HIV薬剤耐性検査ガイドライン Ver.8

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3 はじめに 4 薬剤耐性遺伝子 ( ジェノタイプ ) 検査推奨事例 5 解説 6 1. 新規診断時 ( 急性感染症例および慢性経過症例を含む ) 2. 治療開始時 3. 治療開始後十分な治療効果が認められない時 4. 治療中薬剤耐性 HIV の出現が疑われた時 5. ウイルス学的失敗以外の理由で薬剤を変更する時 6. 治療の中断と再開時 7. HIV 感染妊婦において予防投与を行う時補足 1: 薬剤耐性獲得症例の減少補足 2: 血中 HIV RNA コピー数が 10 2 のレベルで持続して検出される場合補足 3: 針刺し事故など感染者血液に曝露した場合の予防的措置 付録 11 薬剤耐性遺伝子検査法 薬剤耐性関連アミノ酸変異リストと参考事項 薬剤別にみる薬剤耐性アミノ酸変異と耐性度 アルゴリズムを取り入れた薬剤耐性遺伝子検査の評価方法 Stanford 大学 medical center の研究チームが公開している HIV 薬剤耐性データベースの利用方法 指向性検査 参考文献 27 HIV 薬剤耐性検査に関する問い合わせ先 31 3

4 はじめに HIV/AIDSの治療を進める際に治療薬剤を選択する指標として薬剤耐性遺伝子検査が有効であることは多くの研究により実証されている 従来薬剤耐性遺伝子検査は全国各地のウイルス研究所等で実施されてきたが 平成 18 年 4 月の薬剤耐性遺伝子検査の保険収載 * に伴い民間検査会社等に委ねられる事になった 本ガイドラインではHIV/AIDSの診療現場においてどの様な時に薬剤耐性遺伝子検査の実施が推奨されるのかについて記す 2014 年 3 月 謝辞 本ガイドラインの作成に当たっては下記の先生方をはじめ多くの先生方にご意見を頂きました この場を借りて御礼申し上げます 味澤篤 ( 駒込病院感染症内科 ) 伊部史朗 ( 北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 ) 岡田清美 ( 北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 ) 和山行正 ( 北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所 ) 潟永博之 ( 国際医療研究センター ) 加藤真吾 ( 慶應義塾大学医学部 ) 鯉渕智彦 ( 東京大学医科学研究所 ) 白阪琢磨 ( 国立病院機構大阪医療センター ) 杉浦亙 ( 国立病院機構名古屋医療センター ) 西澤雅子 ( 国立感染症研究所エイズ研究センター ) 橋本修 ( 株式会社 LSIメディエンス ) 蜂谷敦子 ( 国立病院機構名古屋医療センター ) 服部純子 (National Cancer Institute/Drug Resistance Program) 福武勝幸 ( 東京医科大学 ) 松下修三 ( 熊本大学エイズ学研究センター ) 松田昌和 ( 国立病院機構名古屋医療センター ) 宮崎菜穂子 ( 東京大学医科学研究所 ) 横幕能行 ( 国立病院機構名古屋医療センター ) 吉田繁 ( 北海道大学大学院保健科学研究院 ) 渡邉大 ( 国立病院機構大阪医療センター敬称略 五十音順 平成 25 年度厚生労働科学研究費補助金エイズ対策研究事業 HIV 感染症の医療体制の整備に関する研究 研究分担者 : 杉浦亙 ( 国立病院機構名古屋医療センター臨床研究センター ) 研究代表者 : 伊藤俊広 ( 国立病院機構仙台医療センター HIV/AIDS 包括医療センター ) * 保険上の規定 HIV 薬剤耐性遺伝子 ( ジェノタイプ ) 検査は 抗 HIV 治療の選択及び再選択の目的で行った場合に 3ヶ月に1 回を限度として算定できる 保険点数 6000 点 4

