主論文 参考論文一覧表 主論文 1. E f f e c t s o f K ( r i p a s u d i l ), a n o v e l R O C K i n h i b i t o r, o n t r a b e c u l a r m e s h w o r k a

新規緑内障治療薬の開発に向けた R h o キナーゼ阻害薬リパスジルの応用薬理 A p p l i e d P h a r m a c o l o g y o f a R h o - k i n a s e I n h i b i t o r R i p a s u d i l f o r D e v e l o p m e n t o f a N o v e l T h e r a p e u t i c A g e n t f o r G l a u c o m a 平成 29 年度 論文博士申請者 金児佳生 (K a n e k o, Y o s h i o ) 指導教員 菱沼滋

主論文 参考論文一覧表 主論文 1. E f f e c t s o f K - 1 1 5 ( r i p a s u d i l ), a n o v e l R O C K i n h i b i t o r, o n t r a b e c u l a r m e s h w o r k a n d S c h l e m m ' s c a n a l e n d o t h e l i a l c e l l s. K a n e k o Y., O h t a M., I n o u e T., M i z u n o K., I s o b e T., T a n a b e S., T a n i h a r a H., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0 ( 2 0 1 6 ). 2. A d d i t i v e i n t r a o c u l a r p r e s s u r e - l o w e r i n g e f f e c t s o f r i p a s u d i l w i t h g l a u c o m a t h e r a p e u t i c a g e n t s i n r a b b i t s a n d m o n k e y s. K a n e k o Y., O h t a M., I s o b e T., N a k a m u r a Y., M i z u n o K., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5 ( 2 0 1 7 ). 参考論文 1. E f f e c t s o f K - 1 1 5, a R h o - k i n a s e i n h i b i t o r, o n a q u e o u s h u m o r d y n a m i c s i n r a b b i t s. I s o b e T., M i z u n o K., K a n e k o Y., O h t a M., K o i d e T., T a n a b e S., C u r r. E y e R e s., 39, 8 1 3-8 2 2 ( 2 0 1 4 ). 2. N o n c l i n i c a l s a f e t y a s s e s s m e n t f o r t h e s e n s i t i z i n g p o t e n t i a l o f K - 1 1 5. O m i c h i K., W a t o E., K a n e k o Y., Y o n e y a m a S., M a t s u d a A., S a s a k i M., B u l l A., C o l e m a n D., K a g a w a M., A m a n o Y., F u n d a m. T o x i c o l. S c i., 1, 1 9-2 7 ( 2 0 1 4 ). 3. S p e c i e s d i f f e r e n c e s i n m e t a b o l i s m o f r i p a s u d i l ( K - 1 1 5 ) a r e a t t r i b u t e d t o a l d e h y d e o x i d a s e. I s o b e T., O h t a M., K a n e k o Y., K a w a i H., X e n o b i o t i c a, 46, 579-590 ( 2 0 1 6 ). 4. R O C K 阻害薬の緑内障治療への期待 - リパスジルの眼圧下降作用機序 -. 金児佳生, M e d. S c i. D i g e s t, 42, 2 7 2-2 7 5 ( 2 0 1 6 ). 5. V a s c u l a r n o r m a l i z a t i o n b y R O C K i n h i b i t o r : t h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f r i p a s u d i l ( K - 1 1 5 ) e y e d r o p i n r e t i n a l a n g i o g e n e s i s a n d h y p o x i a. Y a m a g u c h i M., N a k a o S., A r i t a R., K a i z u Y., A r i m a M., Z h o u Y., K i t a T., Y o s h i d a S., K i m u r a K., I s o b e T., K a n e k o Y., S o n o d a K. H., I s h i b a s h i T., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 57, 2 2 6 4-2 2 7 6 ( 2 0 1 6 ).

本論文で使用した略語を以下に示す C A I D U E S E C M F I T C F - a c t i n GON G T P IC 50 I O P M L C N T G OH P B S PG P O A G R O C K C a r b o n i c a n h y d r a s e i n h i b i t o r D e e p e n i n g o f u p p e r e y e l i d s u l c u s E x t r a c e l l u l a r m a t r i x F l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e F i l a m e n t o u s a c t i n G l a u c o m a t o u s o p t i c n e u r o p a t h y G u a n o s i n e - 5'- t r i p h o s p h a t e H a l f m a x i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n I n t r a o c u l a r p r e s s u r e M y o s i n l i g h t c h a i n N o r m a l t e n s i o n g l a u c o m a O c u l a r h y p e r t e n s i o n P h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e P r o s t a g l a n d i n P r i m a r y o p e n a n g l e g l a u c o m a R h o - a s s o c i a t e d c o i l e d - c o i l c o n t a i n i n g p r o t e i n k i n a s e S C E TEER TM S c h l e m m s c a n a l e n d o t h e l i a l T r a n s e n d o t h e l i a l e l e c t r i c a l r e s i s t a n c e T r a b e c u l a r m e s h w o r k ZO- 1 Z o n u l a o c c l u d e n s - 1

目次 第一章要約... 1 第二章序論... 5 第一節緑内障の分類... 5 第二節緑内障の治療... 7 第三節房水動態と緑内障治療薬の作用機序... 9 第四節 R O C K 阻害薬リパスジルの開発... 10 第三章リパスジルの眼圧下降作用... 12 第一節背景及び目的... 12 第二節実験方法... 12 第三節実験結果... 14 第四節考察... 15 第四章リパスジルの眼圧下降機序... 17 第一節背景及び目的... 17 第二節実験方法... 17 第三節実験結果... 23 第四節考察... 24 第五章リパスジルと緑内障治療薬の併用効果... 28 第一節背景及び目的... 28 第二節実験方法... 28 第三節実験結果... 30 第四節考察... 33 第六章総括... 35 第一節本研究結果の総括... 35 第二節緑内障治療における R O C K 阻害薬の意義... 35

第三節 R O C K 阻害薬の多面的な緑内障治療効果... 36 第四節 新規緑内障治療薬グラナテック 点眼液の創製および 眼科疾患への貢献... 38 謝辞... 39 参考文献... 40

第一章要約 本研究では 眼房水主流出路に作用する新規緑内障治療薬の創 製を目的として R O C K 阻害薬リパスジルの眼圧下降作用とその 機序及び緑内障治療における有用性を解析した 緑内障は 世界的に失明原因の上位を占める進行性且つ慢性的な眼疾患であり 種々の病因により眼圧が上昇して視神経が障害され 視野欠損が進行する 現在 エビデンスに基づいた唯一確実な緑内障治療は眼圧を下降させることのみであり 眼圧下降薬による薬物治療が第一選択として用いられる 緑内障治療の第一選択薬として 副流出路促進薬であるプロスタグランジン ( PG) 関連薬 房水産生抑制薬である交感神経 β 受容体遮断薬 (β 遮断薬 ) の単剤投与が推奨されているが 単剤はもとより 複数の薬剤を併用投与しても目標眼圧まで到達できないことが多いのが現状である 一方 緑内障治療薬にはそれぞれの作用機序に基づいた副作用が存在し 例えば PG 関連薬では 目の周りが窪む上眼 瞼溝深化 ( D U E S ) や色素沈着 β 遮断薬では 徐脈 血圧低下 や気管支収縮などの副作用により 薬物の選択に制限がかかる場合がある そこで 有効性 安全性に優れた新規緑内障治療薬 特に ヒトにおいて主要な房水流出経路である主流出路に直接作用する薬物の創出が強く求められている 本研究では 主流出路を介した房水流出促進作用をもつ新規緑内障治療薬の標的分子として R h o キナーゼ (R O C K ) に着目した 新規 R O C K 阻害薬リパスジルは 既存の R O C K 阻害薬であるファスジルや Y - 27632 よりも強力なヒト R O C K - 1 および 1

R O C K - 2 阻害活性を持ち ウサギおよびサルに点眼することによ り濃度依存的な眼圧下降作用を示す このリパスジルの眼圧下降作用を詳細に解析するために まず 既存の緑内障症治療薬と眼圧下降作用を比較した その結果 ウサギおよびサルにリパスジルを点眼することにより得られる眼圧下降作用は 他の緑内障治療薬と同等かそれ以上であった また 代表的な R O C K 阻害薬である Y - 27632 やファスジルも リパスジルと同様に強力な眼圧下降作用を示したことから リパスジルの眼圧下降作用は R O C K 阻害作用によることが示唆された そこで次に リパスジルによる眼圧下降作用の機序を解析した 先行研究において リパスジルの眼圧下降作用には 主流出路からの房水流出促進作用が関与していることが強く示唆されていることから このリパスジルによる主流出路からの房水流出増加の機序を明らかにするため 主流出路を構成する線維柱帯細胞およびシュレム管内皮細胞をサルより単離して解析した その結果 まず リパスジルは 初代培養サル 線維柱帯細胞に対して r e t r a c t i o n ( 細胞構造の退縮 ) や r o u n d i n g ( 細胞体の球形化 ) といった細胞形態の変化を誘発すること これらの細胞の形態変化には F - a c t i n の脱重合が関与することが明らかとなった 同様の変化は他の R O C K 阻害薬においても認められたことから リパ スジルによるこれらの変化には R O C K 阻害作用が関与すると考 えられた 次に 初代培養サル シュレム管内皮細胞の単層培養 系を用い 内皮細胞透過性に対するリパスジルの作用を解析した その結果 リパスジルは シュレム管内皮細胞の膜電気抵抗値を 低下させるとともに F I T C - d e x t r a n の内皮細胞透過性を亢進さ 2

せることが明らかとなった さらに 初代培養サル シュレム管内皮細胞の細胞接着に対するリパスジルの作用を解析した結果 アドヘレンスジャンクションに関与する β - c a t e n i n や c a d h e r i n の分布には変化が認められなかったが タイトジャンクションに関与する Z o n u l a o c c l u d e n s - 1 ( ZO- 1 ) の消失が認められた 同様の結果は 他の R O C K 阻害薬を用いた場合においても認められた 以上の結果から リパスジルは R O C K 阻害作用を介して 線維柱帯細胞における細胞骨格の変化ならびにシュレム管内皮細胞におけるタイトジャンクションの減弱をもたらし その結果 主流出路における房水流出抵抗を減少させて眼圧下降作用を発揮していることが示唆された 緑内障治療には 房水産生抑制作用や副流出路促進作用をもつ薬物が用いられているが ここに主流出路を介した房水流出促進作用をもつリパスジルが加わることによって 房水動態に関わる 3 種の機構をコントロールできるようになると考えられる したがって これらの異なる眼圧下降機序をもつ薬物を併用することで より強力な眼圧下降作用が期待できると考えられる そこで 既存の緑内障治療薬とリパスジルとの併用による眼圧下降作用を評価した その結果 正常眼圧白色ウサギにおいて リパスジルと既存の眼圧下降薬 ( β 遮断薬チモロール α 2 刺激薬ブリモニジン 炭酸脱水酵素阻害薬ブリンゾラミド αβ 遮断薬ニプラジロール ) との 2 剤併用点眼により それぞれの単剤点眼に比べて眼圧下降作用が増強されること また 正常眼圧サルにおいて リパスジルと PG 関連薬ラタノプロスト リパスジルとラタノプロスト チモロール配合剤 リパスジルと炭酸脱水酵素阻害薬ドルゾ 3

ラミド チモロール配合剤の併用点眼により 眼圧下降作用が増 強されることが明らかとなった 以上のことから R O C K 阻害薬リパスジルは 主流出路促進薬 として緑内障治療に新たな選択肢を提供するとともに 種々の緑 内障治療薬との併用によって より有効な臨床効果をもたらすも のと期待される 4

第二章序論 第一節緑内障の分類緑内障は 日本のみならず世界的に失明原因の上位を占める進行性眼疾患であり 視神経と視野に特徴的変化を有し 通常 眼圧を十分に下降させることにより視神経障害を改善もしくは抑制 しうる眼の機能的構造的異常を特徴とする疾患 1 ) と定義される 即ち 緑内障は種々の病因により眼圧が上昇し 視神経が障害さ れ萎縮することにより 視野異常を来たし 視力が低下していく 疾患である 一度萎縮を起こした視神経は回復しないため 適切 な治療を施さないと失明に至る 2 ) 進行する視神経障害を遅くす るために眼圧を下降させる治療が行われるが 適切な治療を施しても視機能は現状維持にとどまり 回復は望めない難治性の疾患である 一方で 緑内障は患者の自覚なしに視神経障害が進行するため その早期発見と早期治療による視野障害の進行の阻止あるいは抑制が重要である 2000 年から 2002 年に行われた緑内障疫学調査 ( 多治見スタディ ) によれば 日本人の 40 歳以上の成人の緑内障有病率は 5.0% であり その大部分である約 8 割 (3.9%) は 原発開放隅角緑内障 [ 高眼圧群 : 0.3% 正常眼圧群 : 3.6%] と推定された さらに 緑内障の新規発見率は 89% であり 潜在 的な緑内障患者が多数存在していることも明らかとなった 3, 4 ) また 世界的な高齢者人口の増加に伴い 今後益々緑内障患者数の増大が懸念されている 緑内障の本態は 進行性の網膜神経節細胞の消失とそれに対応した視野異常である緑内障性視神経症 (g l a u c o m a t o u s o p t i c 5

n e u r o p a t h y : G O N ) である 緑内障は 隅角の所見 眼圧上昇および付随する要因により 以下のように 3 つに分類される 即ち 眼圧上昇や視神経障害の原因が特定できない 原発緑内障 外傷 眼疾患 全身疾患または薬物使用等の特定された原因により眼圧上昇が生じる 続発緑内障 生まれつき隅角に発育不全があり 房水の排出が妨げられるために起こる 発達緑内障 の 3 つである 原発緑内障 は 正常開放隅角を有する原発開放隅角緑内障 ( P O A G ) と 遺伝的背景や加齢による前眼部形態の変化等で惹起される隅角閉塞により眼圧上昇を来す原発閉塞隅角緑内障に分類される P O A G ( 広義 ) は 高眼圧 ( I O P > 2 1 m m H g ) を呈する P O A G ( 狭義 ) と正常眼圧 ( I O P 2 1 m m H g ) を呈する N T G に区分されている 1) P O A G ( 狭義 ) は 眼圧の異常な上昇が視 神経障害の発展に強く関与していると考えられる 一方 N T G は 眼圧が正常値 ( 10-2 1 m m H g ) に留まり 眼圧以外の要因が GON の発生に関与していることが推測されるが N T G においても眼圧を下降させることで視野障害の伸展を抑制できることから 眼圧のコントロールが重要となる 5, 6) また 高眼圧を呈してい ることや房水動態に異常が認められること等 P O A G ( 狭義 ) と共通した特徴を有するものの 視神経の特徴的形態変化ならびに視野異常の存在を欠く病態は 高眼圧症 (OH) と呼ばれる OH は視神経症の眼圧抵抗性の強い症例とする考え方がある一方 P O A G ( 狭義 ) の前段階とも考えられ 後に視神経障害を生じる可能性を孕んでいる 1) 続発緑内障 は ステロイド緑内障 落屑緑内障や色素緑内障等の房水流出抵抗増加によって引き起こ 6

