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えつみあさま
5 years ago
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1 AJACS 東女医大次世代シーケンスデータを用いたオミクス解析国立がん研究センター先端医療開発センターゲノムトランスレーショナルリサーチ分野鈴木絢子

2 本日の予定 Session 1 シークエンスデータのマッピングと可視化およびツールの紹介 Session 2 データベース新規技術の紹介

3 国立遺伝研究所スーパーコンピュータシステム本講習会のためにアカウントをご用意いただきました

4 スパコンのアカウントユーザ名 : lect01 ~ lect55 パスワード : **** 一人一人にアカウントを割り当てられていますご確認くださいパスワードは変更しないでください作業は自分のホームディレクトリ以下で行ってください

5 本日用いるソフトウェアの準備ターミナルソフト TeraTerm Windows PC から Linux 環境のマシンへアクセスするのに必要 Mac はターミナルでリモートアクセスできますその他ターミナルソフトをお持ちの方はお好きなものをお使いいただいてかまいませんインストールは基本的にデフォルトの設定で問題ありませんファイル転送ソフト WinSCP Windows PC Linux 環境のデータのやり取りに必要 Mac はターミナルでデータのアップロード / ダウンロードできます Cygwin インストール済みの方は不要ですゲノムビューワー IGV (Integrative Genomics Viewer) リファレンスゲノム上にアライメントされたシークエンスタグを可視化するツール起動するか確認してください起動しない方はお知らせください

6 PC からスパコンへログイン Windows Tera Term を使う Mac ターミナルを使う Mac PC: アプリケーションユーティリティターミナル

7 Windows PC から解析サーバへのログイン 1 TeraTerm を開きます接続先の設定画面にてホストのボックスに IP アドレス gw.ddbj.nig.ac.jp を入力し OK をクリックします

8 Windows PC から解析サーバへのログイン 2 ユーザ名とパスワードを入力しますユーザ名 : lect01 ~ lect55 パスワード : ****** 自分のユーザ名 (lect01 ~ lect55) を入れてください OK を押します正しくログインできると [lect01@gw ~]$ と表示されます Mac の方も Windows の方も次にゲートウェイノードからログインノードにログインします [lect01@gw ~]$ qlogin Enter キーを押すとパスワードを要求されるのでパスワードを打ってログインします

9 ディレクトリ構造 / ルートディレクトリ bin etc root home media ls cp readme.txt jishu lect01 news.txt lect02 jishu lect03 ホームディレクトリ MAPPING.sh LC2ad.fq MAPPING.sh LC2ad.fq ルートディレクトリ : ツリー構造のトップとなるディレクトリホームディレクトリ : 各ユーザがログインしたときの最初のディレクトリ (/home/[user ID]) カレントディレクトリ : 現在作業しているディレクトリ

10 ディレクトリ関係の基本コマンド cd: 指定のディレクトリに移動するディレクトリ A に移動する場合 $ cd A cd のみ入力した場合はホームディレクトリへ移動する cd.. と入力した場合は一つ上のディレクトリに移動する pwd: 現在のディレクトリを表示する $ pwd ls: 指定のディレクトリ内のディレクトリファイルを表示するディレクトリ A のファイルを表示する $ ls A ls のみを入力した場合はカレントディレクトリのファイルが表示される -l オプションをつけると詳細表示になり -t オプションをつけると更新日時でソートされる実習実際にコマンドを入力しましょう $ pwd $ ls $ cp -r /home/lect01/jishu. $ ls $ cd jishu $ pwd $ ls $ ls -lt $ cd $ pwd

11 ファイル内容を表示するコマンド cat: ファイルの全内容を表示する $ cat a.txt 一度に全部表示されるため大きいサイズのファイルには不向き head, tail: ファイルの先頭末端を表示 ( デフォルトでは 10 行 ) $ head a.txt $ tail a.txt 100 行表示したい場合は -n オプションを付ける $ head -n 100 a.txt more, less: ファイルの内容をコマ送りで表示する $ more a.txt $ less a.txt Enter もしくは space キーで進む less コマンドはキーでファイルを自由に見ることができる q と打つと more, less コマンドを途中で中断できる実習実際にコマンドを入力しましょう $ cat /home/lect01/readme.txt $ cat /home/lect01/news.txt $ head /home/lect01/news.txt $ tail /home/lect01/news.txt $ more /home/lect01/news.txt $ less /home/lect01/news.txt

