLC 非角化型の写真
腺癌 adenocarcinoma
肺腺癌 最も多い組織型 多くは肺末梢発生 組織像は多彩 分子標的薬をもつ遺伝子変異が多い
腺癌の組織像は多彩 置換型 乳頭型 微小乳頭型 腺房型 充実型 置換型
肺腺癌の組織亜型 (2015 WHO) 予後 良好 Lepidic 主体 Atypical adenomatous hyperplasia (AAH) Adenocarcinoma in situ (AIS) Non-mucinous or Mucinous Minimally invasive adenocarcinoma (MIA) Non-mucinous or Mucinous 非浸潤癌 微小浸潤 (5mm 以下 ) 中間 Papillary 主体 Acinar 主体 Lepidic adenocarcinoma Acinar adenocarcinoma Papillary adenocarcinoma 不良 MP 主体 Solid 主体 Micropapillary adenocarcinoma Solid adenocarcinoma Variants of invasive adenocarcinoma 浸潤癌
Invasive adenocarcinoma ( 例 ) Papillary pattern Lepidic pattern Acinar pattern
肺腺癌 : 浸潤とは Lepidic pattern 以外の成分 (+) Papillary pattern Acinar pattern Micropapillary pattern Solid pattern 浸潤に伴ったmyofibroblastic stroma (+) 脈関侵襲 (+) STAS (+)
Spread through air space: STAS 腫瘍の辺縁を超える, 肺胞腔内への腫瘍細胞の広がり spread of lung cancer cells into air space in the lung parenchyma beyond the edge of the main tumor Micropapillary cluster / solid nest / single cells が相当 部分切除材料の再発に関与 Main subtype には加えない *Kadota et al. JTO 2014
神経内分泌腫瘍 Neuroendocrine tumor
神経内分泌腫瘍 Preinvasive lesion (Neuroendocrine tumor) DIPNECH (diffuse idiopathic pulmonary neuroendocrine cell hyperplasia) びまん性特発性肺神経内分泌細胞過形成 Carcinoid tumor Typical carcinoid Atypical carcinoid 定型カルチノイド 異型カルチノイド Neuroendocrine carcinoma (NEC) Small cell (lung) carcinoma (SCLC) 小細胞癌 Large cell neuroendocrine carcinoma (LCNEC) Combined small cell carcinoma 混合型小細胞癌 Combined large cell neuroendocrine carcinoma 大細胞神経内分泌癌 混合型大細胞神経内分泌癌
神経内分泌癌 (Neuroendocrine carcinoma) たばことの関連性が高い 気道中枢発症が多いが, 末梢でも発生する SCLC と LCNEC 予後 SCLC は発見時 手術不能症例が 7-8 割 化学療法, 放射線療法 極めて予後不良 SCLC
Neuroendocrine carcinomaの組織像 SCLC LCNEC 鑑別のポイントは
LCNEC と SCLC の細胞所見の比較 細胞所見 大細胞神経内分泌癌 小細胞癌 壊死背景 あり あり 核濃縮細胞 あり あり 核線 あり あり 細胞 大きさ 中 ~ 大 小 ~ 中 形 円形, 多角形 円形, 紡錘形 豊富な細胞質 あり 稀 クラスター あり あり 孤立性細胞 あり あり 核の鋳型 あり 多い ロゼット配列 あり 稀 核 形 円形, 類円形, 多角形 円形, 類円形, 紡錘形 裸核 あり しばしば 大小不同 あり 目立たない クロマチン 細 ~ 粗顆粒状 細 ~ 粗顆粒状 核小体の数 1~ 数個 目立たない 日本肺癌学会 肺癌取扱い規約第 8 版
NEC の細胞像 SCLC LCNEC 鑑別のポイント :N/C 比, 核クロマチン, 核小体
カルチノイド腫瘍 気道中枢, 粘膜下腫瘍様 悪性度 ( 増殖能 ) は低いが, 死亡に至る例も多い 診断は比較的困難 リボン状配列など 細胞異型は弱い 分類 ( 細胞分裂像でわける ) 定型 異型 2015 WHO より
カルチノイド腫瘍 細胞診材料での良悪は難しい
大細胞癌 Large cell carcinoma