される開放隅角緑内障と閉塞隅角緑内障に大別される 1) 第二節緑内障の治療 緑内障治療の目的は患者の視機能を維持することであり 現時 点でエビデンスに基づいた唯一確実な緑内障の治療法は 眼圧を 下降すること のみである 1) その治療法には 薬物治療以外に レーザー線維柱帯形成術 観血的手術 ( 濾過手術 房水流出路再建手術や毛様体破壊術 ) 等の手術療法がある 薬物で眼圧が制御できない時や 閉塞隅角緑内障患者が急性緑内障発作を起こした場合には手術療法が行われるが P O A G ( 広義 ) 落屑緑内障 色素緑内障に対する治療では薬物療法が第一選択として用いられる また 緑内障治療において 視神経乳頭の血流改善治療や神経保 護治療が注目されている 7, 8) 緑内障診療ガイドラインでは 緑内障の薬物治療方針として 多剤併用は副作用の増加やアドヒアランスの低下に繋がることもあるため 原則として第一選択薬であるプロスタグランジン ( PG) 関連薬または交感神経 β 受容体遮断薬 (β 遮断薬 ) の単剤治療より開始することが望ましく 単剤治療により期待した効果が得られない場合には 眼圧下降作用と副作用に留意しながら他剤を追加した併用療法を行うと記載されている 1) 現在 PG 関連薬 β 遮断薬の他に 交感神経 α および β 受容体遮断薬 ( αβ 遮断薬 ) 交感神経 α 1 受容体遮断薬 ( α 1 遮断薬 ) 炭酸脱水酵素阻害薬 ( C A I ) 交感神経 α 2 受容体刺激薬 ( α 2 刺激薬 ) 交感神経刺激薬 および副交感神経刺激薬が緑内障治療薬として使用されてい る ( T a b l e 1 ) PG 関連薬のラタノプロストではノンレスポンダ 7

ーの存在 9 ) が β 遮断薬のチモロールでは長期間の使用で効果が 減弱すること ( l o n g - t e r m d r i f t ) 10) が報告されている また 単剤のみでは眼圧を目標値以下にコントロールすることが困難な ために複数の薬剤を併用する患者も多く 緑内障治療薬を使用し ている患者の約半数が複数の薬剤を併用しているとの報告 1 1, 1 2 ) もある さらに 3 剤以上を併用している症例も多く 複数の薬剤を併用しても十分な治療効果が得られない場合があるのが現状である 一方 緑内障治療薬にはそれぞれの作用機序に基づいた副作用 ( T a b l e 2 ) や禁忌 慎重投与となる疾患ならびに薬物相互作用 ( T a b l e 3 ) が存在する PG 関連薬ではメラニン産生増加に伴う虹彩や眼瞼の色素沈着や睫毛の変化 眼周囲のくぼみを呈する上 眼瞼溝深化 ( D U E S ) 等の副作用 1 3, 14) が報告されている β 遮 断薬では徐脈 血圧低下や気管支収縮などの副作用により 1 5 ) 心 疾患や呼吸器疾患を持つ患者に対する使用が制限される場合があ る また 第一選択薬と併用されることが多い C A I や α 2 刺激薬 では それぞれ使用感 ( 眼刺激感 霧視 ) 1 6 ) や皮膚感作性 1 7 ) が 報告されている さらに配合剤や多剤併用では それぞれの作用機序に基づく副作用の増加が懸念される等 現状の緑内障薬物治療には多くの問題点が横たわっている 近年 医療技術の進歩により 緑内障に対する新たな診断および治療手段が多数臨床導入されているが 上述のように 多種の薬剤を併用しても眼圧のコントロールや視神経症の進行を阻止あるいは抑制ができない症例も多く存在している 緑内障は 視機能を維持するために生涯にわたる治療が必要な疾患であり 8

Q u a l i t y o f L i f e あるいは Q u a l i t y o f V i s i o n を考慮した疾患の管理を長期にわたって行うことは容易ではない したがって 強力な眼圧下降作用を有する もしくは併用効果や副作用の観点で有用性を持つ新たな作用機序を有する薬剤の創出が強く求められている 第三節房水動態と緑内障治療薬の作用機序眼は他の組織と大きく異なり 光を透過させるための構造を有している そのため水晶体および角膜は無血管構造を有する 眼房水は 眼の前房および後房を満たす透明な液体であり 水晶体および角膜に栄養を提供し 不要な物質を排泄し 神経伝達物質 を輸送するために必要である 1 8 ) 眼房水は 眼組織の生理的機 能の維持のみならず 形態維持のためにも必要であり 眼房水によって眼内圧を適度に維持 調節することにより 角膜や目を膨張させ 眼球の形状および光学特性を調節している 眼内圧は 眼房水の圧力によって変化し 産生される眼房水量と 2 つの房水流出経路によって排出される眼房水量とのバランスにより調整されている ( F i g. 1 ) 18) 即ち 眼房水は毛様体より産生され 虹彩と水晶体の間を通り 前房へ流入する 前房に到達した眼房水は 主流出路である線維柱帯 - シュレム管経路と副流出路であるぶどう膜強膜流路より排出される 主流出経路では 眼圧依存的に流量が増減し 眼圧が高いときは多く 眼圧が低いときは少なく 眼房水を流出させ眼圧を保つ働きをする 19) 特に主流出路は ヒトにおいて房水流出量の 80-90% を占める主要な流出経路であ る 1 9 ) 副流出路は 眼圧非依存的な房水流出を示し 一定量 ( 房 9

水流出量の 10-20%) の眼房水を常に流出する働きがある 19-21) F i g. 2 に 緑内障治療薬の作用機序を示す 22) 現在使用され ている緑内障治療薬は全て 房水動態の調節を行うことにより眼房水の減少 即ち眼圧を下降させる 眼圧を下降させる薬物は 副流出路であるぶどう膜強膜流量を増加させて眼圧を下降させる薬物 (PG 関連薬や α 1 遮断薬 ) と房水産生を抑制して眼圧を下降させる薬物 (β 遮断薬や C A I ) の大きく 2 つに分けられる また これらの作用を併せ持つ薬物も用いられている ( α 2 刺激薬や αβ 遮断薬 ) 一方 主流出路に作用する薬物として 交感神経刺激薬または副交感神経刺激薬が知られているが これらは 毛様体筋の収縮により間接的に主流出路を広げる薬物であり 効果が弱く 副作用が大きいため 使用は限定的である 第四節 R O C K 阻害薬リパスジルの開発 P O A G ( 狭義 ) で見られる眼圧上昇の多くは 主流出路の障害によって生じる 緑内障眼の線維柱帯 - シュレム管組織では 線維柱帯細胞の構造変化 細胞同士の収縮 凝集や傍シュレム管結合組織の細胞外マトリックス ( E C M ) の増加により線維柱帯の閉塞が引き起こされた結果 房水の流出抵抗が増加して眼圧上昇が引 き起こされる (F i g. 3 ) 2 2, 23) したがって 主流出路に作用す る緑内障治療薬の有効性が期待されるものの 上述のように 主流出路に作用する有用な緑内障治療薬がないのが現状である そこで本研究では 主流出路に直接作用する新規緑内障治療薬の標的分子として R h o キナーゼ ( R O C K : R h o - a s s o c i a t e d c o i l e d - c o i l c o n t a i n i n g p r o t e i n k i n a s e ) に着目した R O C K 10

は 低分子量 G T P 結合タンパク質 R h o の標的タンパク質として 1996 年に同定されたセリンスレオニンキナーゼである 24, 25) R O C K には R O C K - 1 および R O C K - 2 のサブタイプが存在し いずれも全身に普遍的に発現し 血管平滑筋の収縮 細胞の形態 変化 細胞の遊走や伸展 神経の成長ならびに多くの遺伝子発現 制御等の機能に関与することが報告されている 2 6 ) 眼部におい ても R O C K は 房水流出に関与している虹彩毛様体や線維柱帯 に分布しており 緑内障や高眼圧症に関与していることが示唆されている 27-29 ) また それ以外に角膜や網膜などにも発現しており 網膜症 加齢黄斑変性症 白内障 角膜機能不全にも関与 することが示唆されている 30-36) リパスジル塩酸塩水和物 ( 4 - F l u o r o - 5 - { [ ( 2 S ) - 2 - m e t h y l - 1,4- d i a z e p a n - 1 - y l ] s u l f o n y l } i s o q u i n o l i n e m o n o h y d r o c h l o r i d e d i h y d r a t e )( 以下 リパスジル ) は より強力な R O C K 阻害薬 として創薬された ( F i g. 4 ) 3 7, 3 8 ) リパスジルは 強力かつ選 択的 R O C K 阻害作用を示し ヒト R O C K - 1 および R O C K - 2 に対 する IC 50 値は それぞれ 0.051 µm および 0. 0 1 9 µm である ( T a b l e 4 ) 39) 正常眼圧白色ウサギおよび正常眼圧サルにリパ スジルを点眼すると 速やかに濃度依存的かつ強力な眼圧下降作用を示すことを 著者らはすでに明らかにしている ( F i g. 5 F i g. 6 ) 3 9 ) そこで 新規緑内障治療薬の開発に向け リパスジルの眼圧下降機序及び緑内障治療における有用性を解析した 11

第三章リパスジルの眼圧下降作用 第一節背景及び目的序論で述べた通り 著者らは リパスジルを正常眼圧白色ウサギまたは正常眼圧サルに点眼することにより 濃度依存的かつ強力な眼圧下降作用を示すことをすでに明らかにしている ( F i g. 5 F i g. 6 ) 3 9 ) そこで 正常眼圧白色ウサギおよび正常眼圧サルを 用いて リパスジルと現在使用されている緑内障治療薬ならびに 他の R O C K 阻害薬との眼圧下降作用を比較し リパスジルの緑内 障治療薬としての特性や効力を解析した 40) 第二節実験方法 2-1 ) 実験動物 実験には 雄性 JW( J a p a n e s e w h i t e ) 系白色ウサギ ( 体重約 2.0-3. 0 k g ) および雄性カニクイザル ( 体重約 2.5-5. 0 k g ) を使用した ウサギは 室温 22-25 湿度 50-70% 明期 7 : 0 0-1 9 : 0 0 の環境で 飼料および飲料水を自由摂取させて飼育した サルは 室温 22-28 湿度 40-80% 明期 7 : 0 0-1 9 : 0 0 の環境で 1 日あたり 100 g の飼料および飲料水を自由に摂取させて飼育した 実験は 興和株式会社東京創薬研究所動物実験委員会で承認を受け実施した 2-2 ) 使用薬物 リパスジルは 興和株式会社東京創薬研究所で合成した Y - 27632 およびファスジルは それぞれ C a l b i o c h e m ( S a n 12

D i e g o CA) および E n z o L i f e S c i e n c e s ( F a r m i n g d a l e NY) より入手した リパスジル Y - 2 7 6 3 2 およびファスジルは リパ スジルの基剤であるリン酸緩衝液に溶解して点眼液とした 0. 5 % チモロール ( チモプトール 点眼液 0. 5 % ; 参天製薬株式会社 大阪 ) 0. 0 1 % ブナゾシン ( デタントール 0. 0 1 % 点眼液 ; 参天 製薬株式会社 ) および 0. 0 0 5 % ラタノプロスト ( キサラタン 点眼液 0.005%; ファイザー株式会社 東京 ) は 臨床製剤を使 用した 2-3 ) 実験方法ウサギおよびサルの眼圧は 空圧圧平式眼圧計 ( M o d e l 3 0 C l a s s i c P n e u m o t o n o m e t e r ; M e d t r o n i c S o l a n O p h t h a l m i c P r o d u c t s I n c. J a c k s o n v i l l e FL) を使用して測定した 測定前に 0.4% オキシブプロカイン ( ベノキシール 点眼液 0.4%; 参天製薬株式会社 ) を 1 滴点眼して表面麻酔を施した 薬物点眼前に 右眼の初期眼圧を 2 回測定し 2 回目の眼圧を 0 時間値とした ウサギを用いた実験では 点眼 0.5 1 2 3 4 および 5 時間後に サルの実験では 点眼 1 2 4 6 および 8 時間後に 眼圧を測定した 点眼液は ウサギの実験では 50 μ L を サルの 実験では 20 μ L を片眼に投与した 実験は 全ての個体に全ての 点眼液を投与するラテン方格クロスオーバー方式で実施し 同一 実験日に使用する点眼液が偏らないように割り付けた それぞれ の実験は 点眼薬のウォッシュアウトのため 5 日間以上の休薬期 間を設けて行った 13

