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さなえいいはた
5 years ago
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1 NGS データ解析入門 Web セミナー : 変異解析編 1

2 NGS 変異データ解析の手順シークエンス変異検出マッピングデータの精査解釈 2

3 解析ワークフローと使用ソフトウェアシークエンスデータのインポートクオリティチェック参照ゲノム配列へのマッピング再アライメント変異検出 CLC Genomics Workbench または Biomedical Genomics Workbench 遺伝子名アミノ酸配列置換情報の付加ゲノムブラウザー表示機能アノテーション情報の確認 GenomeBrowse または VarSeq 3

4 データインポート ~ 遺伝子名アミノ酸配列置換情報付加 4

Realignment 変異検出 Basic Variant Detection Fixed Ploidy Variant Detection Low

5 CLC Genomics Workbench 使用ツールシークエンスデータのインポート NGS data import クオリティチェック Create Sequencing QC Report Trim Reads 参照ゲノム配列へのマッピング再アライメント Map Reads to Reference Local Realignment 変異検出 Basic Variant Detection Fixed Ploidy Variant Detection Low Frequency Variant Detection 遺伝子名アミノ酸配列置換情報の付加 Amino Acid Changes Annotate with Overlap Information 5

シークエンスデータのインポート CLC Genomics Workbench, Biomedical Genomics Workbench ともにシークエンサー機種やファイルフォーマットに合せたインポートメニューを利用可能 Toolbar の Import アイコンから表示されるインポーターから選択してインポートを実行

6 シークエンスデータのインポート CLC Genomics Workbench, Biomedical Genomics Workbench ともにシークエンサー機種やファイルフォーマットに合せたインポートメニューを利用可能 Toolbar の Import アイコンから表示されるインポーターから選択してインポートを実行プラットフォーム Illumina PacBio Ion Torrent ファイル形式.txt.fastq.fq.qseq.bas.h5/.bax.h5.fastq.fq.fasta.fa.fna.sff.fastq.fq Ion Torrent の Unmapped BAM ファイルは Standard Import よりインポートを行う 6

7 High-Throughput Sequencing Import シークエンスデータファイル (FASTQ ファイルなど ) シークエンサー機種などに合わせてメニューを選択しシークエンスデータファイルを選択ペアエンドシークエンスデータのインポートにも対応 7

8 High-Throughput Sequencing Import シークエンスデータがインポートされ各種解析に使用できるようになる各リードの塩基配列やクオリティスコアなどを確認できる 8

9 クオリティチェックインポートしたシークエンスデータに対してクオリティチェックレポートの作成や低クオリティリードの除去などを行うその他重複リードの除去やマルチプレックスシークエンス時のサンプルバーコードのソートなどの各種データ前処理用ツールなども利用が可能 Create Sequencing QC Report インポートしたシークエンスデータのクオリティや PCR Duplicate の状況などを確認するためのレポートを作成 Trim Reads アダプターの除去クオリティスコアによる除去長さを指定した除去などを選択組み合わせてリードのトリミングを実行 9

10 Create Sequencing QC Report Create Sequencing QC Reportではシークエンスデータのクオリティ情報をまとめたレポートが作成される GC 含量やクオリティスコア分布などのグラフデータや数値データを確認が可能 10

11 Trim Reads Trim Readsの使用により各リードの低クオリティ部分がカットされるその他アダプター配列の除去なども可能 11

12 参照ゲノム配列へのマッピング再アライメント変異の検出前にシークエンスデータの各リードがゲノム上のどの部分を読んだものかさらにどの部分で塩基が違っているかを調べるために参照ゲノム配列へのリードのマッピングを行うサイズの大きい Insertion / Deletion を含んだリードはマッピングが正確に行えない場合もあるので必要に応じて再アライメントも行う Map Reads to Reference 任意の参照ゲノム配列に対してシークエンスデータのマッピングを行う Local Realignment すでにマッピングを実行したデータを使用しリードの再アライメントを行う 12