12 ファイルディレクトリの作成移動削除コマンド cp: ファイルの複製ファイル a.txt をカレントディレクトリにコピーする場合 $ cp a.txt. ファイル a.txt をディレクトリ A の中にコピーする場合 $ cp a.txt A mkdir: 新規にディレクトリを作成するディレクトリ A を作成する $ mkdir A mv: ファイルの移動ファイル a.txt をディレクトリ A に移動する $ mv a.txt A rm: ファイルを削除するファイル a.txt を削除する $ rm a.txt ディレクトリを削除するときは -r オプションを付ける $ rm -r A 一度データを削除すると復元することはできません実習実際にコマンドを入力しましょう $ cd $ cp /home/lect01/readme.txt. $ ls -lt $ mkdir work $ ls -lt $ mv readme.txt work $ ls -lt $ cd work $ pwd $ ls -lt $ rm readme.txt $ ls -lt $ cd.. $ pwd $ ls -lt $ rm -r work $ ls -lt

13 ディレクトリ /home/lect-1 にある readme.txt をカレントディレクトリ ( ホームディレクトリ ) にコピーディレクトリ work を作成し readme.txt をディレクトリ work に移動ディレクトリ work に移動するディレクトリ work に移動させた readme.txt を削除一つ上のディレクトリ ( ホームディレクトリ ) に戻るディレクトリ work を削除

14 解析データの Windows PC へのダウンロード WinSCP を開き以下の情報を入力しますホスト名 :gw.ddbj.nig.ac.jp ユーザ名 : lect01 ~ lect55 パスワード : **** Mac の方は WinSCP は使用しません

15 解析データの Windows PC へのダウンロード Linux から Windows PC へのデータコピー下図のようなウィンドウが表示されます左側が Windows PC 右側が解析サーバ (Linux) です後で使用しますファイルあるいはフォルダをクリックしドラッグ & ドロップを実行するとデータコピーが始まります Windows スパコン

16 シークエンス可視化 Integrative Genomics Viewer(IGV) シークエンスデータの可視化に使用します IGV を起動してみてください Human hg19 を選択してくださいあとで使用しますのでうまく起動しない方や Human hg19 がない方がいましたらお知らせください

17 Session 1 シークエンスデータのマッピングと可視化およびツールの紹介

18 課題 1 新しくログインしてホームディレクトリに入り $ qlogin $ pwd $ cd jishu $ ls ログインノードに入る ( サーバによって異なる ) ディレクトリ jishu に移動してファイルを確認 $ qsub -l s_vmem=8g -l mem_req=8g -l short MAPPING.sh short.q を指定と打ってください MAPPING.sh の中にはマッピングのコマンドが記載してありますあとで説明いたします 8G のメモリを要求して MAPPING.sh を計算ノードで実行する

19 ジョブの確認と削除状況確認 $ qstat 削除 $ qdel [job-id] 詳しくは遺伝研スパコンの基本的利用方法のページへ

次世代シークエンサー Illumina MiSeq / HiSeq シリーズリード長 : 短鎖主たる用途 : ゲノムシークエンシング, エキソームシークエンシング, トランスクリプトームシークエンシング Ion PGM / Ion Proton デスクトップ型シークエンサーリード長 : 短鎖主たる用途 : アンプリコンシークエンシング, エキソームシークエンシング HiSeq2500/3000