2-4 ) 統計解析 各測定時における眼圧測定値 ( i n t r a o c u l a r p r e s s u r e : I O P ) は 平均値 ± 標準誤差で表記した 有意差検定は 薬物点眼後の各 測定時における I O P について 点眼前 ( 0 時間値 ) を対照として D u n n e t t 型多重比較検定を行った なお 全ての検定で危険率 5% 未満を統計学的に有意とした 統計解析には S A S I n t e g r a t i o n T e c h n o l o g i e s C l i e n t ( S A S I n s t i t u t e I n c. C a r y N C ) を使用した 第三節実験結果正常眼圧白色ウサギを用いたリパスジルと緑内障治療薬の眼圧下降作用の比較 F i g. 7 に 0. 4 % リパスジル 0. 5 % チモロールまたは 0.01% ブナゾシンを正常眼圧白色ウサギに単回点眼した際の I O P を示す リパスジル点眼群は点眼 1 2 および 3 時間後 チモロール点眼群は点眼 0.5 および 1 時間後 ブナゾシン点眼群は点眼 1 および 2 時間後に 点眼前の I O P と比較して有意な I O P の下降が認められた 最大眼圧下降作用を示した際の I O P は リパスジルでは 1 1. 7 m m H g チモロールでは 14.4 m m H g ブナゾシンでは 1 3. 2 m m H g であった 正常眼圧サルを用いたリパスジルと緑内障治療薬の眼圧下降作用 の比較 F i g. 8 に 0. 4 % リパスジル 0.5% チモロールまたは 0.005% ラタノプロストを正常眼圧サルに単回点眼した際の I O P 14

を示す リパスジル点眼群は 点眼 1 2 および 4 時間後に点眼 前の I O P と比較して有意な I O P の下降作用を示した チモロー ル点眼群およびラタノプロスト点眼群は 点眼後の I O P に有意差 は認められなかったが それぞれ 点眼 1 から 2 時間後および点 眼 4 時間後をピークとする I O P の下降が認められた 最大眼圧下 降作用を示した際の I O P は リパスジルでは 1 7.9 m m H g チモ ロールでは 1 7. 9 m m H g ラタノプロストでは 1 8.9 m m H g であ った 正常眼圧白色ウサギを用いた R O C K 阻害薬の眼圧下降作用 F i g. 9 に 0. 4 % リパスジル 0.4 % Y - 27632 または 0.4 % ファスジルを正常眼圧白色ウサギに単回点眼した際の I O P を示す リパスジル点眼群は点眼 1 および 2 時間後に ファスジル点眼群は点眼 1 2 および 3 時間後に 点眼前の I O P と比較して有意な I O P の下降が認められた Y - 27632 点眼群は 点眼後の I O P に有意な差が認められなかったが 点眼 2 時間後をピークとする I O P の下降が認められた 最大眼圧下降作用を示した際の I O P は リパスジルでは 1 5. 4 m m H g Y - 27632 では 1 6. 6 m m H g ファスジルでは 1 5. 9 m m H g であった 第四節考察正常眼圧ウサギおよび正常眼圧サルにおいて 0.4% リパスジルは 既存の緑内障治療薬と同等かそれ以上の眼圧下降作用を示した また リパスジルは ウサギの上強膜静脈圧に近い眼圧にまで眼圧を下降させたことから リパスジルは 主流出路を介し 15

た眼圧下降の限界値まで作用を発揮していると考えられる 41) さらに リパスジルと同様に 他の R O C K 阻害薬 ( Y - 27632 およびファスジル ) もウサギにおいて強力な眼圧下降作用を示した 同様の結果は 本研究で用いた以外の R O C K 阻害薬においても報告されている 4 2-4 5 ) 以上のことから リパスジルの眼圧下降作用は R O C K 阻害作用に起因すると考えられる 16

第四章リパスジルの眼圧下降機序 第一節背景及び目的正常眼圧白色ウサギを用いた房水動態に関する先行研究において 0.4% リパスジルの点眼により 前房に一定の圧力を負荷した際の房水の流出量を評価する t w o - l e v e l c o n s t a n t p r e s s u r e 法を用いた房水流出率 ( O u t f l o w f a c i l i t y ) の有意な増加が認められた一方で 平均分子量 70, 000 の F I T C - d e x t r a n の前房からぶどう膜への移行を評価する F I T C - d e x t r a n 灌流法を用いたぶどう膜強膜流量 ( U v e o s c l e r a l o u t f l o w ) ならびに前房中の F I T C が房水産生により希釈される割合を評価するフルオロフォトメトリー法を用いた房水産生量 ( A q u e o u s f l o w r a t e ) に対して変化が 認められなかった ( T a b l e 5 ) 3 9, 4 0 ) 房水流出率は主に主流出路 からの房水流出機能を ぶどう膜強膜流量は副流出路からの房水流出機能を 房水流量は房水産生能について示すことから リパスジルの眼圧下降作用には 線維柱帯 - シュレム管を介した主流出路からの房水流出促進作用が関与している可能性が考えられた しかしながら 房水動態の評価に用いたこれらの実験系は 他の流出経路の変化による二次的な影響を少なからず受けてしまうことから リパスジルの主流出路に対する作用を明確にする目的で 線維柱帯細胞ならびにシュレム管内皮細胞に対するリパスジルの直接作用について検討した 40) 第二節実験方法 2-1 ) 使用細胞 17

カニクイザル ( 6-12 月齢 ) の眼を株式会社新日本科学 ( 鹿児島 ) より入手し 線維柱帯およびシュレム管内皮細胞を単離した 顕微鏡観察下で 6-0 ナイロン糸をシュレム管内腔に挿入し シュレム管組織を単離した 線維柱帯組織をピンセットで採集し コラーゲンゲルでコーティングしたプレート上に播種し 初代培養 t r a b e c u l a r m e s h w o r k ( TM) 細胞とした 線維柱帯組織を完全に除去した後 残ったシュレム管組織からシュレム管を分離し コラーゲンゲルでコーティングしたプレート上で培養し 初代培 養 S c h l e m m s c a n a l e n d o t h e l i a l ( S C E ) 細胞とした 初代培 養 TM 細胞および S C E 細胞は 10% ウシ胎児血清 ( f e t a l b o v i n e s e r u m ; F B S H y c l o n e L a b o r a t o r i e s L o g a n UT) 2 m M g l u t a m i n e 1 0 0 U / m L p e n i c i l l i n 100 μ g / m L s t r e p t o m y c i n および 0. 5 μ g / m L a m p h o t e r i c i n B を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m ; D M E M 和光純薬工業株式会社 ) を用いて 37 5 % CO 2 の条件下で培養した 実験には 4 継代から 5 継代の TM 細胞 ならびに 4 継代から 8 継代の S C E 細胞を使用した 2-2 ) 使用薬物 リパスジルは 興和株式会社東京創薬研究所で合成した Y - 27632 およびファスジルは それぞれ C a l b i o c h e m および E n z o L i f e S c i e n c e s より入手した リパスジル Y - 27632 およ びファスジルは P B S に溶解した後 培地で 10 倍希釈して使用し た なお c o n t r o l ( 対照群 ) として 薬物を含まない P B S を使 用した 18

2-3 ) 実験方法 サル 線維柱帯細胞の形態変化 TM 細胞を 6 ウェルプレート上に 1 ウェル当たり 1 1 0 4 個の 細胞密度で播種した 一晩培養して細胞を完全にプレートに付着 させ 細胞同士が接着しない程度の細胞密度まで培養した後 P B S 1 μ M もしくは 10 μ M リパスジル 10 μ M Y - 27632 ま たは 10 μ M ファスジルを培養ウェルに添加した 濃度は培地添 加後の最終濃度を示す 薬物を添加した 60 分後に培養ウェルの培地を除去し 薬物を含まない培地に交換した 位相差顕微鏡により細胞の形態を観察し 薬物添加 60 分後および薬物除去し培地を交換した 2 時間後に写真撮影した サル 線維柱帯細胞における F - a c t i n 免疫組織化学的評価 細胞を培養する前に 8 ウェルチャンバースライドに 0. 1 % ゼ ラチン溶液 ( 和光純薬工業株式会社 ) を 1 ウェルあたり 500 μ L ずつ添加し 一晩静置した後 P B S で洗浄することによりゼラチ ンコーティングを施した チャンバースライド上に 1 ウェルあたり 1 1 0 4 個の TM 細胞を播種し 一晩培養して細胞を完全にプレートに付着させた 細胞同士が接着しない程度の細胞密度に付着した TM 細胞に P B S 1 μ M もしくは 10 μ M リパスジル 10 μ M Y - 27632 または 10 μ M ファスジルを培地に添加した 濃度は培地添加後の最終濃度を示す 薬物を添加した 30 分後 60 分後に培地を除去し 培地を 4 % パラホルムアルデヒド - P B S に交換して 15 分間固定した また 薬物を添加した 60 分後に薬 19

物を含まない培地に交換し その 2 時間後に培地を 4 % パラホルムアルデヒド-PBS に交換して 15 分間固定した 次いで c y t o s k e l e t a l b u f f e r ( 10 m M 2 - m o r p h o l i n o e t h a n s u l f o n i c a c i d p o t a s s i u m s a l t ( M E S ) 150 m M N a C l 5 m M e t h y l e n e g l y c o l t e t r a a c e t i c a c i d ( E G T A ) 5 m M M g C l 2 5 m M グルコース p H 6. 1 ) および s e r u m b u f f e r ( 10% F B S を含む P B S ) で洗浄した 細胞に 0.5% T r i t o n X - 100 を室温で 12 分間インキュベートして透過処理を施し s e r u m b u f f e r で洗浄後 さらに s e r u m b u f f e r を用いて 4 で 2 時間ブロッキングした F - a c t i n は 0.05 m g / ml p h a l l o i d i n - t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ( T R I T C ) ( S i g m a - A l d r i c h S t. L o u i s MO) を用いて室温で 1 時間標識した P B S で洗浄した後 4, 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e ( D A P I ) を含むマウント剤 ( V E C T A S H I E L D ; V e c t o r L a b o r a t o r i e s B u r l i n g a m e CA) を用いて細胞を染色 封入し 蛍光顕微鏡 ( B X 5 1 ; オリン パス株式会社 東京 ) を用いて撮影した P h a l l o i d i n - T R I T C の 画像を撮るための励起波長および蛍光波長は それぞれ 540 nm および 5 7 0 n m に設定した D A P I の画像を撮るための励起波長 および蛍光波長は それぞれ 3 6 0 n m および 4 6 0 n m に設定した サル シュレム管内皮細胞における細胞膜電気抵抗の測定 単層培養した初代培養 S C E 細胞の細胞膜電気抵抗 (TEER) を 測定した トランスウェル 12 ウェル培養プレート ( ポリエステル 膜 孔径 0.4 μ m C o r n i n g T r a n s w e l l ; S i g m a - A l d r i c h ) のイ ンサートウェルに S C E 細胞を 1 ウェル当たり 5 1 0 4 個の細胞密 20

度で播種し 10% F B S を含む D M E M 中 37 5 % CO 2 の条 件で培養した 2 週間培養し コンフルエントに達した後 TEER を測定した インサートウェルおよびボトムウェルの培地 を P B S 1 μ M 5 μ M もしくは 25 μ M のリパスジル Y - 27632 またはファスジルを含む D M E M 培地に交換した 培 地の交換量はインサートウェルが 0. 5 m L ボトムウェルが 1.5 ml とし インサートウェルとボトムウェルの水面の高さを揃えた TEER は 薬物添加 30 分後および 60 分後に電気抵抗値測定システム ( M i l l i c e l l E R S ; M i l l i p o r e B i l l e r i c a MA) を用いて測定し ネット値 (Ω cm 2 ) を記録した サル シュレム管内皮細胞における細胞透過性の測定 初代培養 S C E 細胞は 細胞膜電気抵抗の測定と同じ条件で培養 した S C E 細胞を単層培養したトランスウェルのボトムウェル側 に 50 μ M の平均分子量 4, 000 の FITC- d e x t r a n ( S i g m a - A l d r i c h ) を含む P B S または 1 μ M 5 μ M もしくは 25 μ M のリパスジル Y - 27632 またはファスジル含有培地に交換した インサートウェルは F I T C - d e x t r a n を含まない P B S または 1 μ M 5 μ M もしくは 2 5 μ M のリパスジル Y - 27632 もしくはファスジルを含む培地に交換した 培地の交換量はインサートウェルが 0. 5 m L ボトムウェルが 1. 5 m L とし インサートウェルとボトムウェルの水面の高さを揃えた 薬物を添加した培地に交換した 60 分後にインサートウェルから培地を回収し 蛍光プレートリーダー (G e m i n i X P S ; M o l e c u l a r D e v i c e s, L L C S u n n y v a l e CA) を用いて 490 nm の励起波長および 530 nm 21