13 Map Reads to Reference Map Reads to Referenceでは実行時のオプションパラメータで任意の参照ゲノム配列データを選択が可能ヒトマウスラットなどのモデル生物の参照ゲノム配列データはソフトウェア標準搭載のダウンロードツールから取得できその他 NCBIに登録されている参照ゲノム配列データやユーザーカスタム作成の配列データを使用することも可能 13

14 Map Reads to Reference Map Reads to Referenceを実行するとゲノム配列 ( 染色体 ) ごとにマッピングされたリード配列がどの領域に多いのかを示したカバレッジグラフが表示されるカバレッジグラフを拡大していくと各リードの塩基配列も表示され変異部位なども確認できる 14

15 Local Realignment Local Realignment 前 Local Realignment 後 Local Realignmentの使用によりすでにマッピングされた各リードに対して同じ領域にマッピングされた周辺のリードに基づき再アライメントが実行されるサイズの大きいInsertion / Deletionの検出に対して有効 15

変異検出マッピング再アライメント後のデータより変異の検出を行うためのツールは 3 種類ありそれぞれ計算時のアルゴリズムが違っているがすべて SNV または小サイズの Insertion / Deletion の検出のみに用いられる変異検出時の感度や特異度さらにサンプルの種類などに合わせてどのツールを用いるのかを判断する必要がある Basic Variant Detection

16 変異検出マッピング再アライメント後のデータより変異の検出を行うためのツールは 3 種類ありそれぞれ計算時のアルゴリズムが違っているがすべて SNV または小サイズの Insertion / Deletion の検出のみに用いられる変異検出時の感度や特異度さらにサンプルの種類などに合わせてどのツールを用いるのかを判断する必要がある Basic Variant Detection 特殊な統計モデルを使用せずに SNV, Small Indel を検出するパラメータの設定を調整することで検出可能な変異に制限を設けずに解析が可能 Fixed Ploidy Variant Detection 確率モデルを用いて SNV, Small Indel を検出するパラメータで指定した Ploidy( 倍数体 ) の値に基づいて変異の検出を行うカバレッジ中に低頻度 (15% 以下 ) で存在する変異は検出できない Low Frequency Variant Detection 確率モデルを用いて SNV, Small Indel を検出するカバレッジ中に低頻度で存在する変異の検出が可能 16

17 変異検出 3ツールともオプションパラメータで変異をもつ最低リード数や頻度リードのクオリティなどを設定が可能遺伝子パネル解析の場合変異検出の対象とするゲノム上のターゲット領域などを指定する 17

変異検出 Chromosome: 変異の検出された染色体番号 Region: 変異のポジション Type: 変異の種類 (SNV, Insertion, Deletion など ) Reference: リファレンスの塩基配列 Allele: 検出された塩基配列 Zygosity: 変異の接合性 (Hetero か Homo か ) Count: マップされたリードのうち

18 変異検出 Chromosome: 変異の検出された染色体番号 Region: 変異のポジション Type: 変異の種類 (SNV, Insertion, Deletion など ) Reference: リファレンスの塩基配列 Allele: 検出された塩基配列 Zygosity: 変異の接合性 (Hetero か Homo か ) Count: マップされたリードのうち変異を有するリードの数 Coverage: マップされたリード数 Frequency: 変異の頻度検出された変異はテーブル形式で保存され Excelなどにファイル出力が可能変異テーブルには変異の存在する位置や変異の種類検出されたアリルリード数などの情報が含まれる変異テーブル上では各テーブル項目に基づきフィルターをかけることができ信頼性の高い変異のみを抽出することも可能 18

19 遺伝子名アミノ酸配列置換情報の付加変異テーブルには変異部位に存在する遺伝子名や変異によるアミノ酸置換などの情報を追加することが可能変異データから生物学的な解釈などを行う場合にこれらの情報が必要となる使用ツール変異データ遺伝子名データ 19

20 遺伝子名アミノ酸配列置換情報の付加パラメータオプションで遺伝子アノテーション情報データを指定して実行 20

21 解析ワークフローの作成解析の自動化を行うために各ツールの使用の順番をプログラムしたワークフローを作成することが可能サンプルが複数存在する場合は全サンプルまとめてバッチ処理を行うことも可能 21