大細胞癌 (Large cell carcinoma) 小細胞癌 腺癌 扁平上皮癌の性質を 形態学的にも免疫組織化学的にも示さない低分化の癌腫 免疫染色で腺癌マーカー 扁平上皮マーカーともに陰性 従来の大細胞癌の多くは腺癌 生検, 細胞診材料では診断してはいけない
大細胞癌 (Large cell carcinoma) TTF-1 p40 CK5/6 診断 ( 切除 ) 診断 ( 生検 ) +( 部分的 orびまん性 ) - - ADC NSCC, favor ADC +( 部分的 orびまん性 ) +( 部分的 ) - ADC NSCC, favor ADC +( 部分的 orびまん性 ) - +( 部分的 ) ADC NSCC, favor ADC - いずれかが+( びまん性 ) SqCC NSCC, favor SqCC - いずれかが+( 部分的 )10% LCC NSCC, NOS - - - LCC NSCC, NOS IHCなし IHCなし IHCなし LCC NSCC, NOS( 染色なし ) びまん性 :10% より多い部分的 :1-10%
組織型を決めるための IHC 腺癌マーカー TTF-1 (SPT24, 8G7G3/1) NapsinA 扁平上皮マーカー p40 CK5/6 p63 神経内分泌マーカー Chromogranin A Synaptophysin CD56 TTF-1
そのほかの組織型
その他の組織型 腺扁平上皮癌 肉腫型癌 紡錘細胞癌 巨細胞癌 癌肉腫 肺芽腫 分類不能癌 リンパ上皮腫様癌 NUT 転座癌 唾液腺型腫瘍 腺様嚢胞癌 上皮筋上皮癌 腺扁平上皮癌 Adenosquamous ca. NUT 転座癌
今日の内容 新 WHO 分類, 新肺癌取扱い規約の変更点 その目的 肺癌組織分類 ( 手術材料 ) 肺癌組織分類 ( 生検, 細胞診材料 ) 肺癌診療における生検 細胞診の意義 生検 細胞診材料で診断を行う際の知っておくべき臨床情報 生検 細胞診材料による診断の進め方および診断名 生検 細胞診材料からの遺伝子検査
肺癌診療における生検 細胞診の意義 良悪の判断 小細胞癌, 非小細胞癌, その他の悪性腫瘍の判定 非小細胞癌の場合, 遺伝子検査に進めるための組織型決定 ( 免疫染色をあわせて ) 適切な遺伝子検査への提出
生検 細胞診在寮で診断を行う際の知って おくべき臨床情報 腫瘍の場所 ( 左右, 葉, 区域 ), 特に複数ある場合 腫瘍の大きさ ( 変化 ), 性状 (GGO の有無 ) など 採取方法 (TBLB,TBB,CT ガイド下生検,EBUS-FNA など ) 喫煙歴 既往歴 ( 転移性腫瘍の可能性はないか 転移とすれば予想される原発は ) 腫瘍マーカー 背景の肺疾患の有無 ( 間質性肺炎など )
肺癌 生検, 細胞診材料での分類 Small cell carcinoma Adenocarcinoma NSCC, favor adenocarcinoma IHC Squamous cell carcinoma NSCC, favor squamous cell carcinoma IHC NSCC with neuroendocrine morphology Possible large cell neuroendocrine carcinoma (LCNEC) IHC NSCC, not otherwise specified (NOS) NSCC, NOS, with squamous cell and adenocarcinoma component NSCC, NOS, with unclear IHC features IHC NSCC, NOS, with null IHC features IHC NSCC, NOS, with no special staining available NSCC with spindle cell and/or giant cell carcinoma 腺癌マーカー :TTF-1, NapsinA 扁平上皮癌マーカー :p40, p63, CK5, CK5/6
NSCC, NOS (LCC with null IHC features) SCLC SQCC NSCC, favor SQCC P/D NSCC ADC markers (-) SQCC markers (-) POSITIVE Biopsy/Cytology specimen SCLC morphology ADC morphology ADC SQCC morphology P/D NSCC TTF-1 (+) Napsin A(+) P/D NSCC p40 (+) CK 5/6 (+) NSCC, favor ADC LCNEC Morphology + NE markers NSCC, possible LCNEC ADC Morphology + SQCC morphology P/D NSCC ADC markers? SQCC markers? P/D NSCC Marker study Not available NSCC, NOS (LCC with