の蛍光波長で蛍光強度を測定し F I T C - d e x t r a n 透過性とした サル シュレム管内皮細胞における免疫組織化学的評価初代培養 S C E 細胞を コラーゲンⅠコーティング 8 ウェルチャンバースライド上に 1 ウェル当たり 1 1 0 5 個の細胞密度で播種し 10% F B S を含有する D M E M で培養した コンフルエントに培養した細胞に P B S 1 μ M 5 μ M もしくは 25 μ M のリパスジル 5 μ M もしくは 25 μ M の Y - 2 7 6 3 2 またはファスジルを培地に加えた 薬物濃度は培地添加後の最終濃度を示す 薬物を添加した 30 分後に培地を除去し 4 % パラホルムアルデヒド-PBS に交換し 15 分間細胞を固定し 次いで c y t o s k e l e t a l b u f f e r および s e r u m b u f f e r で洗浄した 洗浄後 0.5% T r i t o n X - 100 を加え 室温で 12 分間インキュベートすることで細胞を透過処理した S e r u m b u f f e r を用いて 4 で 2 時間ブロッキングした後 細胞に 1 次抗体として ウサギ抗 ZO-1 抗体 (1.25 μ g/ml; I n v i t r o g e n C a r l s b a d CA) ウサギ抗 β - c a t e n i n 抗体 ( 1 : 1000 希釈 ; S i g m a - A l d r i c h ) またはウサギ抗 p a n - c a d h e r i n 抗体 ( 1 : 100 希釈 ; S i g m a - A l d r i c h ) を添加し 4 で一晩インキュベートした 細胞を s e r u m b u f f e r で洗浄し 次いで二次抗体として A l e x a F l u o r 4 8 8 修飾ヤギ抗ウサギ I g G ( H + L ) ( I n v i t r o g e n ) を添加し 室温で 30 分間インキュベートした P B S で洗浄した後 D A P I を含むマウント剤 ( V E C T A S H I E L D ) を用いて封入し 蛍光顕微鏡 ( B X 5 1 ) を用いて観察した ZO- 1 β - c a t e n i n および c a d h e r i n は励起波長および蛍光波長を それぞれ 4 8 8 n m および 5 1 9 n m に設定し画像を撮影した D A P I は 22

励起波長および蛍光波長を それぞれ 3 6 0 n m および 4 6 0 n m に 設定し画像を撮影した 2-4 ) 統計解析 全てのデータは平均値 ± 標準誤差で示した S C E 細胞における TEER および F I T C - d e x t r a n 透過性の実験では c o n t r o l 群を対 照として D u n n e t t 型多重比較検定を行った なお 全ての検定で危険率 5% 未満を統計学的に有意とした 統計解析には S A S I n t e g r a t i o n T e c h n o l o g i e s C l i e n t ( S A S I n s t i t u t e I n c. ) を使用した 第三節実験結果 サル 線維柱帯細胞の形態変化に対するリパスジルの作用 TM 細胞にリパスジルを作用させた 60 分後に r e t r a c t i o n や r o u n d i n g といった細胞の形態変化が認められた ( F i g. 10) ま た 同様の変化が Y - 27632 またはファスジルによっても認められた さらに 薬物を含まない培地に交換した 2 時間後には 細胞形態の変化は消失した ( F i g. 1 1 ) 次に 細胞の骨格に関与する F - a c t i n について免疫染色したところ 1 μ M および 10 μ M リ パスジル 10 μ M Y - 27632 または 10 μ M ファスジルを添加し た 3 0 分および 60 分後に F - a c t i n の染色部位の消失が認められ た ( F i g. 1 2 ) この F - a c t i n の染色部位の消失は 薬物を含まな い培地に交換した 2 時間後に回復した サル シュレム管内皮細胞透過性に対するリパスジルの作用 23

S C E 細胞透過性を評価するために T E E R および F I T C - d e x t r a n 透過性を測定した ( F i g. 1 3 および F i g. 1 4 ) 薬 物添加 30 分後において リパスジルは 5 μ M Y - 27632 およびファスジルは 25 μ M の濃度で c o n t r o l と比較して TEER の有意な低下を示した 薬物添加 6 0 分後において リパスジル Y - 27632 およびファスジルは 5 μ M 以上の濃度で c o n t r o l と比 較して TEER の有意な低下を示した F I T C - d e x t r a n の透過性は 薬物添加 6 0 分後において リパスジルは 5 μ M で Y - 27632 お よびファスジルは 25 μ M の濃度で c o n t r o l と比較してインサー トウェルの F I T C - d e x t r a n の蛍光強度の有意な増加を示した サル シュレム管内皮細胞における細胞接着に対するリパスジル の作用 S C E 細胞の細胞接着に対するリパスジルの作用を検討するため に ZO- 1 ( F i g. 1 5 ) c a d h e r i n ( F i g. 1 6 ) および β - c a t e n i n ( F i g. 1 7 ) を免疫染色した リパスジルを 5 μ M もしくは 25 μ M Y - 2 7 6 3 2 およびファスジルを 25 μ M の濃度で作用させると c o n t r o l で認められる細胞間の ZO-1 の染色が消失した 一方 いずれの R O C K 阻害薬も c a d h e r i n および β - c a t e n i n の局在を変化させなかった 第四節考察 線維柱帯およびシュレム管を介する主流出路は 霊長類におけ る房水流出の主要な経路である 1 9, 2 0 ) 正常および緑内障眼の両 方において 線維柱帯 シュレム管内腔および傍シュレム管結合 24

組織に生じる細胞の構造変化 細胞接着 ならびにシュレム管内皮細胞透過性は房水流出量の調節において重要な役割を果たすことが示唆されている 20) 本研究では リパスジルの主流出路に対する作用を明らかにするために サル線維柱帯細胞ならびにサル シュレム管内皮細胞を用いて検討した その結果 線維柱帯細胞に対してリパスジルを作用させると r e t r a c t i o n や r o u n d i n g といった細胞形態の変化が認められ 同時に F - a c t i n の脱重合が認められた また Y - 27632 やファスジルでも同様の結果を示したことから リパス ジルの線維柱帯細胞形態変化は R O C K 阻害作用により誘発されていることが示唆された R e t r a c t i o n や r o u n d i n g といった細胞形態変化は 線維柱帯組織の委縮や閉塞を減少させ 細胞間隙を広げる作用があり 4 6, 4 7 ) 眼房水の流出抵抗を減少させると考えられる 一方 シュレム管内皮細胞において リパスジルは単層培養系で細胞膜電気抵抗値の減少と F I T C - d e x t r a n の透過性の亢進 を示した Y - 2 7 6 3 2 やファスジルでも同様の結果が認められたこ とから これらの作用は R O C K 阻害作用により引き起こされていることが考えられた さらにリパスジルは 細胞間のタイトジャンクションに関与する ZO- 1 を消失させた一方で アドヘレンスジャンクションに関与する β - c a t e n i n や c a d h e r i n に対して影響を及ぼさなかったことから リパスジルは タイトジャンクションが関与する細胞間接着を弱めて細胞透過性を亢進していることが示唆された これらの作用は Y - 27632 やファスジルでも同様に認められたことから リパスジルのタイトジャンクションに対する減弱作用は R O C K 阻害作用によるものと考えられた 25

R O C K はミオシンフォスファターゼの抑制によりミオシン軽鎖 ( M L C ) のリン酸化を促進し F - a c t i n を重合させることや R O C K を阻害することによりミオシン軽鎖の脱リン酸化を介して F - a c t i n の脱重合を引き起こすことが報告されている 25) 一方で R O C K は F - a c t i n の形成に関与する複数のシグナル伝達系に関与し 直接 M L C のリン酸化を引き起こすことや L I M キナーゼの活性化を介して F - a c t i n の重合を促進することも報告されていることから 48) R O C K 阻害薬によって引き起こされる F - a c t i n の脱重合に関与するシグナルはミオシンフォスファターゼ以外にも存 在する可能性がある ZO- 1 の C 末端側の領域は F - a c t i n に結合 することにより 細胞膜上での局在が維持されていることや 4 9 ) シュレム管内皮細胞においても R O C K 阻害薬により F - a c t i n の脱 重合が誘発されることが報告されていることから 50) リパスジ ルは R O C K 阻害作用を介した F - a c t i n の脱重合により ZO- 1 の 細胞膜での局在を消失させたと考えられる シュレム管内皮細胞 における細胞透過性は緑内障眼のみならず正常眼でも房水流出抵 抗となることから 5 1, 5 2 ) 細胞透過性の亢進は N T G 等の眼圧が 正常値の組織においても房水流出促進作用を強く働き掛けることができると考えられる 加えて サル線維柱帯細胞における細胞の形態変化ならびに F - a c t i n の消失は薬物の除去により回復したことから リパスジルによる細胞骨格および形態変化は可逆的な変化であると考えられる 同様に シュレム管内皮細胞に対する R O C K 阻害薬の透過性亢進作用も薬物の除去により回復すること が報告されている 5 0 ) 以上 リパスジルは R O C K 阻害作用により線維柱帯細胞にお 26

ける細胞骨格の変化ならびにシュレム管内皮細胞におけるタイトジャンクションの減弱を誘発し 主流出路における房水流出抵抗を減少させることにより房水流出を増加させ 眼圧下降作用を発揮していることが示唆された 27

第五章リパスジルと緑内障治療薬の併用効果 第一節背景及び目的前述の通り リパスジルは 線維柱帯およびシュレム管内皮細胞に直接作用し 房水流出を促進することが明らかとなった 緑内障の薬物治療では 房水産生を抑制する β 遮断薬と副流出路を促進する PG 関連薬が第一選択薬として使用されており また 同様の作用を有する薬物が必要に応じて併用されている 1) 即ち 現時点で 線維柱帯 - シュレム管に直接作用して房水流出を促進する緑内障治療薬は無いため この主流出路を介した房水流出促進作用を示すリパスジルと他の作用機序を有する薬物とを併用することによって さらに強い眼圧下降効果が得られる可能性がある ( F i g. 1 8 ) そこで リパスジルと他の緑内障治療薬とを併用投与した際の眼圧下降作用を評価した 5 3 ) 第二節実験方法 2-1 ) 実験動物 実験には 雄性 JW 系白色ウサギ ( 体重約 2.0-3. 0 k g ) および 雄性カニクイザル ( 体重約 5.0-8.5 kg) を使用した ウサギは 室温 22-25 湿度 50-70% 明期 7 : 0 0-1 9 : 0 0 の環境で 飼料および飲料水を自由摂取させて飼育した サルは 室温 22-28 湿度 40-80% 明期 7 : 0 0-1 9 : 0 0 の環境で 1 日あたり 1 0 0 g の飼料および飲料水を自由摂取させて飼育した 実験は 興和株式会社東京創薬研究所動物実験委員会の承認を受け実施した 28

2-2 ) 使用薬物リパスジルは 興和株式会社東京創薬研究所で合成し リパスジルの基剤であるリン酸緩衝液に溶解して点眼液とした 0. 5 % チモロール ( チモプトール 点眼液 0.5%; 参天製薬株式会社 ) 1% ブリンゾラミド ( エイゾプト 懸濁性点眼液 1 % ; 日本アルコン株式会社 大阪 ) 0.1 % ブリモニジン ( アイファガン 点眼液 0.1%; 千寿製薬株式会社 大阪 ) 0.25% ニプラジロール ( ハイパジールコーワ 点眼液 0.25%; 興和創薬株式会社 ) および 0. 0 0 5 % ラタノプロスト ( キサラタン 点眼液 0. 0 0 5 % ; ファイザー株式会社 ) ラタノプロスト チモロール配合剤 ( ザラカム 配合点眼液 ; ファイザー株式会社 ) ドルゾラミド チモロール配合剤 ( コソプト 配合点眼液 ; 参天製薬株式会社 ) は 臨床製剤を使用した 2-3 ) 実験方法ウサギおよびサルの眼圧は 空圧圧平式眼圧計 ( M o d e l 3 0 C l a s s i c P n e u m o t o n o m e t e r ) を使用して測定した 測定前に 0.4% オキシブプロカイン ( ベノキシール点眼液 0. 4 % ) を 1 滴点眼して表面麻酔を施した 点眼前に 右眼の初期眼圧を 2 回測定し 2 回目の眼圧を 0 時間値とした ウサギを用いた実験では 点眼 0.5 1 2 3 4 および 5 時間後に サルの実験では 点眼 1 2 4 および 6 時間後または点眼 1 2 3 4 6 および 8 時間 後に眼圧を測定した ウサギの実験では 5 0 μ L の点眼液を サル の実験では 2 0 μ L の点眼液を片眼に投与した 併用の場合は 0.4% リパスジルを点眼した 5 分後に併用薬を点眼した なお 29

リパスジルと緑内障治療薬を併用した際の測定時間は先に投与し たリパスジル点眼後の時間とした 全ての実験は 各個体に全て の点眼液を投与するラテン方格クロスオーバー方式で実施し 同 一実験日に使用する点眼液が偏らないように割り付けた 実験は 点眼薬のウォッシュアウトのため 5 日間以上の休薬期間を設けて 行った 2-4 ) 統計解析 全てのデータは平均値 ± 標準誤差で示した 各測定時における眼 圧測定値 (I O P ) より 投与前 ( 0 時間値 ) からの眼圧変化値 ( I O P ) を算出した ウサギを用いた検討では 各測定時点の 基剤 単剤点眼群および併用点眼群の I O P について T u k e y 型多 重比較検定を行った サルを用いた検討では 各測定時点の単剤 点眼群および併用点眼群の I O P について リパスジルとラタノ プロストを併用点眼した際の眼圧下降作用の検討では T u k e y 型多重比較検定を リパスジルとラタノプロスト チモロール配合剤を併用点眼した際の眼圧下降作用の検討およびリパスジルとドルゾラミド チモロール配合剤を併用点眼した際の眼圧下降作用の検討では S t u d e n t の t 検定を行った なお 全ての検定で危険率 5% 未満を統計学的に有意とした 統計解析には S A S I n t e g r a t i o n T e c h n o l o g i e s C l i e n t ( S A S I n s t i t u t e I n c. ) を使用した 第三節実験結果 リパスジルとチモロールを併用点眼した際の眼圧下降作用 30