20 次世代シークエンサー Illumina MiSeq / HiSeq シリーズリード長 : 短鎖主たる用途 : ゲノムシークエンシング, エキソームシークエンシング, トランスクリプトームシークエンシング Ion PGM / Ion Proton デスクトップ型シークエンサーリード長 : 短鎖主たる用途 : アンプリコンシークエンシング, エキソームシークエンシング HiSeq2500/3000 ( 東大新領域鈴木穣研 ) PacBio RS II/Sequel 1 分子リアルタイムシークエンサーリード長 : 最長 >20 kb の長鎖リード主たる用途 :De novo アセンブル, 細菌ゲノムのシークエンシング, 構造多型の解析 ONT MinION / PromethION ナノポアシークエンサーリード長 : 短鎖 ~ 数 kb の長鎖主たる用途 :DNA RNA シークエンシング MinION ( 国立がん研究センター EPOC) 参考次世代シークエンサー医学のあゆみ医学医療のいまがわかるキーワード 2014, 医歯薬出版株式会社

21 用途も様々 Whole-genome/exome sequencing DNA 配列を解読し SNP/SNVs や indel 等を同定する RNA-Seq small RNA-Seq mrna や small RNA をシークエンスし発現量の計算や新規転写産物の同定を行う ChIP-Seq ヒストン修飾や転写因子の結合部位を同定する Bisulfite sequencing DNA のメチル化のパターンを検出する TSS-Seq 転写開始点を同定する ATAC-Seq オープンクロマチン領域を同定するなど

22 fastq ファイル ( シークエンスファイル ) Quality 悪 Quality 良参照 :

fq less コマンドは q で終了します wc コマンドでシークエンスのリード数を数えてみましょう実習実際にコマンドを入力しましょう $ wc

23 fastq ファイル ( シークエンスファイル ) シークエンスファイルを見てみましょう新しく TeraTerm を立ち上げてログインしてください実習実際にコマンドを入力しましょう $ cd jishu $ less PC-9_1.fq $ less PC-9_2.fq less コマンドは q で終了します wc コマンドでシークエンスのリード数を数えてみましょう実習実際にコマンドを入力しましょう $ wc PC-9_1.fq 行数単語数バイト数行ありました fastq ファイルは 4 行で 1 リード分なのでこのファイルにはリード入っていることになります

24 課題 2 実際に今回使ったシークエンスファイル (fastq ファイル ) の中身をみてみましょう実習実際にコマンドを入力しましょう $ cd jishu $ ls -lt $ less LC2ad.fq 課題 3 fastqファイルは 4 行で 1リード分ということでしたがこの LC2ad.fq のファイル中には何本のリードがあるか数えてみましょう実習実際にコマンドを入力しましょう $ wc LC2ad.fq

25 シークエンスをヒトゲノムにマッピング見てもらったfastqデータは先ほどの課題 1でヒトの参照ゲノム配列に対してマッピングを実行中です. 実習実際にコマンドを入力しましょう投げたjobの中身をみてみましょう! $ less MAPPING.sh おまじない ( BWA というソフトウェアでマッピング bwa aln アライメント bwa samse SAM ファイル作成 SAMtools というソフトウェアで SAM ファイルを BAM ファイルにする

26 Mapping software もさまざま ELAND Illumina 社のソフトウェア $ bwa BWA indel のマッピングに強くゲノムエキソーム解析に適している Bowtie 少ないメモリで高速にマッピングする (indel に弱い ) $ bowtie TopHat スプライスを考慮してマッピングする RNA-Seq に適しているなど $ tophat

27 参照ゲノム配列 Human, mouse などの主なモデル生物のリファレンスゲノムや遺伝子モデル等のアノテーションデータは UCSC や NCBI より取得できます今回参照ゲノム配列として用いたのは UCSC hg19 です

28 先ほどの課題 1 のマッピングはおわりましたでしょうか?? 下記の出力ファイルが出てきているか確認してください実習実際にコマンドを入力しましょう $ ls -lt 出力データ LC2ad.fq Raw データ ( シークエンスタグ ) LC2ad.sai LC2ad.sam LC2ad.bam LC2ad_sort.bam LC2ad_sort.bam.bai MAPPING.sh.eXXXXXXX MAPPING.sh.oXXXXXXX マッピング結果 job のログファイル