unclear IHC features) NSCC, NOS (LCC with no special staining available) NSCC, NOS, Possible ADSQ Abbreviation: ADC, adenocarcinoma; SQCC, Squamous cell carcinoma; NE, neuroendocrine; P/D, poorly differentiated; NSCC, non small cell carcinoma; LCNEC, large cell neuroendocrine carcinoma; ADQC, adenosquamous carcinoma; NOS, not otherwise specified; LCC, large cell carcinoma
日本肺癌学会肺癌取扱い規約 ( 第 8 版 ) 検体の適, 不適 判定区分 陰性 疑陽性 陽性 細胞診断
腺癌か扁平上皮癌か 治療戦略上非常に大事だが,,, 扁平上皮癌 腺癌 核 円, 楕円形 円形 クロマチン 粗大 顆粒状 核縁 不規則に肥厚 薄い 核小体 複数明瞭 > 不明瞭 1 個明瞭 細胞質 厚い 薄い 細胞境界 明瞭 > 不明瞭 明瞭
症例呈示 無理はしないで, できるだけ IHC に (IHC できなければ,NSCC, NOS で ) プルーン P40(+), TTF-1(-)
細胞診材料による報告例 検体の適正 検体適正 adequate 判定 陽性 positive 細胞診断 非小細胞癌, 扁平上皮癌疑い NSCC, favor squamous cell carcinoma (TTF1(-), p40(+))
さらに肺腺癌では, 生検, 細胞診材料で,, Adenocarcinoma with lepidic pattern Adenocarcinoma (with papillary pattern) Adenocarcinoma (with acinar pattern) Adenocarcinoma (with micropapillary pattern) Adenocarcinoma with colloid features Adenocarcinoma with fetal features Adenocarcinoma with enteric features Invasive mucinous adenocarcinoma Mucinous adenocarcinoma with lepidic pattern, if pure lepidic pattern (with papillary features) (with acinar features) (with micropapillary features)
細胞診材料での診断に亜型は? Adenocarcinoma with lepidic pattern? 所見の中でふれればいいか それよりも鑑別を気にした方がいい 転移など
今日の内容 新 WHO 分類, 新肺癌取扱い規約の変更点 その目的 肺癌組織分類 ( 手術材料 ) 肺癌組織分類 ( 生検, 細胞診材料 ) 肺癌診療における生検 細胞診の意義 生検 細胞診材料で診断を行う際の知っておくべき臨床情報 生検 細胞診材料による診断の進め方および診断名 生検 細胞診材料からの遺伝子検査
肺癌の遺伝子異常 ( 腺癌を中心に ) EGFR 遺伝子変異 KRAS 遺伝子変異 HER2 遺伝子変異 BRAF 遺伝子変異 ALK 融合肺癌 ROS1 融合肺癌 MET 融合肺癌,,,, Tsao, JTO 2016
Guideline for Treatment of Stage IV NSCC Ex.19 deletion L858R point mut. 70% of lung cancers inoperable EGFR mut. EGFR-TKI Excer. Second line エルロチニブ, アファチニブ, ゲフィチニブ Other EGFR mut. EGFR 耐性オシメルチニブ PD-L1の検査から ALK fusion ALK-TKI Excer. Second line Non- SqCC ROS1 fusion クリゾチニブ, アレクチニブ, セリチニブ ROS1-TKI Excer. Second line Stage IV NSCC IHC EGFR/ALK/ROS1 (-), PD-L1 50% EGFR/ALK/ROS1 (-), PD-L1<50% or unknown クリゾチニブ Immu-CP inhibitors Excer. Second line ニボルマブ, ペンブロリズマブ, アテゾリズマブなど Cis + α Excer. Second line SqCC PD-L1 50% PD-L1<50% or unknown Immu-CP inhibitors Cis + α Excer. Excer. Second line ニボルマブ, ペンブロリズマブ, アテゾリズマブなど Second line