F i g. 19 に 0. 4 % リパスジルと 0. 5 % チモロールを単独もし くは併用点眼した際の I O P を示す 基剤点眼群と比較して リ パスジル点眼群では点眼 1 および 2 時間後 チモロール点眼群では点眼 0.5 から 3 時間後 リパスジルとチモロールの併用点眼群では点眼 0.5 から 5 時間後まで有意な I O P の下降が認められた さらに チモロール点眼群と比較して リパスジルとチモロールの併用点眼群では 点眼 0.5 3 および 4 時間後において有意に強い I O P の下降が認められた リパスジルとブリンゾラミドを併用点眼した際の眼圧下降作用 F i g. 20 に 0. 4 % リパスジルと 1% ブリンゾラミドを単独も しくは併用点眼した際の I O P を示す 基剤点眼群と比較して リパスジル点眼群では点眼 0.5 から 3 時間後 ブリンゾラミド点眼群では点眼 1 から 4 時間後 リパスジルとブリンゾラミドの併用点眼群では点眼 0.5 から 5 時間後まで有意な I O P の下降が認められた さらに リパスジルとブリンゾラミドの併用群では ブリンゾラミド単独点眼群と比較して点眼 0.5 1 2 3 および 5 時間後において リパスジル単独点眼群と比較して点眼 2 から 5 時間後において有意に強い I O P の下降が認められた リパスジルとブリモニジンを併用点眼した際の眼圧下降作用 F i g. 21 に 0. 4 % リパスジルと 0. 1 % ブリモニジンを単独も しくは併用点眼した際の I O P を示す 基剤点眼群と比較して リパスジル点眼群では点眼 1 および 2 時間後 ブリモニジン点眼 群では点眼 2 および 3 時間後 リパスジルとブリモニジンの併用 31

点眼群では 点眼 0.5 から 4 時間後まで有意な I O P の下降が認 められた さらに リパスジルとブリモニジンの併用群では ブ リモニジン単独点眼群と比較して点眼 0.5 および 1 時間後におい て リパスジル単独点眼群と比較して点眼 0.5 2 および 3 時間 後において有意に強い I O P の下降が認められた リパスジルとニプラジロールを併用点眼した際の眼圧下降作用 F i g. 22 に 0. 4 % リパスジルと 0. 2 5 % ニプラジロールを単独もしくは併用点眼した際の IOP を示す 基剤点眼群と比較して リパスジル点眼群は点眼 0.5 から 2 時間後 ニプラジロール点眼群は点眼 0.5 および 1 時間後 リパスジルとニプラジロールの併用点眼群は点眼 0.5 から 4 時間後まで 有意な I O P の下降が認められた リパスジルとラタノプロストを併用点眼した際の眼圧下降作用 F i g. 23 に 0. 4 % リパスジルと 0. 0 0 5 % ラタノプロストを単 独もしくは併用点眼した際の I O P を示す ラタノプロスト点眼 群と比較して リパスジル点眼群では点眼 1 および 2 時間後 リ パスジルとラタノプロストの併用点眼群では点眼 1 から 4 時間後 まで有意な I O P の下降が認められた リパスジルとラタノプロスト チモロール配合剤を併用点眼した際の眼圧下降作用 F i g. 24 に 0. 4 % リパスジルと 0. 0 0 5 % ラタノプロスト 0. 5 % チモロール配合剤を併用点眼した際の I O P を示す ラタ 32

ノプロスト チモロール配合剤点眼群と比較して リパスジルと ラタノプロスト チモロール配合剤の併用点眼群では点眼 1 から 6 時間後まで有意な I O P の下降が認められた リパスジルとドルゾラミド チモロール配合剤を併用点眼した際の眼圧下降作用 F i g. 25 に 0. 4 % リパスジルと 1 % ドルゾラミド 0. 5 % チモロール配合剤を併用点眼した際の IOP を示す ドルゾラミド チモロール配合剤点眼群と比較して リパスジルとドルゾラミド チモロール配合剤の併用点眼群では 点眼 1 2 4 および 6 時間後に有意な I O P の下降が認められた 第四節考察緑内障の薬物治療では 目標とする眼圧にコントロールするために複数の緑内障治療薬が併用投与されることが多い しかしながら 多種の緑内障治療薬がある中で 現在主に使用されている緑内障治療薬の作用部位は副流出路を介した房水流出の促進作用と房水産生の抑制作用の 2 種類である 薬物の併用は異なる作用機序 作用部位の薬物を用いることが重要であるが 少しでも眼圧下降作用を得るために 同じ部位に作用する薬物を併用することも多く 房水産生抑制作用を有する薬物同士の配合剤も使用されているのが現状である したがって 現在の緑内障治療薬では眼圧下降作用が十分であるとは言えず 新規作用機序 新規作用部位を介した眼圧降下作用を示す薬剤の開発が望まれている 本研究では リパスジルと既存の緑内障治療薬との併用効果に 33

ついて解析するため ウサギおよびサルを用いて リパスジルと 房水産生抑制薬 ( β 遮断薬チモロール 炭酸脱水酵素阻害薬ブリ ンゾラミド ) 房水産生抑制 副流出路促進薬 ( α 2 刺激薬ブリモ ニジン αβ 遮断薬ニプラジロール ) 副流出路促進薬 ( PG 関連薬 ラタノプロスト ) とを併用した際の眼圧下降作用を評価した ま た サルを用いて リパスジルと 2 種配合剤 ( PG 関連薬ラタノ プロスト β ゾラミド β 遮断薬チモロール配合剤 炭酸脱水酵素阻害薬ドル 遮断薬チモロール配合剤 ) とを併用した際の眼圧下 降作用を評価した その結果 主流出路に作用するリパスジルは 房水産生抑制薬や副流出路促進薬との併用により さらなる眼圧下降作用が得られることが明らかとなった ( T a b l e 6 ) 特に リパスジルと 2 種配合剤との併用においても眼圧下降作用の増強が認められたことから リパスジルを含めた 3 種類以上の薬物を併用投与しても 眼圧下降作用に上乗せ効果が期待できることが明らかとなった また リパスジルを併用投与することにより 眼圧下降作用の持続時間が延長した 点眼液は点眼後眼表面から速やかに消失してしまうことから 持続的な眼圧下降作用が得られることは緑内障治療において高い有用性を持つと考えられる また この研究結果は 緑内障患者においてチモロールまたはラタノプロストにリパスジルを併用することで 眼圧下降作用がさら に増強した臨床研究と一致する 5 4 ) したがって 本研究により 明らかとなったリパスジルの眼圧下降作用は 緑内障患者におい ても同様に発揮されるものと期待される 34

第六章総括 第一節本研究結果の総括 本研究により まず R O C K 阻害薬リパスジルは 既存の緑内 障治療薬と同等かそれ以上の眼圧下降作用を有することが明らか となった また リパスジルは R O C K 阻害作用により線維柱帯 細胞における F - a c t i n の脱重合による細胞骨格の変化ならびにシュレム管内皮細胞におけるタイトジャンクションの減弱による細胞透過性の亢進を誘発し 主流出路における房水流出抵抗を減少させることにより房水流出を増加させ 眼圧下降作用を発揮していることが示唆された さらに リパスジルは 房水産生抑制作用または副流出路からの房水流出促進作用を有する既存の緑内障治療薬との併用により 優れた眼圧下降効果を示すことが明らかとなった 即ち 主流出路に作用する R O C K 阻害薬リパスジルは 新規緑内障治療薬として高い有用性を持つことが明らかとなった 第二節緑内障治療における R O C K 阻害薬の意義緑内障治療において 目的とする眼圧まで単剤で下降させることは難しく しばしば複数の作用機序の点眼薬を併用する 一方で それぞれの作用機序に基づいた副作用も存在することから できるだけ異なる作用機序を持つ薬剤の中から 患者ごとに適した薬剤を選択することが望ましいと考えられる リパスジルは 緑内障治療薬として初めての R O C K 阻害薬であり また 現在使用されている緑内障治療薬とは異なり 主流出路に直接作用して眼圧下降作用を示す 即ち リパスジルが緑内障治療薬に加わる 35

ことによって 房水動態に関わる 3 つの機構 ( 主流出路 副流出路 房水産生 ) を薬物によりコントロールすることができるようになるとともに それぞれの薬物を組み合わせることで より強力な眼圧下降作用を発揮できるようになると考えられる したがって リパスジルは 既存薬との併用効果や薬剤選択性の拡大 ( 既存薬による副作用の回避を含む ) において高い有用性をもち 緑内障治療に新たな選択肢を提供する また 本研究では 正常眼圧動物を用いてリパスジルの眼圧下降作用を解析したが 高分子ポリマー ( カルボキシビニルポリマー ;C V P ) の前房内投与により線維柱帯を物理的に閉塞させたウサギ高眼圧モデルに対しても リパスジルは眼圧下降作用を示す ( F i g. 2 6 ) 55) この結果は 線維柱帯閉塞を主因とする房水流出障害による眼圧上昇に対しても リパスジルが有効であることを示している したがって リパスジルは 主流出路の閉塞が認められる緑内障症患者にも有効な治療薬となると期待される 第三節 R O C K 阻害薬の多面的な緑内障治療効果 R O C K 阻害薬は 他の緑内障治療薬にはない直接的な抗炎症作 用を有することが報告されている 5 6, 5 7 ) P O A G および続発緑内 障眼では 房水中の炎症性サイトカインの産生の増加が認められること 5 8, 5 9 ) ステロイドの投与によって誘導されるグルココルチコイド誘発高眼圧症等の二次的な開放隅角緑内障では 炎症等によって線維柱帯の細胞外マトリクス ( E C M ) の蓄積が引き起こ されること 60) が報告されているが デキサメタゾンにより誘発 されたブタ眼の高眼圧モデルにおいて Y - 2 7 6 3 2 は 線維柱帯細 36

胞の E C M 発現増加抑制作用や房水流出促進作用を示すことが報 告されている 6 1 ) また Y - 2 7 6 3 2 は シュレム管内皮細胞にお いて眼房水の流出に関与する巨大空胞の増加作用を示すこと 5 1 ) が報告されていることから R O C K 阻害薬は 複数の機序により 線維柱帯 - シュレム管内皮細胞を介した房水流出を促進させている可能性は否定できない ( F i g. 2 7 ) 緑内障の病因には 眼圧の上昇だけでなく 後眼部の血液循環障害も関与する この血液循環障害に対する緑内障治療薬の改善効果も報告されている 6 2-6 6 ) 動物モデルにおいて リパスジルや他の R O C K 阻害薬は 血管拡張作用を介して網膜血流を増加さ せることが報告されていることから 6 7-69) ヒトにおいても同様 の血液循環改善効果を示す可能性も考えられる さらに 緑内障治療薬の神経保護作用に関する多くの報告があるが この視神経保護効果は 緑内障性神経障害の進行抑制に有益である 例えば ブリモニジンはラットにおいて神経保護効果を示し ヒトにおける視野欠損の進行を抑制することが報告され ている 8, 7 0 ) また リパスジルは マウス視神経挫滅モデルに おいて視神経細胞の保護作用を示すことが報告されており 7 1 ) 他の R O C K 阻害薬でも同様の効果が報告されている 7 2-7 4 ) した がって R O C K 阻害薬のもつ付加的な神経保護作用は 二次的に 視神経障害に効果を発揮する可能性がある 以上 リパスジルは 主流出路からの房水流出促進作用や他の緑内障治療薬との併用による眼圧下降作用の増強のみならず 緑内障に伴う二次的な炎症や視神経障害に対する改善作用を介して 緑内障に対する多面的な治療効果を発揮する可能性が考えられる 37

第四節 新規緑内障治療薬グラナテック 点眼液の創製および眼 科疾患への貢献 リパスジルは 種々の非臨床試験 3 9, 4 0, 5 3, 7 5-7 7 ) および臨床 試験 5 4, 7 8-8 1 ) において有効性および安全性が確認され 2014 年 9 月 世界初の R O C K 阻害作用による緑内障治療薬 ( グラナテッ ク 点眼液 0.4%) として日本で承認された 直接的な主流出路 促進作用を有するリパスジルは 既存の緑内障治療薬では十分な眼圧下降が得られない患者のみならず 副作用や禁忌等の制約によって他の緑内障治療薬が使用できない患者に対して 新たな治療選択肢を提供するものである 一方 R O C K は 緑内障の他にも糖尿病性網膜症 加齢黄斑変 性 白内障 角膜内皮疾患等の眼科疾患にも関与しており 29-33) これらの病態が リパスジルによって改善されることも報告され つつある 8 2-8 4 ) 既に 臨床でのリパスジルの安全性は確認され ていることから これらの疾患に対するリパスジルの有効性が明 らかにされれば 緑内障以外の眼科疾患の治療においても大きな 飛躍をもたらすことが期待される 38