22 Biomedical Genomics Workbench の場合クオリティチェック用ワークフロー : 全ゲノムシークエンス解析用ワークフロー : 全エクソームシークエンス解析用ワークフロー : ターゲットアンプリコンシークエンス解析用ワークフロー : Biomedical Genomics Workbenchではレディーメイドのワークフローが標準で搭載されておりこれらワークフローを使用するだけで各解析を一気に実行することが可能がん遺伝性疾患用のワークフローがあり腫瘍 / 正常ペアサンプル比較や家族性のトリオサンプル解析を実行することも可能 22

23 ゲノムブラウザー表示 ~ 機能アノテーション情報の確認 23

24 ゲノムブラウザー表示変異テーブルのみではなくマッピングされたリードを直接目視で確認し実際にリードに変異が含まれているかなどの確認のために用いられるマッピングや変異テーブルデータのみではなくデータベースのアノテーション情報なども同時に表示させ各変異の生物学的な解釈を行うことも可能 24

25 ゲノムブラウザー表示 CLC Genomics Workbench, Biomedical Genomics Workbench ともにゲノムブラウザー機能が搭載されておりマッピングデータや変異データさらに各種遺伝子情報データなどをまとめて表示することが可能 25

26 ゲノムブラウザー表示無料で使えるゲノムブラウザーで BAM ファイル VCF ファイルなどのデータをグラフ表示が可能様々な公共データベースの情報もアノテーションとしてゲノムブラウザーに表示させデータの詳細を確認数値データ変異データアノテーションデータの表示の他連鎖不平衡プロットやヒートマップも表示が可能様々な公共データベースの情報を基に変異データへアノテーション付けを実行アノテーション付けされた情報などを用いて任意の検索条件でデータのフィルタリングを行うワークフローを作成カバレッジ計算やトリオ解析表現型情報に基づく遺伝子ランキングなどの解析アルゴリズムを搭載 GenomeBrowse を搭載し BAM ファイルデータや各種アノテーションデータをグラフ表示 26

27 ゲノムブラウザー表示 FASTQ マッピング変異検出の実行解析結果データのファイル出力 VCF BAM インポート 27

28 ゲノムブラウザー表示 GenomeBrowse では BAM ファイルや VCF ファイルをドラッグ & ドロップするだけでゲノムブラウザー上に表示が可能同時に表示するアノテーションリソースは標準搭載のデータライブラリーよりダウンロード 28

29 ゲノムブラウザー表示 Console Window にてマッピングされたリード数カウントやアノテーションの詳細などを確認が可能 29

機能アノテーション情報の確認遺伝子名やアミノ酸置換情報だけではなく様々なアノテーションリソースを用いて変異テーブルに疾患との関連情報などのアノテーション付けを行う GenomeBrowse ではゲノムブラウザー上で情報を閲覧するだけだが VarSeq では変異テーブルに情報を追加したうえでフィルタリングも行うことができるアノテーションリソースの種類 : dbsnp

30 機能アノテーション情報の確認遺伝子名やアミノ酸置換情報だけではなく様々なアノテーションリソースを用いて変異テーブルに疾患との関連情報などのアノテーション付けを行う GenomeBrowse ではゲノムブラウザー上で情報を閲覧するだけだが VarSeq では変異テーブルに情報を追加したうえでフィルタリングも行うことができるアノテーションリソースの種類 : dbsnp RefSeq Genes COSMIC 1000 Genome NHLBI 6500 Exomes ExAC Variant gnomad Exomes SIFT and PolyPhen dbnsfp Functional Predictions ClinVar CIVic ICGC Simple Somatic Mutation 各種遺伝子パネルのターゲットデータ... など 30

31 機能アノテーション情報の確認フィルタリングワークフロー付加したアノテーション情報などを用いて変異データに対する任意のフィルタリングワークフローを作成ワークフローの各項目ごとにフィルタリング結果の変異データテーブルを確認可能で項目を変更するとフィルタリング結果の変異データテーブルも自動的にアップデートされる 31

32 お問い合わせ先 : フィルジェン株式会社 TEL (9:00~17:00) FAX biosupport@filgen.jp 32

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