EGFR 遺伝子変異癌 (Epidermal Growth Factor Receptor: 上皮成長因子受容体 ) 受容体型チロシンキナーゼ (RTK) の一つ ErbB1/Her1 細胞膜上の受容体に上皮成長因子 (EGF) が結合すると 細胞は分裂 分化 増殖する 細胞内ドメインの特定の部位で変異が起きる Lepidic/papillary pattern と相関する 細胞質内ドメインの変異 治療薬 : イレッサ タルセバ Lynch et al.; NEJM 2004
EGFR 遺伝子変異検査 コンパニオン診断 ( 保険点数 :2500) Therascreen EGFR 変異検出キット ( キアゲン社 ) 2012/2 月 コバス EGFR 変異検出キット v2.0( ロッシュダイアグノスティクス ) 2014/4 月 オシメルチニブ ( タグリッソ ) 使用に対する検査は本法のみ有効,2013/3 月 IVD ( 保険点数 :2100) PNA-LNA PCR-clump 法 PCR-Invader 法 Cycleave 法など LDT ( 保険点数 : なし ) NGS (Oncomine Solid Tumor DNA kit; サーモフィッシャー社 ) 米国では CLIA(Clinical laboratory Improvement Amendments) の規制下であり FDA の認可とは関係ない
EGFR-TKI に対する耐性遺伝子とオシメルチニブ EGFR-TKI に耐性になった NSCLC に対するオシメルチニブ試験 (AURA 試験 ) 2016/5 月保険承認 - EGFR 遺伝子の塩基配列のある部分がトレオニンからメチオニンに変異 - この変異は EGFR チロシンキナーゼ阻害剤の結合部位に生じる - 薬剤の結合性が低下し 下流シグナルが阻害されなくなり耐性化 Mok, et al. NEJM 2017 AURA 3
EGFR-TKI 耐性遺伝子に対する再生検と 血液遊離 DNA 生検 ( リキッドバイオプシー ) EGFR-TKI 耐性遺伝子 (T790M) に対してのオシメルチニブ使用に関しては, 再生検にて検索することが推奨されている 血漿中の変異型 cfdna(cell free DNA) で検索 ( リキッドバイオプシー ) が可能であり, 海外では同検査陰性例につき組織の再生検を行うことが提案されている 感度 / 特異度 = 70%/69%* JCO2016
ALK 融合肺癌 EML4-ALK 融合遺伝子の発見 細胞骨格蛋白 EML4 と RTK の一つである ALK(anaplastic lymphoma kinase) の融合蛋白の発見 EML4-ALK を発現するトランスジェニックマウスは生後すぐ肺腺癌を発症 Soda:Nature2007, Soda: PNAS2008 Mucinous cribriform pattern 肺腺癌中 約 5% 篩状 acinar pattern に関連あり 治療薬 : クリゾチニブ アレクチニブ ALK 融合の相手は EML4, KIF5B, TFG, KLC1
ALK 癒合肺癌の検出のアルゴリズム 保険適応なし IHC を先行し, 陽性例を FISH に
ALK 癒合肺癌と ALK-TKI, CoDX 6520 6520 6520 2700 AlectinibにはiAEP 法 CrizotinibにはD5F3 (Roche) Split assay
ROS1 癒合肺癌 ROS1 遺伝子は 6 番染色体長腕に位置する 2007 年,Rikova らによって肺癌細胞株において癒合遺伝子が同定される NSCLC の 1-2% 程度の頻度 若年, 非喫煙者, 女性に多く, 組織学的にも ALK 癒合肺癌に類似している TKI であるクリゾチニブにて高い治療効果が期待されている 癒合相手は,CD74, EZR, SLC34A2, SDC4 で 98%(LC-SCRUM より )
ROS1 癒合肺癌 Yoshida et al. AJSP2014
ROS1 癒合肺癌の検出法
ROS1 IHC/FISH CST, D4D6 (6/366; 1.6%) Abbott 社 (2/366; 0.5%)
ROS1 癒合肺癌の検出法 (AmoyDx キット ) RT-PCR 法 理研ジェネシス (2017/1 月承認 )
免疫監視機構の回避 PD-1 は 活性化 T 細胞上に発現し T 細胞の免疫応答を負にコントロールする受容体 PD-1 のリガンドである PD-L1 及び PD-L2 は 抗原提示細胞などの正常細胞に発現するだけでなく がん微小環境におけるがん細胞や免疫細胞での発現が確認されている がん微小環境に発現する PD-L1 及び PD-L2 は 活性化 T 細胞上の PD-1 と結合することにより T 細胞の活性化を制御し がん細胞は免疫監視機構から逃れることができる