謝辞 本論文を作成するにあたり 終始懇切丁寧な御指導 御鞭撻を賜りました明治薬科大学菱沼滋准教授に深謝の意を表します 本論文作成に際し 多大な御指導御助言を賜りました明治薬科大学大石一彦教授 ならびに紺谷圏二教授に深謝いたします 本研究の遂行ならびに本論文執筆の機会を与えて頂き その間御理解と御鞭撻を賜りました興和株式会社専務取締役田辺宗平博士 東京創薬研究所長水野憲博士に深く感謝いたします また 投稿論文作成に際し多大な御指導および御助言を賜りました 熊本大学大学院生命科学研究部谷原秀信教授 井上俊洋博士 興和株式会社東京創薬研究所主席研究員井上敬介博士 主任研究員山崎裕之博士に感謝の意を表します 本研究遂行にあたり懇切なる御助言ならびにご協力を頂きました磯部友之博士 太田雅之氏 中村勇斗氏 南木愛弥氏 岩下由華子氏に厚く御礼申し上げます 39

参考文献 1 ) 日本緑内障学会. 緑内障診療ガイドライン ( 第 3 版 ), 日眼会誌, 1 1 6, 5-4 6 ( 2 0 1 2 ). 2 ) 厚生労働科学研究科学研究費補助金難治性疾患克服研究事業網膜脈絡膜 視神経萎縮症に関する研究. 平成 17 年度総括 分担研究報告書, 2 6 3-2 6 7 ( 2 0 0 6 ). 3 ) I w a s e A., S u z u k i Y., A r a i e M., Y a m a m o t o T., A b e H., S h i r a t o S., K u w a y a m a Y., M i s h i m a H. K., S h i m i z u H., T o m i t a G., I n o u e Y., K i t a z a w a Y., O p h t h a l m o l o g y, 111, 1 6 4 1-1 6 4 8 ( 2 0 0 4 ). 4 ) Y a m a m o t o T., I w a s e A., A r a i e M., S u z u k i Y., A b e H., S h i r a t o S., K u w a y a m a Y., M i s h i m a H. K., S h i m i z u H., T o m i t a G., I n o u e Y., K i t a z a w a Y., O p h t h a l m o l o g y, 1 1 2, 1 6 6 1-1 6 6 9 ( 2 0 0 5 ). 5 ) A n d e r s o n D. R., D r a n c e S. M., S c h u l z e r M., A m. J. O p h t h a l m o l., 1 3 6, 820-829 ( 2 0 0 3 ). 6 ) A r a i e M., K i t a z a w a M., K o s e k i N., B r. J. O p h t h a l m o l., 81, 852-8 5 6 ( 1 9 9 7 ). 7 ) T a m a k i Y., A r a i e M., T o m i t a K., T o m i d o k o r o A., N a g a h a r a M., S u r v. O p h t h a l m o l., 42, S 5 2-6 3 ( 1 9 9 7 ). 8 ) K r u p i n T., L i e b m a n n J. M., G r e e n f i e l d D. S., R i t c h R., G a r d i n e r S., A m. J. O p h t h a l m o l., 151, 6 7 1-6 8 1 ( 2 0 1 1 ). 9 ) 池田陽子, 森和彦, 石橋健, 足立和加子, 小林ルミ, 成瀬繁太, 南條由佳子, 木下茂, あたらしい眼科, 19, 7 7 9-7 8 1 ( 2 0 0 2 ). 1 0 ) B a t t e r b u r y M., H a r d i n g S. P., W o n g D., I n t. 40

O p h t h a l m o l., 16, 321-324 ( 1 9 9 2 ). 1 1 ) 中井義幸, 井上賢治, 森山涼, 若倉雅登, 井上治郎, 富田剛司, あたらしい眼科, 25, 1581-1 5 8 5 ( 2 0 0 8 ). 1 2 ) 北村正樹, 耳鼻咽喉科展望, 52, 323-325 ( 2 0 0 9 ). 1 3 ) G r i e r s o n I., J o n s s o n M., C r a c k n e l l K., J p n. J. O p h t h a l m o l., 48, 602-612 ( 2 0 0 4 ). 1 4 ) S a k a t a R., S h i r a t o S., M i y a t a K., A i h a r a M., E y e ( L o n d ), 28, 1 4 4 6-1 4 5 1 ( 2 0 1 4 ). 1 5 ) 結城賢弥, あたらしい眼科, 25, 148-150 ( 2 0 0 8 ). 1 6 ) 高橋現一郎, 山村重雄, あたらしい眼科, 25, 1 2 8 5-1289 ( 2 0 0 8 ). 1 7 ) O s b o r n e S. A., M o n t g o m e r y D. M., M o r r i s D., M c K a y I. C., E y e ( L o n d ), 19, 1 2 9-1 3 7 ( 2 0 0 5 ). 1 8 ) G o e l M., P i c c i a n i R. G., L e e R. K., B h a t t a c h a r y a S. K., O p e n O p h t h a l m o l. J., 4, 5 2-5 9 ( 2 0 1 0 ). 1 9 ) B i l l A., E x p. E y e R e s., 5, 4 5-5 4 ( 1 9 6 6 ). 2 0 ) P e d e r s o n J. E., G a a s t e r l a n d D. E., M a c L e l l a n H. M., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 16, 1008-1 0 1 7 ( 1 9 7 7 ). 2 1 ) 谷口徹, 眼科診療プラクティス, 4, 80-8 1 ( 2 0 0 1 ). 2 2 ) ( 参考論文 4 ) 金児佳生, M e d. S c i. D i g e s t, 42, 2 7 2-275 ( 2 0 1 6 ). 2 3 ) Q u i g l e y H. A., N. E n g l. J. M e d., 328, 1 0 9 7-1 1 0 6 ( 1 9 9 3 ). 2 4 ) S h i m o k a w a H., T a k e s h i t a A., A r t e r i o s c l e r. T h r o m b. V a s c. B i o l., 25, 1 7 6 7-1 7 7 5 ( 2 0 0 5 ). 41

25) I s h i z a k i T., M a e k a w a M., F u j i s a w a K., O k a w a K., I w a m a t s u A., F u j i t a A., W a t a n a b e N., S a i t o Y., K a k i z u k a A., M o r i i N., N a r u m i y a S., E M B O J., 15, 1885-1893 ( 1 9 9 6 ). 26) N a k a g a w a O., F u j i s a w a K., I s h i z a k i T., S a i t o Y., N a k a o K., N a r u m i y a S., F E B S L e t t., 392, 1 8 9-1 93 ( 1 9 9 6 ). 2 7 ) F u k i a g e C., M i z u t a n i K., K a w a m o t o Y., A z u m a M., S h e a r e r, T. R., B i o c h e m. B i o p h y s. R e s. C o m m u n., 288, 296-300 ( 2 0 0 1 ). 2 8 ) W a k i M., Y o s h i d a Y., O k a T., A z u m a M., C u r r. E y e R e s., 22, 4 7 0-4 7 4 ( 2 0 0 1 ). 2 9 ) T a m u r a M., N a k a o H., Y o s h i z a k i H., S h i r a t s u c h i M., S h i g y o H., Y a m a d a H., O z a w a T., T o t s u k a J., H i d a k a H., B i o c h i m. B i o p h y s. A c t a., 1 7 5 4, 245-2 5 2 ( 2 0 0 5 ). 3 0 ) Y o k o t a T., U t s u n o m i y a K., T a n i g u c h i K., G o j o A., K u r a t a H., T a j i m a N., J p n. J. O p h t h a l m o l., 51, 424-4 3 0 ( 2 0 0 7 ). 3 1 ) A r i t a R., H a t a Y., N a k a o S., K i t a T., M i u r a M., K a w a h a r a S., Z a n d i S., A l m u l k i L., T a y y a r i F., S h i m o k a w a H., H a f e z i - M o g h a d a m A., I s h i b a s h i T., D i a b e t e s, 58, 2 1 5-2 2 6 ( 2 0 0 9 ). 32) H o l l a n d e r s K., V a n B e r g e n T., K i n d t N., C a s t e r m a n s K., L e y s e n D., V a n d e w a l l e E., M o o n s L., S t a l m a n s I., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 56, 1335-1 3 4 8 ( 2 0 1 5 ). 42

3 3 ) Z a n d i S., N a k a o S., C h u n K. H., F i o r i n a P., S u n D., A r i t a R., Z h a o M., K i m E., S c h u e l l e r O., C a m p b e l l S., T a h e r M., M e l h o r n M. I., S c h e r i n g A., G a t t i F., T e z z a S., X i e F., V e r g a n i A., Y o s h i d a S., I s h i k a w a K., Y a m a g u c h i M., S a s a k i F., S c h m i d t - U l l r i c h R., H a t a Y., E n a i d a H., Y u z a w a M., Y o k o m i z o T., K i m Y. B., S w e e t n a m P., I s h i b a s h i T., H a f e z i - M o g h a d a m A., C e l l R e p., 10, 1 1 7 3-1 1 8 6 ( 2 0 1 5 ). 3 4 ) C h o H. J., Y o o J., C e l l B i o l. I n t., 31, 1 2 2 5-1230 ( 2 0 0 7 ). 3 5 ) O k u m u r a N., K o i z u m i N., U e n o M., S a k a m o t o Y., T a k a h a s h i H., H a m u r o J., K i n o s h i t a S., C o r n e a, 30, S 5 4-5 9 ( 2 0 1 1 ). 3 6 ) Z h e n g Y., B a n d o H., I k u n o Y., O s h i m a Y., S a w a M., O h j i M., T a n o Y., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 45, 668-674 ( 2 0 0 4 ). 3 7 ) G o m i N., O h g i y a T., S h i b u y a K., K a t s u y a m a J., M a s u m o t o M., S a k a i H., H e t e r o c y c l e s, 83, 1 1 7 1-1 1 8 1 ( 2 0 1 1 ). 3 8 ) G o m i N., K o u k e t s u A., O h g i y a T., S h i b u y a K., S y n t h e s i s, 44, 3 1 7 1-3 1 7 8 ( 2 0 1 2 ). 3 9 ) ( 参考論文 1 ) I s o b e T., M i z u n o K., K a n e k o Y., O h t a M., K o i d e T., T a n a b e S., C u r r. E y e R e s., 39, 813-822 ( 2 0 1 4 ). 4 0 ) ( 主論文 1 ) K a n e k o Y., O h t a M., I n o u e T., M i z u n o K., 43

I s o b e T., T a n a b e S., T a n i h a r a H., S c i. R e p., 6, 19640 ( 2 0 1 6 ). 4 1 ) Z a m o r a, D. O., K i e l, J. W., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 50, 2 9 4 9-2 9 5 2 ( 2 0 0 9 ). 4 2 ) H o n j o M., T a n i h a r a H., I n a t a n i M., K i d o N., S a w a m u r a T., Y u e B. Y., N a r u m i y a S., H o n d a Y., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 42, 137-1 4 4 ( 2 0 0 1 ). 4 3 ) H o n j o M., I n a t a n i M., K i d o N., S a w a m u r a T., Y u e B. Y., H o n d a Y., T a n i h a r a H., A r c h. O p h t h a l m o l., 1 1 9, 1 1 7 1-1 1 7 8 ( 2 0 0 1 ). 4 4 ) T o k u s h i g e H., I n a t a n i M., N e m o t o S., S a k a k i H., K a t a y a m a K., U e h a t a M., T a n i h a r a H., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 48, 3 2 1 6-3 2 2 2 ( 2 0 0 7 ). 4 5 ) V a n d e V e l d e S., V a n B e r g e n T., S i j n a v e D., H o l l a n d e r s K., C a s t e r m a n s K., D e f e r t O., L e y s e n D., V a n d e w a l l e E., M o o n s L., S t a l m a n s I., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 55, 1 0 0 6-1 0 1 6 ( 2 0 1 4 ). 4 6 ) A c o t t T. S., K e l l e y M. J., E x p. E y e R e s., 86, 543-561 ( 2 0 0 8 ). 4 7 ) R a o V. P., E p s t e i n D. L., B i o D r u g s, 21, 1 6 7-177 ( 2 0 0 7 ). 48) 石崎敏理, 日薬理誌, 121, 153-1 6 2 ( 2 0 0 3 ). 4 9 ) I t o h M., N a g a f u c h i A., M o r o i S., T s u k i t a S., J. C e l l B i o l., 138, 181-1 92 ( 1 9 9 7 ). 50) R a o P. V., D e n g P. F., K u m a r J., E p s t e i n D. L., 44

I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 42, 1029-1037 ( 2 0 0 1 ). 5 1 ) K a m e d a T., I n o u e T., I n a t a n i M., F u j i m o t o T., H o n j o M., K a s a o k a N., I n o u e - M o c h i t a M., Y o s h i m u r a N., T a n i h a r a H., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 53, 3 0 9 2-3 1 0 3 ( 2 0 1 2 ). 5 2 ) U n d e r w o o d J. L., A m. J. P h y s i o l., 2 7 7, C 3 3 0-342 ( 1 9 9 9 ). 5 3 ) ( 主論文 2 ) K a n e k o Y., O h t a M., I s o b e T., N a k a m u r a Y., M i z u n o K., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5 ( 2 0 1 7 ). 5 4 ) T a n i h a r a H., I n o u e T., Y a m a m o t o T., K u w a y a m a Y., A b e H., S u g a n a m i H., A r a i e M., J A M A O p h t h a l m o l., 133, 755-7 6 1 ( 2 0 1 5 ). 5 5 ) グラナテック 点眼薬 0.4% 医薬品インタビューフォーム 興和株式会社 5 6 ) M o n g P. Y., P e t r u l i o C., K a u f m a n H. L., W a n g Q., J. I m m u n o l., 1 8 0, 5 5 0-5 5 8 ( 2 0 0 8 ). 5 7 ) N a k a m u r a Y., H i r a n o S., S u z u k i K., S e k i K., S a g a r a T., N i s h i d a T., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 43, 3465-3472 ( 2 0 0 2 ). 5 8 ) T a k a i Y., T a n i t o M., O h i r a A., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 53, 2 4 1-2 4 7 ( 2 0 1 2 ). 5 9 ) O h i r a S., I n o u e T., I w a o K., T a k a h a s h i E., T a n i h a r a H., P L o S O n e, 11, e 0 1 4 7 0 8 0 ( 2 0 1 6 ). 60) A g a r w a l P., D a h e r A. M., A g a r w a l R., M o l. V i s., 21, 612-620 ( 2 0 1 5 ). 45