5 薬剤耐性遺伝子 ( ジェノタイプ ) 検査推奨事例 ( 図 1) 以下の項目の事例では薬剤耐性遺伝子検査の実施が望ましい 1 HIV 感染の新規診断時 ( 急性感染症例および慢性経過症例を含む ) 治療開始時 治療開始後十分な治療効果が認められない時 治療中薬剤耐性の出現が疑われた時 5 ウイルス学的失敗以外の理由で薬剤を変更する時 6 7 治療の中断と再開時 HIV 感染妊婦において予防投与を行う時 図 1 HIV 感染症の経過と薬剤耐性遺伝子検査を行うタイミングこの図は典型的なHIV 感染症例の経過と薬剤耐性遺伝子検査の実施ポイントを示したものである 青実線 : 治療が成功した時のVLの変動赤点線 : 治療開始後 6ヶ月を経ても十分な治療効果が認められず 薬剤耐性が疑われる場合のVLの変動赤実線 : 一旦治療が成功しVLが検出限界以下に抑え込まれたが その後再びVLが増加を始め 薬剤耐性の出現が疑われた場合のVLの変動 5

6 解説 HIV 薬剤耐性遺伝子検査は治療を適切に進める指標として必要な検査である 薬剤耐性遺伝子検査の治療における有用性については今まで多くのコホート研究が行われてきたが その多くが薬剤耐性遺伝子検査の実施が良い治療成績に繋がったと報告している [1-9] 我が国では多剤併用療法 (Antiretroviral therapy: ART) の導入と同じ頃から国立感染症研究所エイズ研究センターや各地のウイルス研究所 ( 衛生研究所等 ) において実施されてきたが 平成 18 年 4 月に保険収載されたのに伴い薬剤耐性遺伝子検査は検査を必要とする感染者に広く供給されることになった しかしその一方で 従来は研究として無料で実施されてきたこの検査は 保険収載されたことにより1 回あたり60000 円 3 割負担で18000 円の個人負担が発生し 特に医療費の助成を受けていない患者では医療費の自己負担が大きくなることになる ( 註 1) また 必要以上の検査の実施は医療費の無駄遣いを招くことから慎まなければならない 本ガイドラインは検査の適切な使用を目的に作成したが 以下 前頁で示した推奨される事例について解説をしていく 註 1: 医療費などの問題で薬剤耐性遺伝子検査の実施が困難な場合は本ガイドライン巻末に記載されている 検査実施施設などに相談することを薦める 1 新規診断時 ( 急性感染症例および慢性経過症例を含む ) 多剤併用療法が標準的な治療法として定着して 20 年余りとなるが 治療薬剤に対して耐性を獲得したウイルス ( 薬剤耐性ウイルス ) の出現が 適切な治療の障害として問題となっている 近年 未だ治療を始めていない新規に感染あるいは感染が診断された者の中にも薬剤耐性を獲得した症例が確認されており 治療感染者集団からの薬剤耐性ウイルスの感染拡大が危惧されている 新規診断症例における薬剤耐性 HIV-1の出現頻度の疫学的調査研究は欧米各国で行われており その頻度は地域や集団により数 % 24.1% と広い分布を示す ( 図 2) [10-35] 我が国においても2003 年より新規未治療症例における薬剤耐性症例の全国調査が行われており 年ごとに増減はあるものの基本的に増加傾向を示し 現在では新規未治療症例の10% 前後に何らかの薬剤耐性変異が観察される ( 図 3) [27, 28] 治療前における薬剤耐性の有無を確認することは初回治療の選択に極めて重要な情報であるが [36-38] 薬剤耐性を獲得したウイルスは往々にして薬に対して感受性を保持したウイルスよりも増殖能力などが劣ることなどから 未治療の環境下では野生型に隠れて通常の遺伝子検査法では確認されない場合がある この事実は高感度検出法を用いた研究により確認されている [39-42] 従ってHIV 感染診断確定後は直ちに抗 HIV 療法を開始しない場合でも 将来の適切な抗 HIV 療法選択の指標の一つとして薬剤耐性遺伝子検査を行うことが医学的に望ましい 事実 Little 等は診断時に薬剤耐性変異の有無を確認することが 治療開始後の治療の成否に影響を及ぼすと報告している [43] 6