免疫チェックポイント阻害剤 (Pembrolizmab の作用 ) Pembrolizmab( キイトルーダ ) は PD-1 に対するヒト化モノクローナル抗体であり 活性化 T 細胞上の PD-1 に結合することにより がん細胞上の PD-L1 及び PD-L2 との結合を阻害することで 癌細胞による活性化 T 細胞の抑制を阻害する 結果 抑制されていた T 細胞が再度がん抗原を認識した際に 再活性化され がん細胞を排除できるようになる
国内で開発中の免疫チェックポイント阻害剤 NSCLC に対して (2016/12 月 P3) 2015/12 月 承認 2016/12 月 承認 2017/2 月 申請 (2016/12 月 P3)
免疫チェックポイント阻害剤に対するバイオマーカー Blueprint project (Hirsch, et al. JTO 2017) オブジーボ キートルーダ 2700 抗 PD-1 抗体抗 PD-1 抗体抗 PD-L1 抗体抗 PD-L1 抗体 CheckMate026 KEYNOTE024 (NEJM2016) OAK (Lancet2017) (NEJM 2017) 京大病理部 CST: PD-L1 (E1L3N)
PD-L1 CoDX or Complementary Dx Companion Dx could be essential for the safe and effective use of a corresponding therapeutic product ( 医薬品の安全性と有効性を担保するために 医薬品の投与に必須の診断薬 ) Complementary Dx not typically linked to a specific drug but rather to a class of drugs, in order to improve development in the field of personalized medicine ( 医薬品の投与の際に参考となる情報を提供するが 必須の診断薬ではない )
IHC や遺伝子検査を行うための注意点 固定 生検 ( 細胞診 ) 材料での準備
ホルマリン固定について College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, Association for Molecular Pathology 3 団体が合同で発表した検体処理に関するガイドライン Arch Pathol Lab Med. 2013 Jun;137(6):828-60. J Thorac Oncol. 2013 Jul;8(7):823-59.
遺伝子検査を想定した肺癌固定方法 固定液 : 10% 中性緩衝ホルマリン * ( 脱灰 : 非酸性脱灰液で **) 固定方法 : 注入固定 材料採取から固定までの時間 : 30 分以内 (4,3-8 時間以内 ) 固定時間 : 生検 :6-18 時間, 手術 :8-18 時間手術は6-48 時間が許容される 固定後の病理切りだし : 固定液から水洗ののち速やかに * 新鮮凍結, アルコール固定は可, 酸性もしくは非緩衝ホルマリン, あるいは重金属製の固定液は不可 ** 酸性脱灰液 ( ギ酸, 塩酸, プランクリュクロ ) を仕様した脱灰は不可,EDTA は可 ( ただし, 固定に時間がかか ** 脱灰が必要な材料では, 遺伝子検査を避ける ( 他の部位で材料を作成 ) 日本肺癌学会 :EGFR 遺伝子変異検査の手引き第 3.05 版日本肺癌学会, 日本病理学会合同 WG: 肺癌におけるALK 免疫染色プラクティカルガイドライン Lindeman, et al. Arch Pathol Lab Med. 2013 Jun;137(6):828-60. 第 1.1 版
生検材料による遺伝子検査へ流れ 保険点数 HE 染色特殊染色 (EvG, PAS) 免疫染色 腺癌 or 扁平上皮癌 TTF-1, NapsinA, p40, CK5/6 (TTF-1, p40, CK7, ALK(5A4)) NET or NEC TTF-1, CGA, Synaptophysin, Ki67 400+1600 遺伝子検査 EGFR 遺伝子変異 ALK( 高感度 IHC) ALK(FISH) 未染 5μm, 5 枚 4μm, 4 枚 4μm, 3 枚 2500 or 2100 2700 6520 PD-L1(IHC) ROS1(IHC) 4μm, 5 枚 4μm, 4 枚 2700 (400) ROS1(Amoy) 4μm, 5 枚 2500 * いったい, 何枚の未染スライドを, どのタイミングで用意しなければならないのか!
H30 診療報酬改定
病理検査室として 適切な固定の管理 固定までの時間の管理 固定時間 (6 時間から48 時間 ) どの材料で検査を行うか 生検材料と細胞診材料がある場合 細胞診 (LBC) は? 遺伝子検査は同時に行う 診療報酬は? 金曜日問題
Take Home Message 肺癌の新 WHO 分類 / 肺癌取扱い規約が発表された 切除材料による診断と細胞診材料による診断が分けられた IHCが重要な位置にある 遺伝子検査に適した材料の準備