6 1 ) F u j i m o t o T., I n o u e T., K a m e d a T., K a s a o k a N., I n o u e - M o c h i t a M., T s u b o i N., T a n i h a r a H., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 53, 7 0 9 7-7 1 0 8 ( 2 0 1 2 ). 6 2 ) M i z u n o K., K o i d e T., S a i t o N., F u j i i M., N a g a h a r a M., T o m i d o k o r o A., T a m a k i Y., A r a i e M., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 43, 3 2 4 3-3 2 5 0 ( 2 0 0 2 ). 6 3 ) Y o s h i t o m i T., Y a m a j i K., I s h i k a w a H., O h n i s h i Y., E x p. E y e R e s., 75, 669-6 7 6 ( 2 0 0 2 ). 6 4 ) K a n n o M., A r a i e M., T o m i t a K., S a w a n o b o r i K., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 39, 736-7 4 3 ( 1 9 9 8 ). 6 5 ) K i d a T., S u g i y a m a T., H a r i n o S., K i t a n i s h i K., I k e d a T., C u r r. E y e R e s., 23, 128-1 3 2 ( 2 0 0 1 ). 6 6 ) G r u n w a l d J. E., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 32, 39-4 5 ( 1 9 9 1 ). 6 7 ) N a k a b a y a s h i S., K a w a i M., Y o s h i o k a T., S o n g Y. S., T a n i T., Y o s h i d a A., N a g a o k a T., E x p. E y e R e s., 139, 132-135 ( 2 0 1 5 ). 6 8 ) S u g i y a m a T., S h i b a t a M., K a j i u r a S., O k u n o T., T o n a r i M., O k u H., I k e d a T., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 52, 64-6 9 ( 2 0 1 1 ). 69) T o k u s h i g e H., W a k i M., T a k a y a m a Y., T a n i h a r a H., C u r r. E y e R e s., 36, 964-9 7 0 ( 2 0 1 1 ). 7 0 ) Y o l e s E., W h e e l e r L. A., S c h w a r t z M., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 40, 6 5-7 3 ( 1 9 9 9 ). 7 1 ) Y a m a m o t o K., M a r u y a m a K., H i m o r i N., O m o d a k a K., 46

Y o k o y a m a Y., S h i g a Y., M o r i n R., N a k a z a w a T., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 55, 7126-7 1 3 6 ( 2 0 1 4 ). 7 2 ) H i r a t a A., I n a t a n i M., I n o m a t a Y., Y o n e m u r a N., K a w a j i T., H o n j o M., T a n i h a r a H., G r a e f e s. A r c h. C l i n. E x p. O p h t h a l m o l., 2 4 6, 5 1-5 9 ( 2 0 0 8 ). 7 3 ) T u r a A., S c h u e t t a u f F., M o n n i e r P. P., B a r t z - S c h m i d t K. U., H e n k e - F a h l e S., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 50, 452-461 ( 2 0 0 9 ). 7 4 ) K i t a o k a Y., K i t a o k a Y., K u m a i T., L a m T. T., K u r i b a y a s h i K., I s e n o u m i K., M u n e m a s a Y., M o t o k i M., K o b a y a s h i S., U e n o S., B r a i n R e s., 1 0 1 8, 1 1 1-1 1 8 ( 2 0 0 4 ). 7 5 ) ( 参考論文 2 ) O m i c h i K., W a t o E., K a n e k o Y., Y o n e y a m a S., M a t s u d a A., S a s a k i M., B u l l A., C o l e m a n D., K a g a w a M., A m a n o Y., F u n d a m. T o x i c o l. S c i., 1, 19-2 7 ( 2 0 1 4 ). 7 6 ) ( 参考論文 3 ) I s o b e T., O h t a M., K a n e k o Y., K a w a i H., X e n o b i o t i c a, 46, 579-590 ( 2 0 1 6 ). 7 7 ) I s o b e T., K a s a i T., K a w a i H., J. O c u l. P h a r m a c o l. T h e r., 32, 405-4 1 4 ( 2 0 1 6 ). 7 8 ) T a n i h a r a H., I n o u e T., Y a m a m o t o T., K u w a y a m a Y., A b e H., A r a i e M., J A M A O p h t h a l m o l., 1 3 1, 1 2 8 8-1 2 9 5 ( 2 0 1 3 ). 79) T a n i h a r a H., I n o u e T., Y a m a m o t o T., K u w a y a m a Y., A b e H., A r a i e M., A m. J. O p h t h a l m o l., 1 5 6, 7 3 1-7 3 6 47

( 2 0 1 3 ). 8 0 ) T a n i h a r a H., I n o u e T., Y a m a m o t o T., K u w a y a m a Y., A b e H., S u g a n a m i H., A r a i e M., A c t a. O p h t h a l m o l., 93, e 2 5 4-2 6 0 ( 2 0 1 5 ). 8 1 ) T a n i h a r a H., I n o u e T., Y a m a m o t o T., K u w a y a m a Y., A b e H., F u k u s h i m a A., S u g a n a m i H., A r a i e M., A c t a. O p h t h a l m o l., 94, e 2 6-3 4 ( 2 0 1 6 ). 8 2 ) ( 参考論文 5 ) Y a m a g u c h i M., N a k a o S., A r i t a R., K a i z u Y., A r i m a M., Z h o u Y., K i t a T., Y o s h i d a S., K i m u r a K., I s o b e T., K a n e k o Y., S o n o d a K. H., I s h i b a s h i T., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 57, 2264-2 2 7 6 ( 2 0 1 6 ). 8 3 ) O k u m u r a N., O k a z a k i Y., I n o u e R., K a k u t a n i K., N a k a n o S., K i n o s h i t a S., K o i z u m i N., I n v e s t. O p h t h a l m o l. V i s. S c i., 57, 1 2 8 4-1292 ( 2 0 1 6 ). 8 4 ) F u t a k u c h i A., I n o u e T., F u j i m o t o T., I n o u e - M o c h i t a M., K a w a i M., T a n i h a r a H., E x p. E y e R e s., 1 4 9, 1 0 7-1 1 5 ( 2 0 1 6 ). 48

T a b l e 1 現在使用されている緑内障治療薬 薬物分類 PG 関連薬 β 遮断薬 薬物名 ラタノプロスト ビマトプロスト トラボプロスト タフルプロスト ウノプロストン チモロール カルテオロール レボブノロール ベタキソロール 炭酸脱水酵素阻害薬 ブリンゾラミド ドルゾラミド α 2 刺激薬 ブリモニジン α 1 遮断薬 ブナゾシン αβ 遮断薬 ニプラジロール 交感神経刺激薬 ジピベフリン 副交感神経刺激薬 ピロカルピン 49

T a b l e 2 主な緑内障治療薬の副作用 薬物分類主な副作用 ( 眼アレルギーを除く ) PG 関連薬 上眼瞼溝深化 (DUES) 睫毛多毛 色素沈着 黄斑浮腫 β 遮断薬 徐脈 血圧低下 気管支収縮 全身性エリテマトーデス 炭酸脱水酵素阻害薬 刺激感 角膜浮腫 α 2 刺激薬 点状角膜炎 皮膚感作性 徐脈 血圧低下 α 1 遮断薬 結膜充血 αβ 遮断薬 徐脈 血圧低下 気管支収縮 交感神経刺激薬 散瞳及び調節麻痺 眼類天疱瘡 副交感神経刺激薬 縮瞳及び調節麻痺 眼類天疱瘡 50

T a b l e 3 主な緑内障治療薬の禁忌 慎重投与 ならびに薬物相 互作用 薬物分類禁忌 ( 過敏症を除く ) 慎重投与薬物相互作用 PG 関連薬 - 無水晶体眼眼内レンズ挿入眼気管支喘息 - 眼内炎 ( 虹彩炎 ぶどう膜炎 ) ヘルペスウイルス β 遮断薬 αβ 遮断薬 気管支喘息気管支痙攣慢性閉塞性肺疾患心不全洞性徐脈房室ブロック心原性ショック 肺高血圧による右心不全うっ血性心不全糖尿病ケトアシドーシス代謝性アシドーシス 交感神経刺激薬カテコールアミン枯渇薬カルシウム拮抗薬ジギタリス製剤 炭酸脱水酵素阻害薬 腎障害 肝障害角膜障害眼内手術 ( 角膜内皮細胞減少 ) アスピリン α 2 刺激薬 低出生体重児 2 歳未満 脳血管障害起立性低血圧心血管系疾患 降圧薬中枢神経抑制薬 MAO 阻害薬 α 1 遮断薬 - - - 交感神経刺激薬 狭隅角 高血圧症動脈硬化症冠不全又は心不全糖尿病甲状腺機能亢進症 チモロール MAO 阻害薬三環系及び四環系抗うつ薬全身麻酔薬 副交感神経刺激薬 虹彩炎 気管支喘息網膜剥離 ( 危険性を含む ) - 51

T a b l e 4 リパスジルの R O C K およびセリンスレオニンキナーゼ 阻害作用 ROCK-1 ROCK-2 PKACα PKC CaMK2α Ripasudil 0.051 (0.041-0.064) 0.019 (0.017-0.021) 2.1 (1.9-2.4) 27 (23-33) 0.37 (0.30-0.47) Y-27632 0.11 (0.088-0.15) 0.17 (0.10-0.28) 50 (38-70) 32 (25-43) 8.1 (3.9-19) Fasudil 0.29 (0.24-0.34) 0.35 (0.21-0.62) 1.1 (0.99-1.3) 17 (14-22) 2.9 (1.3-6.4) 各値は IC 50 値 (95% 信頼区間 )[ μ M] を示す ( I s o b e T. e t a l., C u r r. E y e R e s., 39, 8 1 3-822, 2014: 参考論文 1 ) 52

T a b l e 5 リパスジルの房水動態に対する作用 Outflow facility (C: μl/min/mmhg) Uveoscleral outflow (Fu: μl/min) Aqueous flow rate (f(t): μl/min) Vehicle 0.086 ± 0.021 0.134 ± 0.026 1.54 ± 0.23 Ripasudil 0.193 ± 0.038 0.155 ± 0.023 1.88 ± 0.35 正常眼圧白色ウサギに 0. 4 % リパスジルを単回点眼した際の結果 を示す 房水流出率 ( O u t f l o w f a c i l i t y : C ) は t w o - l e v e l c o n s t a n t p r e s s u r e 法 ぶどう膜強膜流量 (U v e o s c l e r a l o u t f l o w : Fu) は F I T C - d e x t r a n 灌流法 房水産生量 ( A q u e o u s f l o w r a t e : f ( t ) ) はフルオロフォトメトリー法で評価した 各値は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. v e h i c l e ( S t u d e n t s t - t e s t ) ( I s o b e T. e t a l., C u r r. E y e R e s., 39, 8 1 3-822, 2014: 参考論文 1 K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 53

T a b l e 6 緑内障治療薬とリパスジルを併用した際の眼圧下降作 用 リパスジルとの併用薬作用機序リパスジルの併用効果 β 遮断薬炭酸脱水酵素阻害薬 (CAI) β 遮断薬 CAI 配合剤 房水産生抑制 PG 関連薬 副流出路促進 眼圧下降作用の増強 作用時間の延長 α 2 刺激薬 αβ 遮断薬 PG 関連薬 β 遮断薬配合剤 副流出路促進および房水産生抑制 ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 54

前房 角膜 主流出路 (80-90%) 線維柱帯 シュレム管 虹彩 強膜 毛様体 ぶどう膜 副流出路 (10-20%) 水晶体 房水産生 F i g u r e 1 眼房水の眼内動態 55

前房 角膜 主流出路 交感神経または副交感神経刺激薬 線維柱帯 シュレム管 水晶体 虹彩 毛様体 強膜 ぶどう膜 房水産生 β 遮断薬 炭酸脱水酵素阻害薬 副流出路 PG 関連薬 α 1 遮断薬 α 2 刺激薬 αβ 遮断薬 F i g u r e 2 緑内障治療薬の作用機序 56

線維柱帯 - シュレム管の構造 線維柱帯 傍シュレム管結合組織 シュレム管 シュレム管 傍シュレム管結合組織 緑内障眼の病態 シュレム管内皮細胞細胞外マトリクス線維柱帯細胞 細胞構造変化収縮 凝集 ECM 増加 F i g u r e 3 線維柱帯 - シュレム管の構造と緑内障における病態 57

和名 : リパスジル塩酸塩水和物英名 : Ripasudil Hydrochloride Hydrate 別名 : K-115 CAS: 887375-67-9 一般名 : 4-Fluoro-5-{[(2S)-2-methyl-1,4-diazepan-1-yl]sulfonyl} isoquinoline monohydrochloride dihydrate 分子式 : C 15 H 18 FN 3 O 2 S HCl 2H 2 O(C 15 H 23 ClFN 3 O 4 S) 分子量 : 395.88 F i g u r e 4 リパスジルの化学構造 58