7 但し 当該患者にとって診断確定時の薬剤耐性遺伝子検査に緊急性があるとは言えないことから薬剤耐性遺伝子検査を実施の際は費用やその意義について患者に十分な説明を行い 了承を得ることは必須である 早期に医療費助成制度を利用することを考える場合には その後に薬剤耐性遺伝子検査を行う選択肢もある あるいは巻末に示した薬剤耐性遺伝子検査の実施施設に相談をすることも検討されたい EU 13.5% ( ) (10) Italy % ( ) (16) 8.4% ( ) (11) 5.9% (2009) (17) UK 7.1% ( ) (12) Cyprus 5.4% ( ) (18) 3.3% ( ) (13) Greece 9.0% ( ) (19) Belgium 9.5% ( ) (14) Slovenia 3.9% ( ) (20) Portugal 7.78% (2003) (15) Morocco 4.2% (2009) (6) Cameroon 7.8% (2006) (81) Uganda 0% (56) Japan 5-10% ( ) (27,28) S Korea 4.3% ( ) (29) 3.0% ( ) (30) US 19.7% ( ) (21) 8.3% ( ) (22) 13.2% ( ) (21) 14.6% (2006) (23) NY 13.2% ( ) (24) 24.1% ( ) (24) Mexico 15.0% ( ) (25) 2.5% ( ) (26) Brazil 3% (2005) (34) Argentina 4.2% (2007) (35) 図 年新たに HIV/AIDS が判明した症例数および報告されている薬剤耐性 HIV 検出頻度 (%) 14% 13% 12% 11% 10% 9% 8% 7% 6% 5% 4% 3% 2% 1% 0% NRTI NNRTI 11.9% PI All 9.9% 9.3% 8.1% 8.1% 8.3% 8.0% 8.7% 5.8% 6.8% 5.3% P 図 3 新規 HIV/AIDS 診断症例における薬剤耐性変異の検出頻度 ( ) 7

8 2 3 4 治療開始時治療開始時に薬剤耐性検査を実施する事は急性 慢性感染を問わず治療薬剤投与前の基本的な臨床情報として必要であり またこの時点での薬剤耐性獲得の有無の確認は適切な抗 HIV 薬剤を選択するために有効である [36-38] 但し 薬剤耐性検査の結果を待つために治療の開始を遅らせることは避けるべきである 治療開始後十分な治療効果が認められない時治療開始後 6ヶ月を経過しても2 回以上の測定において血中 HIV RNAコピー数が500 以上を示す場合 あるいは治療中にコピー数が 500 未満に到達していない場合 薬剤耐性ウイルスの存在が疑われる 薬剤耐性遺伝子検査を行い至適な薬剤を選択するための指標にすることが推奨される 治療中薬剤耐性 HIVの出現が疑われた時治療中に以下の事態を観察した場合には 速やかに薬剤耐性遺伝子検査を行い 薬剤耐性変異の有無とそのパターンを判定し 効果の高い薬剤を選択するための参考とすることが推奨される 1. 血中 HIV RNAコピー数が検出限界以下 (<20コピー/mL) に到達していたが 治療中に増加して500コピー /ml 以上となった場合 尚 血中 HIV RNAコピー数が コピーの場合は薬剤耐性検査の成功率が1000コピー以上の場合に比して低くなるが その場合でも耐性検査を試みて耐性の有無を確認することが推奨される ( 図 4)( 註 2) 図 4 血中 HIV RNA 量が検出感度以上の時の対応の目安註 2: 薬剤耐性遺伝子検査はPCRによるプロテアーゼ 逆転写酵素およびインテグラーゼ遺伝子増幅産物の配列解析を基本とする検査法である ( 図 5) このため目的とする遺伝子産物の増幅に成功しないと解析を行うことはできない DHHSのガイドライン [46] および本ガイドラインで検査実施の閾値として記載している1000コピー /mlは現在用いられている HIV RNA 定量検査の実状と薬剤耐性遺伝子検査を行う際の実用感度の目安を示すものである <1000 コピー /mlの場合でも超遠心操作等の濃縮により遺伝子配列解析は可能になることもあるが それでも遺伝子産物増幅の成功率は低い 反対に >1000コピー /mlの場合でも遺伝子産物の増幅ができず 解析できないこともある これは HIV 本来の特性である遺伝的多様性等による ( 薬剤耐性遺伝子検査法 参照) いずれの場合も巻末に示した薬剤耐性遺伝子検査を実施可能な施設に相談をすることも検討されたい 8

