IonTorrent RNA-Seq 解析概要 サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパンテクニカルサポート The world leader in serving science
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1 IonTorrent RNA-Seq 解析概要 サーモフィッシャーサイエンティフィックライフテクノロジーズジャパンテクニカルサポート The world leader in serving science
2 資料概要 この資料は IonTorrent シーケンサーで RNA-Seq (WholeTranscriptome mrna ampliseqrna mirna) 解析を実施されるユーザー様向けの内容となっています シーケンサー付属の解析サーバー内で可能な解析や出力ファイルについての説明資料となります シーケンサー付属の解析サーバーでは 発現変動遺伝子の統計学的比較解析や GeneOntology(GO) パスウェイ解析などを実施することはできません 解析を行う際には 別途解析ソフトウェアをご用意いただく必要がございます 2
3 1. RNA-Seq 解析概要 3
4 4 RNA-Seq 概要
5 5 RNA-Seq と半導体 Chip の選択
6 IonTorrent での RNA-Seq 解析の流れ Torrent Server 画面操作 & 自動で解析 Unmapped BAM FileExporter プラグイン Fastq RNASeqAnalysis プラグイン 3 rd party マッピングアイソフォームの発現量クラスタリング新規転写領域の同定群間比較解析 GO 解析パスウェイ解析 Mapped BAM タグカウント RPKM Gene Expression RPKM Transcript Expression 解析ソフトウェアにより 入力に必要なファイルが異なります 6
7 RNA-Seq 解析のためのソフトウェアの例 : 有償 解析の流れ : 無償 マッピング 発現量算出 正規化 発現比較統計解析 GO パスウェイ解析など RNASeqAnalysis プラグイン R には様々な解析パッケージソフトが存在します (edger DESeq など ) (DAVID) それぞれのソフトウェアの詳細機能は 販売元やマニュアルにてご確認ください 7
8 2. RNA-Seq 解析 解析 (WholeTranscriptome mrna) 8
9 発現解析 :RNASeqAnalysis プラグイン プラグインの処理概要 STAR と Bowtie2 によるスプライスジャンクションを考慮したマッピング HTSeq による遺伝子ごとのタグカウント Cufflinks による転写産物構造予測および発現量 (RPKM) 算出 TS5.2.x では hg19( ヒト ) および mm10( マウス ) のみに対応 < 解析パイプライン > 9
10 RNASeqAnalysis プラグインの自動実行設定 (1) Autorun の設定 Autorun の項目に (2) Plan 作成時の設定 の部分をクリック リファレンスを選択し Save 10
11 RNASeqAnalysis プラグインの実行 (1) トレントブラウザレポート画面の Select Plugins To Run ボタンをクリック (2) RNA SeqAnalysis をクリック (3) リファレンスを選択し Submit をクリック mm10 の選択には TorrentServer に mm10 リファレンスの登録が必要 ( 画面右上歯車マーク >References より登録可能 ) 11
12 RNASeqAnalysis プラグイン解析結果 ランレポートの中部に結果が表示される 複数サンプルをまとめた解析結果の閲覧 ダウンロード サンプル毎の解析結果の閲覧 ダウンロード 12
13 複数サンプルをまとめた統計情報 リードの分布情報 バーコード間の相関図とヒートマップ Distribution Plots Correlation Heatmap Gene Heatmap Isoform Heatmap Correlation Plot 解析結果のダウンロードリンク Download Barcode Summary Report Download absolute reads table Download absolute normalized reads table Download aligned reads distribution table Download isoform FPKM values table サンプル間で発現変動の顕著な 250 遺伝子を図示 13
14 複数サンプルをまとめた発現量データのダウンロード それぞれのファイルをExcelで開いた例 Download absolute reads table Download isoform FPKM values table 注意!: 遺伝子名の含まれるデータを Excel で開くと 自動的に他の文字列に変換される場合 ( SEPT1 1-Seq など ) があります データを開く際は テキストウィザードで 文字列 として取り込むことを推奨します 14
15 サンプル毎の統計情報 ダウンロードリンク マッピングやカバレッジ解析結果 発現している Isoform 数 (25 以下 ) 5 3 リボソーム 解析結果のダウンロードリンク Coding 正規化された遺伝子上のカバレッジ分布 UTR Intron 遺伝子間 マップされた領域 15
16 解析結果のダウンロードページ 1 Download Output Files (page) File Size Date File 347M Aug Chimeric.out.junction STAR&Bowtie2のマッピング結果 BAMファイル 2.6G Aug Chimeric.out.sam 20K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.RNAmetrics.png 2.9K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.RNAmetrics.txt 4.2G Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.bam 4.5M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.bam.bai 676K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.STARBowtie2.gene.count 107 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.bam 20K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.geneisoexp.png 1.3M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.geneisoexp.xls 28K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.geneisoexp_all.png 676K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.genereads.xls 