IOP (mmhg) 25 20 15 10 0 1 2 3 4 5 Time after instillation (h) Vehicle 0.0625% Ripasudil 0.125% Ripasudil 0.25% Ripasudil 0.5% Ripasudil F i g u r e 5 リパスジルの正常眼圧白色ウサギに対する眼圧下降作 用正常眼圧 JW 系白色ウサギを用い 基剤またはリパスジルを片眼 に 50 μ L 単回点眼した際の眼圧推移を示す 各値は 10 例の平均 値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5, P < 0. 0 1 v s. 点眼前 (0 時間 ) ( D u n n e t t s t e s t ) ( I s o b e T. e t a l., C u r r. E y e R e s., 39, 8 1 3-822, 2014: 参考論文 1 ) 59

IOP (mmhg) 21 20 19 18 17 16 15 14 0 2 4 6 8 Time after instillation (h) 0.1% Ripasudil 0.2% Ripasudil 0.4% Ripasudil F i g u r e 6 リパスジルの正常眼圧サルに対する眼圧下降作用正常眼圧カニクイザルを用い 基剤またはリパスジルを片眼に 20 μ L 単回点眼した際の眼圧推移を示す 各値は 8 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5, P < 0. 0 1 v s. 点眼前 ( 0 時間 ) ( D u n n e t t s t e s t ) ( I s o b e T. e t a l., C u r r. E y e R e s., 39, 813-822, 2014: 参考論文 1 ) 60

IOP (mmhg) 25 20 15 10 0 1 2 3 4 5 Time after instillation (h) 0.4% Ripasudil 0.5% Timolol 0.01% Bunazosin F i g u r e 7 正常眼圧白色ウサギを用いたリパスジルと緑内障治療 薬の眼圧下降作用の比較正常眼圧 JW 系白色ウサギを用い 0.4% リパスジル 0.5% チモロールまたは 0. 0 1 % ブナゾシンを片眼に 50 μ L 単回点眼した際の眼圧推移を示す 各値は 9 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5, P < 0. 0 1 v s. 点眼前 (0 時間 )( D u n n e t t s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2016: 主論文 1 ) 61

IOP (mmhg) 23 22 21 20 19 18 17 16 0 2 4 6 8 Time after instillation (h) 0.4% Ripasudil 0.5% Timolol 0.005% Latanoprost F i g u r e 8 正常眼圧サルを用いたリパスジルと緑内障治療薬の眼 圧下降作用の比較正常眼圧カニクイザルを用い 0.4% リパスジル 0.5% チモロールまたは 0. 0 0 5 % ラタノプロストを片眼に 20 μ L 単回点眼した際の眼圧推移を示す 各値は 5-6 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 1 v s. 点眼前 ( 0 時間 )( D u n n e t t s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 62

IOP (mmhg) 30 25 20 15 10 0 1 2 3 4 5 Time after instillation (h) 0.4% Ripasudil 0.4% Y-27632 0.4% Fasudil F i g u r e 9 正常眼圧白色ウサギを用いた R O C K 阻害薬の眼圧下 降作用 正常眼圧 JW 系白色ウサギを用い 0.4% のリパスジル Y - 27632 またはファスジルを片眼に 50 μ L 単回点眼した際の眼 圧推移を示す 各値は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5, P < 0. 0 1 v s. 点眼前 ( 0 時間 )( D u n n e t t s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 63

F i g u r e 10 リパスジルによる線維柱帯細胞における形態変化サル線維柱帯細胞に c o n t r o l ( P B S ) または 10 μ M のリパスジルを 60 分間作用させた際の細胞形態を示す 赤矢印は r e t r a c t i o n 青矢印は r o u n d i n g が認められている部位を示す ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 64

F i g u r e 1 1 リパスジルおよび R O C K 阻害薬による線維柱帯細胞 における形態変化サル線維柱帯細胞に c o n t r o l ( P B S ) 1 μ M もしくは 10 μ M リ パスジル 10 μ M Y - 27632 または 10 μ M ファスジルを 60 分 間作用させた際の細胞形態を示す ( A ) また 薬物を 60 分間作 用させたのち 薬物を含まない培地に交換した 2 時間後の細胞形 態を示す ( B ) 赤矢印は r e t r a c t i o n 青矢印は r o u n d i n g が認め られている部位を示す ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 65

F i g u r e 1 2 リパスジルおよび R O C K 阻害薬による線維柱帯細胞 における F - a c t i n への影響サル線維柱帯細胞に c o n t r o l ( P B S ) 1 μ M もしくは 10 μ M リパスジル 10 μ M Y - 27632 または 10 μ M ファスジルを 30 分間 ( A ) および 60 分間 ( B ) 作用させた際の F - a c t i n ( P h a l l o i d i n - T R I T C 染色 : 赤 ) および細胞核 ( D A P I : 青 ) を示す また 薬物を 60 分間作用させたのち 薬物を含まない培地に交換した 2 時間後の細胞形態を示す ( C ) ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 66

Control Control TEER (Ωcm 2 ) A 30min B 60min 160 160 150 140 130 150 140 130 120 120 110 110 100 1 5 25 1 5 25 1 5 25 100 1 5 25 1 5 25 1 5 25 Ripasudil Y-27632 Fasudil Ripasudil Y-27632 Fasudil (μm) F i g u r e 1 3 サル シュレム管内皮細胞膜電気抵抗値に対するリ パスジルの作用サル 初代培養シュレム管内皮細胞に c o n t r o l ( P B S ) 1 μ M 5 μ M もしくは 2 5 μ M のリパスジル Y - 27632 またはファスジルを 30 分間 (A ) および 60 分間 (B) 作用させた際の 膜電気抵抗値 (T r a n s e n d o t h e l i a l E l e c t r o n R e s i s t a n c e : TEER) を示す 各値は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5, P < 0. 0 1 v s. c o n t r o l ( D u n n e t t s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 67

Control Fluorescence (490nm/530nm) 200 150 100 50 0 1 5 25 1 5 25 1 5 25 Ripasudil Y-27632 Fasudil (μm) F i g u r e 1 4 サル シュレム管内皮細胞膜透過性に対するリパス ジルの作用サル 初代培養シュレム管内皮細胞に c o n t r o l ( P B S ) 1 μ M 5 μ M もしくは 2 5 μ M のリパスジル Y - 27632 またはファスジルを 60 分間作用させた際の インサートウェルへ移行した平均分子量 4, 000 の F I T C - d e x t r a n の蛍光強度 (F l u o r e s c e n c e ) を示す 各値は 6 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5, P < 0. 0 1 v s. c o n t r o l ( D u n n e t t s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 68

F i g u r e 1 5 サル シュレム管内皮細胞の ZO- 1 発現に対するリパスジルの作用サル 初代培養シュレム管内皮細胞に c o n t r o l ( P B S )( A ) 1 μ M ( B ) 5 μ M ( C ) もしくは 25 μ M ( D ) のリパスジル 5 μ M ( E ) もしくは 25 μ M ( F ) の Y - 27632 または 5 μ M ( G ) もしくは 25 μ M ( H ) のファスジルを 60 分間作用させた際の ZO-1 抗体 (2 次抗体 ;A l e x a F l u o r o 4 8 8 : 緑 ) および細胞核 ( D A P I : 青 ) を示す ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 69

F i g u r e 1 6 サル シュレム管内皮細胞の C a d h e r i n 発現に対するリパスジルの作用サル 初代培養シュレム管内皮細胞に c o n t r o l ( P B S )( A ) 1 μ M ( B ) 5 μ M ( C ) もしくは 25 μ M ( D ) のリパスジル 5 μ M ( E ) もしくは 25 μ M ( F ) の Y - 27632 または 5 μ M ( G ) もしくは 25 μ M ( H ) のファスジルを 60 分間作用させた際の P a n - C a d h e r i n 抗体 (2 次抗体 ;A l e x a F l u o r o 4 8 8 : 緑 ) および細胞核 (D A P I : 青 ) を示す ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 70

F i g u r e 1 7 サル シュレム管内皮細胞の β - C a t e n i n 発現に対す るリパスジルの作用サル 初代培養シュレム管内皮細胞に c o n t r o l ( P B S )( A ) 1 μ M ( B ) 5 μ M ( C ) もしくは 25 μ M ( D ) のリパスジル 5 μ M ( E ) もしくは 25 μ M ( F ) の Y - 27632 または 5 μ M ( G ) もしくは 25 μ M ( H ) のファスジルを 60 分間作用させた際の β - C a t e n i n 抗体 (2 次抗体 ;A l e x a F l u o r o 4 8 8 : 緑 ) および細胞核 (D A P I : 青 ) を示す ( K a n e k o Y. e t a l., S c i. R e p., 6, 1 9 6 4 0, 2 0 1 6 : 主論文 1 ) 71

前房 水晶体 主流出路促進リパスジル (ROCK 阻害薬 ) 虹彩 角膜 房水産生抑制 β 遮断薬 炭酸脱水酵素阻害薬 副流出路促進 PG 関連薬 α 1 遮断薬 α 2 刺激薬 αβ 遮断薬 F i g u r e 1 8 リパスジルと緑内障治療薬の作用機序 72

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 2 0 1 2 3 4 5 0-2 -4-6 -8 F i g u r e 1 9 リパスジルとチモロールの併用効果正常眼圧 JW 系白色ウサギに 0. 4 % リパスジルおよび 0. 5 % チモロールを片眼に単独 または併用点眼した際の眼圧推移を示す は基剤 はリパスジル はチモロール は併用を示す 各値は 9 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. 基剤 P < 0. 0 5 v s. チモロール ( T u k e y s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 73

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 4 0 1 2 3 4 5 0-4 -8-12 F i g u r e 2 0 リパスジルとブリンゾラミドの併用効果正常眼圧 JW 系白色ウサギに 0. 4 % リパスジルおよび 1 % ブリンゾラミドを片眼に単独 または併用点眼した際の眼圧推移を示す は基剤 はリパスジル はブリンゾラミド は併用を示す 各値は 10 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. 基剤 P < 0. 0 5 v s. ブリンゾラミド P < 0. 0 5 v s. リパスジル ( T u k e y s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 74

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 4 0 1 2 3 4 5 0-4 -8-12 -16 F i g u r e 2 1 リパスジルとブリモニジンの併用効果正常眼圧 JW 系白色ウサギに 0. 4 % リパスジルおよび 0. 1 % ブリモニジンを片眼に単独 または併用点眼した際の眼圧推移を示す は基剤 はリパスジル はブリモニジン は併用を示す 各値は 10 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. 基剤 P < 0. 0 5 v s. ブリモニジン P < 0. 0 5 v s. リパスジル ( T u k e y s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 75

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 4 0 1 2 3 4 5 0-4 -8-12 F i g u r e 2 2 リパスジルとニプラジロールの併用効果正常眼圧 JW 系白色ウサギに 0. 4 % リパスジルおよび 0. 2 5 % ニプラジロールを片眼に単独 または併用点眼した際の眼圧推移を示す は基剤 はリパスジル はニプラジロール は併用を示す 各値は 10 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. 基剤 (T u k e y s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7079645, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 76

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 1 0 1 2 3 4 5 6 0-1 -2-3 -4-5 -6-7 F i g u r e 2 3 リパスジルとラタノプロストの併用効果正常眼圧カニクイザルに 0. 4 % リパスジルおよび 0. 0 0 5 % ラタノプロストを片眼に単独 または併用点眼した際の眼圧推移を示す はリパスジル はラタノプロスト は併用を示す 各値は 4 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. ラタノプロスト P < 0. 0 5 v s. リパスジル ( T u k e y s t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7079645, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 77

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8-1 -2-3 -4-5 -6-7 F i g u r e 2 4 リパスジルとラタノプロスト チモロール配合剤の 併用効果 正常眼圧カニクイザルに 0. 0 0 5 % ラタノプロスト 0. 5 % チモロ ール配合剤を片眼に単独 または 0. 4 % リパスジルを併用点眼した際の眼圧推移を示す はラタノプロスト チモロール配合剤 はリパスジルとラタノプロスト チモロール配合剤の併用を示す 各値は 5 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. ラタノプロスト チモロール配合剤 (S t u d e n t s t - t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 78

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8-1 -2-3 -4-5 -6-7 F i g u r e 2 5 リパスジルとドルゾラミド チモロール配合剤の併 用効果 正常眼圧カニクイザルに 1 % ドルゾラミド 0. 5 % チモロール配 合剤を片眼に単独 または 0. 4 % リパスジルを併用点眼した際の 眼圧推移を示す はドルゾラミド チモロール配合剤 はリパスジルとドルゾラミド チモロール配合剤の併用を示す 各値は 5 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. ドルゾラミド チモロール配合剤 (S t u d e n t s t - t e s t ) ( K a n e k o Y. e t a l., J. O p h t h a l m o l., 7 0 7 9 6 4 5, 2 0 1 7 : 主論文 2 ) 79

IOP (mmhg) Time after instillation (h) 5 0 1 2 3 4 5 0-5 -10 F i g u r e 2 6 ウサギ C V P 誘発高眼圧モデルに対するリパスジルの効果 JW 系白色ウサギの前房内に 2 % カルボキシメチルポリマー ( C V P ) を投与して誘発した高眼圧モデルに 0. 4 % リパスジル を片眼に 50 μ L 単回点眼した際の眼圧推移を示す は基剤 はリパスジルを示す 各値は 10 例の平均値 ± 標準誤差を示す P < 0. 0 5 v s. 基剤 ( S t u d e n t s t - t e s t ) ( グラナテック 点眼薬 0. 4 % 医薬品インタビューフォーム ) 80

タイトジャンクションを介した透過性亢進 巨大空胞 シュレム管 シュレム管内皮細胞 細胞形態変化 ECM 減少 線維柱帯細胞 F i g u r e 2 7 主流出路に対する R O C K 阻害薬の効果 81