29 SAM (BAM) 形式データ SAM ファイルの中身を眺めてみましょう実習実際にコマンドを入力しましょう $ less LC2ad.sam $ samtools view LC2ad.bam more

30 データ可視化

31 課題 4 マッピングしたデータを可視化ツール (IGV) でみてみましょう WinSCPもしくはターミナルを用いて PCに LC2ad_sort.bam および LC2ad_sort.bam.bai をダウンロードしてください IGVを起動させてリファレンスゲノムは左端上より Human hg19 を選択してください IGV の File Load from File で LC2ad_sorted.bam を開いてください

32 ファイル転送 Mac 1. 新たにターミナルを起動 2. scpを利用してスパコン上のファイルをpcのデスクトップに転送 $ scp lect01@gw.ddbj.nig.ac.jp:/home/lect01/lc2ad_sort.bam ~/Desktop/ $ scp lect01@gw.ddbj.nig.ac.jp:/home/lect01/lc2ad_sort.bam.bai ~/Desktop/ scp[ スペース ][ アカウント名 ]@[ サーバ名 ]:[ 転送したいファイルのパス ][ スペース ][ 転送先のパス ] Windows 1. WinSCP を起動してログイン 2. jishu ディレクトリの下にある LC2ad_sort.bam と LC2ad_sort.bam.bai をドラッグ & ドロップで PC のデスクトップにコピー

33 IGV 表示内容 Symbol や座標で検索可能 Zoom in / out Coverage track Map reads truck Gene track DHCR24 と検索してみましょう

34 右クリック show all bases で全ての塩基を表示できる拡大すると塩基レベルまで見られるリファレンスゲノムと違う部分 ( 多型や変異 ) が分かる

35 Tools Run igvtools おまけ igvtools というツールを使うと Window size ごとにシークエンスをカウントしてバイナライズ化したファイル (.tdf) を作成できる Input File に BAM ファイル (LC2ad.bam) を選択 Run TDF ファイルを IGV で開いてみましょう色や表示を変えることができます

36 課題おまけペアエンドのゲノムシークエンスデータ (PC-9_1.fq, PC-9_2.fq) をマッピングしてみましょう新しくログインしてホームディレクトリに入り $ qlogin ログインノードに入る $ pwd $ cd jishu $ ls $ cat MAPPING_pair.sh ディレクトリ jishu に移動してファイルを確認 MAPPING_pair.sh の中身を確認 $ qsub -l s_vmem=8g -l mem_req=8g -l short MAPPING_pair.sh 8G のメモリを要求して MAPPING_pair.sh を計算ノードで実行する

37 課題おまけ PC-9_1.fq と PC-9_2.fq をマッピングした結果できた PC-9_sorted.bam と PC-9_sorted.bam.bai を PC に転送して IGV で見てみましょう EGFR と検索してください拡大するとアライメントが見えます Exon 19 に 15 塩基の欠失が見えるでしょうか? 肺腺癌細胞株 PC-9 の EGFR 遺伝子にある E746_A750del 変異になります

broadinstitute.org/gatk/best-practices/ 検出した変異はすべてが正しいとは限らない!

38 マッピング後の解析例 1 全ゲノムエキソームゲノム多型変異の検出 BWA-GATK の場合 BWA 参照ゲノム配列へマッピング Picard/samtools 配列のソート Duplicate の除去など GATK 多型変異を検出検出した変異はすべてが正しいとは限らない! IGV での目視やサンガーシークエンス等での確認は必須 Genomon 東大医科研のヒトゲノム解析センタースパコンにインストール済みのツール

マッピング後の解析例 2 RNA-Seq 遺伝子発現解析融合遺伝子検出 TopHat-CuffLinks

(fpkm) 算出 Cuffdiff サンプル ( 群 ) 間の発現量の比較 Differentially

TopHat-fusion 融合遺伝子を検出 (http://cole-trapnell-lab.