4.6K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.generep.png 158 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.genes.fpkm_tracking 161 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.isoforms.fpkm_tracking 18K Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.rnareads.png 111 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.rnareads.xls 150 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.skipped.gtf 930 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.stats.txt 154 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_NameIonXpressRNA_001_Analysis_Name.transcripts.gtf 1.7K Aug Log.final.out 12K Aug Log.out 8.6M Aug SJ.out.tab 3.1G Aug alignedstar.bam 4.0K Aug output_cufflinks 37K Aug rnaseq.log 44M Aug xrrna.bam 8 Aug xrrna.basereads 16
17 解析結果のダウンロードページ 2 Download Cufflinks Output Files (page) File Size Date File 5.6M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.genes.fpkm_tracking 25M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.isoforms.fpkm_tracking 0 Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.skipped.gtf 305M Aug IonXpressRNA_001_Analysis_Name.transcripts.gtf genes.fpkm_tracking を Excel で開いた例 Cufflinks により算出された RPKM(FPKM) ( 遺伝子レベル ) ( 転写産物レベル ) 17
18 3. AmpliSeq RNA 解析 18
19 Ion AmpliSeq RNA アンプリコンデザイン 1アンプリコン / 遺伝子 exon-exon boundaryにデザイン アイソフォームを見分けないようにデザイン ターゲット遺伝子の発現解析に Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit Ion AmpliSeq RNA パネル 19
20 ampliseqrna プラグインの実行 検出された遺伝子の発現量を算出し 正規化 (RPM:Reads per million mapped reads) (1) インストールされているプラグインのリストから ampliseqrna をクリック v (2) ライブラリタイプ (Ion AmpliSeq RNA) (3) ターゲット領域 (4) 不使用のバーコードをフィルターする場合にチェック (5) ライブラリ作製時にERCCを添加した場合にチェック (6) 実行 20
21 ampliseqrna プラグイン解析結果 統計情報 リファレンスに対してマップされたリード数 ターゲット領域 ( 遺伝子 ) を検出した有効なリードの割合 Log2 RPM pair correlation plots 各サンプルの発現量プロットと相関分析 (r: 相関係数 ) リード数毎の統計値 (< K-10K-100K+) サンプル間の発現変動値 Log 2 (Experiment/Control) を算出 各種統計情報をダウンロード可能遺伝子のアノテーション情報 リード数 正規化された値 21
22 4. mirna 解析 22
23 smallrna_analysis プラグインのインストール (1) 下記 URL よりダウンロード (2017 年 3 月時点の最新版 ) (2) トレントブラウザにログインし 右上歯車マーク Plugins を選択してインストールされているプラグインの一覧を表示 (3) プラグインの一覧画面右上にある Install or Upgrade Plugin をクリック (4) Select File ボタンから プラグイン名.zip を選択し Upload file ボタンをクリック 23
24 smallrna_analysis プラグインの実行 プラグインスタート画面 Advanced Settings hg19 のみ対応 Submit をクリックすると解析がスタート 24
25 smallrna_analysis プラグイン解析結果 smallrna_analysis 結果画面 結果の統計情報の閲覧 ダウンロードが可能 サンプル毎の mirna リードカウント数を確認可能 25
26 5. ファイル形式形式変換 (Fastq ファイルの取得 ) 26
27 FileExporter プラグイン Fastq ファイルの作成 解析データの一括取得 (1) FileExporter をクリック (2) 出力ファイルや名前を設定 (3) 完了するとレポート画面から fastq ファイルをダウンロードできます 27
28 6. その他のサポート情報 28
29 RNASeqAnalysis_TopHat プラグイン プラグインの処理概要 TopHat2 と Bowtie2 によるスプライスジャンクションを考慮したマッピング HTSeq による遺伝子ごとのタグカウント Cufflinks による転写産物構造予測および発現量 (RPKM) 算出 様々な生物種に対応可能 < 解析パイプライン > < 要望に応じてリファレンス情報を追加 > 29 バイオインフォマティクス サービス ( 有償 ) にて提供中
30 バイオインフォマティクスコンサルティングサービス 30
31 あると便利なソフトウェア PuTTy SSHで自 WindowsPCからTorrent Serverへアクセスし コマンド操作などを行えるツール WinSCP Torrent Serverにアクセスし ドラッグ & ドロップでファイルの移動が可能なツール IGV BAMファイルを視覚化するためのツール クオリティチェック トラブルシュートの際に役立つ テキストエディタ 以下のようなソフトウェアを使用すると FastaファイルやBEDファイルの加工に便利 サクラエディタ : 解凍ソフト 解凍レンジ : 31
32 ご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまでお問い合わせください Technical Support The Chip is the Machine Call 営業時間 : 午前 9 時から午後 6 時まで 32
33 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. 33
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