39 マッピング後の解析例 2 RNA-Seq 遺伝子発現解析融合遺伝子検出 TopHat-CuffLinks の場合 TopHat 参照ゲノム配列へマッピング CuffLinks アセンブルによる転写産物の検出発現量 (fpkm) 算出 Cuffdiff サンプル ( 群 ) 間の発現量の比較 Differentially expressed gene の検出 tophat-fusion-post の出力例 TopHat-fusion 融合遺伝子を検出 ( 実験医学別冊 NGS アプリケーション RNA-Seq 実験ハンドブック羊土社参考

H3K4me3 PolII H3K9/14ac H3K27ac H3K4me1 ATAC-seq $ macs14

40 マッピング後の解析例 3 ChIP-Seq/ATAC-Seq ピーク検出 Bowtie 参照ゲノム配列へマッピング MACS/MACS2 ピークを検出 H3K36me3 H3K27me3 H3K9me3 ChIP-Seq H3K4me3 PolII H3K9/14ac H3K27ac H3K4me1 ATAC-seq $ macs14 ( 細胞工学別冊次世代シークエンサー DRY 解析教本秀潤社参考

ChIP-Seq ChromHMM ChromHMM: Chromatin state discovery and characterization http://compbio.mit.

41 ChIP-Seq ChromHMM ChromHMM: Chromatin state discovery and characterization 様々なヒストン修飾の ChIP-Seq データなどからクロマチンの状態をパターン化してくれるソフトウェア $ cd $ cp /home/lect01/chromhmm/lc2ad_dense.bed. Ernst J and Kellis M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nature Methods, 9: , ENCODE や Roadmap Epigenomics project でも ChromHMM データが公開されているでホームディレクトリに LC2/ad の ChromHMM の結果がコピーされます WinSCP で PC にダウンロードして IGV で見てみてください細胞工学別冊次世代シークエンサー DRY 解析教本秀潤社参考

42 Session 2 データベース新技術の紹介

43 データベース DBTSS DBTSS( DBTSS Suzuki et al Nucleic Acids Res (DB issue)

44 ヒト応用研究を志向したオミクス情報の統合 DBTSS 転写開始点 / トランスクリプトーム情報 (TSS/RNA Seq) ( 発現量と転写開始点 ) クロマチン情報 (ChIP Seq) ヒトゲノム変異情報の統合 DNA メチル化情報 (BS Seq) (ChrHMM パターンで示すヒストン修飾 ) (BS Seq による異常メチル化検出 ) ( それぞれの検体での変異部位 ) パスウェイマップ ( 文献情報 ) からの検索 ( 該当集団中の遺伝子変異頻度を赤の濃さで示す ) モデル系とのさらなる統合

45 データコンテンツ DBTSS Top ページ Data Contents TSS-Seq, ChIP-Seq( ヒストン修飾 ), RNA-Seq, RIP-Seq, BS-Seq, SNPs/SNVs data 細胞株を中心に

46 ヒトの多型変異情報も格納 (>15000) DBTSS Cancer genomes ICGC:International Cancer Genome Consortium TCGA:The Cancer Genome Atlas Gastric adenocarcinoma, Urothelial bladder carcinoma, Glioblastoma, Clear cell renal cell carcinoma, Endometrial carcinoma, Acute myeloid leukemia, Breast tumors, Squamous cell lung cancers, Colorectal cancer, Ovarian carcinoma National Cancer Center Hospital East: Lung adenocarcinoma (2013 PLoS ONE) NBDC ヒトデータベース : JGA Small cell lung cancer (2014 J Thrac Oncol) Others: Myelodysplasia (2011 Nature), Clear-cell renal cell carcinoma (2013 Nat Genet), Lung adenocarcinoma (2012 Cell) Japanese genomes (SNPs) HGVD: The Human Genetic Variation Database ToMMo: Tohoku Medical Megabank Organization JPDSC: The Japan PGx Data Science Consortium

47 DBTSS Search Human Variation DB (hg19 へ座標変換後リンク )

48 TSS viewer DBTSS EGFR* で検索 TSS viewer をクリック

49 Genome viewer DBTSS EGFR* で検索 Genome viewer をクリックドラッグ & ドロップで移動表示データを自由に選択

50 Genome viewer (BRAF 遺伝子を例に ) DBTSS Viewer control Gene model TSS-Seq RNA-Seq BS-Seq ChromHMM H3K4me3 H3K4me H3K27me3 H3K9me3 H3K9ac H3K36me3 H3K27ac Pol II SNV ChIP-Seq

51 ぜひ DBTSS を使ってください Pathway Map DBTSS CST や KEGG の pathway リスト MAPK/Erk in Growth and Differentiation をクリック RNA-Seq (RPKM: 発現量 ) ChIP-Seq などを表示できる Pathway Map の Search をクリック

52 ポータブル & ロングリードシークエンス MinION (Oxford Nanopore Technologies) ナノポアシークエンサー安価な初期投資 ($1,000スターターキット) ポータブル (103g: flow cell 込 ) ロングリード 10, ,000リード新技術

ナノポアシークエンサーを用いた研究 Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella Joshua Quick et al.

Greninger et al. 2015 Genome Medicine Figure 6, Quick et al. 2015Genome Biology Figure 1, Quick et al.

2016 Nature Ebola MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island Philip M Ashton et al.

2015 Nature Biotechnology Nanopore sequencing detects structural variants in cancer Alexis L Norris et al. 2016 Cancer Biology & Therapy Figure 1, Quick et al.

53 ナノポアシークエンサーを用いた研究 Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella Joshua Quick et al Genome Biology Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis Alexander L. Greninger et al Genome Medicine Figure 6, Quick et al. 2015Genome Biology Figure 1, Quick et al. 2015Genome Biology Salmonella Pathogen detection/typing Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance Joshua Quick et al Nature Ebola MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island Philip M Ashton et al Nature Biotechnology Figure 3, Norris et al Cancer Biology & Therapy Figure 2, Ashton et al Nature Biotechnology Nanopore sequencing detects structural variants in cancer Alexis L Norris et al Cancer Biology & Therapy Figure 1, Quick et al Nature Figure 3, Quick et al Nature Splicing patterns Determining exon connectivity in complex mrnas by nanopore sequencing Mohan T. Bolisetty and Gopinath Rajadinakaran et al Genome Biology Structural variants in cancer Figure 8, Bolisetty and Rajadinakaran et al Genome Biology Figure 1, Greninger et al Genome Medicine

合成ロングリードシークエンス GemCode (10x Genomics) Linked read @ GemCode 技術分子バーコーディング + ショートリードシークエンシング 750,000 beads Long genomic DNA

54 合成ロングリードシークエンス GemCode (10x Genomics) Linked GemCode 技術分子バーコーディング + ショートリードシークエンシング 750,000 beads Long genomic DNA fragments (~100 kb) 新技術 Chromium@10X Genomics (Kitzman Nature Biotechnology)

55 Genomics より抜粋新技術 Haplotype Browser Summary View Linked-Reads Structural Variants

シングルセルシークエンスさまざまなプラットフォームが開発されている C1 system@fluidigm 新技術 C1

Single-cell ATAC-Seq Nx1-Seq RNA-seq Drop-seq RNA-Seq Chromium

56 シングルセルシークエンスさまざまなプラットフォームが開発されている C1 新技術 C1 (Fluidigm 社 ) RNA-Seq ATAC-Seq Whole-exome sequencing Single-cell ATAC-Seq Nx1-Seq RNA-seq Drop-seq RNA-Seq Chromium Single Cell 3' Solution (10x Genomics 社 ) RNA-Seq など Macosko et al Cell Buenrostro et al Nature Chromium@10x Genomics 実験医学別冊 NGS アプリケーション RNA-Seq 実験ハンドブック羊土社参考

57 謝辞国立遺伝学研究所遺伝研スーパーコンピュータシステムのご担当者様講習会用のアカウントをご用意いただきました東京女子医科大学のご担当者様スパコン接続のためにご助力くださりありがとうございましたありがとうございましたご質問コメント等がありましたら遠慮なくお願いします

Microsoft PowerPoint - 150804_yonago_suzuki.pptx

Microsoft PowerPoint - 150804_yonago_suzuki.pptx 2015.08.04 AJACS 米子次世代シークエンサーを用いたがん細胞のオミクス解析国立がん研究センター先端医療開発センタートランスレーショナルリサーチ分野鈴木絢子本日の予定 Session 1 シークエンスタグのマッピングと可視化 (RNA Seq) Session 2 データベースDBTSSの紹介東京