9 2. 安定していた血中 HIV RNAコピー数が1 log 以上増加した場合 : この場合は 薬剤の継続的な投与による薬剤耐性の獲得および関連する変異の集積のみならず アドヒアランスが低下した事態も考えられる事から 患者の服薬状況を確認することが必要である アドヒアランスに問題が認められた場合の対応についてはアドヒアランスのガイドラインを参照のこと また稀な事例として薬剤耐性ウイルスによる重感染も考えられる 血中 HIV RNAコピー数のモニタリングでは 時に一過性の上昇を経験することがある (blip) 上昇が一過性である場合 その次の採血機会に薬剤耐性遺伝子検査が施行されたとしてもHIV 遺伝子の検出ができないことがある 従って 血中 HIV RNA 量の上昇を観察した場合には どの時点で薬剤耐性遺伝子検査を行うか 慎重な判断が要求される 専門家の意見を聞くことも考慮すべきである 補足 1: 薬剤耐性獲得症例の減少近年のARTの進歩により 薬剤耐性の獲得によるウイルス学的失敗に陥る症例は激減している 2009 年に我々が実施した全国調査では臨床的に問題となるレベルの薬剤耐性を獲得していた症例はART 患者の1.5% 以下の頻度であることを明らかとしている [44, 45] 補足 2: 血中 HIV RNAコピー数が10 2 のレベルで持続して検出される場合十分な服薬にも関わらず 血中 HIV RNAコピー数が数百コピーのレベルで持続的に検出されるものの薬剤耐性遺伝子検査で耐性変異が確認されない症例に遭遇する事が稀にある その場合は通常の薬剤耐性遺伝子検査法以外の方法で精査をする必要があるため 専門研究機関に相談することを推奨する 5 ウイルス学的失敗以外の理由で薬剤を変更する時副作用等ウイルス学的失敗以外の理由で抗 HIV 薬を変更する場合も 万が一変更後の治療でウイルス学的失敗に陥った際に過去の耐性変異情報が次の治療薬選択の指標になることから 変更前に薬剤耐性遺伝子検査を実施することが望ましい この様な事例では血中 HIV RNAコピー数が低いために検査が困難なことも想定されるので検査会社あるいは巻末の研究機関等に相談することが望ましい 1. 2 回目以降の治療変更 1 回目の治療変更がウイルス学的失敗であった時は その時に獲得された薬剤耐性変異の有無の確認が強く推奨される 2. 1 回目の治療変更 : ウイルス学的失敗で治療を変更する訳ではないので 薬剤耐性を獲得している可能性は低いが minor resistance 等が選択されている可能性があるため検査の実施が推奨される 9

10 6 7 治療の中断と再開時 1. 中断時 : 何らかの理由により治療が中断された場合は ( 血中 HIV RNA 量 >500コピー /ml と考えられるので ) 将来の治療再開の際の治療薬選択の指標として薬剤耐性遺伝子検査を行うことが推奨される 中断してから検査実施までの期間が長ければ野生型に隠れて薬剤耐性変異の有無が確認されないことがあるため 中断から早い時期 (4 週間以内 ) の検査を強く推奨する 中断時期が明確でない場合も検査を行うことが望ましい 2. 再開時 : 治療再開時も薬剤耐性遺伝子検査を実施することが推奨される しかし 現在の保険上の規定では薬剤耐性遺伝子検査の頻度は3ヶ月に一度までとなっていることに留意する 尚 再開時の薬剤選択の際には薬剤耐性遺伝子検査の結果だけでなく 治療中断に至った理由も重要な情報となる HIV 感染妊婦において予防投与を行う時垂直感染予防を目的として母親に抗 HIV 薬の予防投与を行う際には薬剤耐性遺伝子検査を実施し 治療歴と併せて至適薬剤選択の指標にすることが推奨される また予防投与歴のある母親の治療を開始する際には予防投与で使用した薬剤歴および薬剤耐性遺伝子検査を実施し その結果を参考にして治療薬剤を選択することが推奨される 児への感染が確認された際は薬剤耐性遺伝子検査を実施し 母親の治療歴と併せて至適な薬剤選択の指標にすることが推奨される 補足 3: 針刺し事故など感染者血液に曝露した場合の予防的措置針刺し事故などHIV 感染血液への曝露が発生した場合は 針刺し事故に対するガイドラインに準ずる対応を基本とする 但し 薬剤耐性症例の血液に曝露した場合は 事故の状況に応じて 個別に対応していく この事例は検査の主目的が薬剤耐性遺伝子検査被験者の診断 治療ではないことから補足とした 薬剤耐性遺伝子検査に基づく被曝後薬剤予防投与薬剤の選択が感染予防にどれほど有効であるかは 現時点では報告事例がほとんどないことから明確ではない 今後の事例の収集が肝心である 10

11 付録 薬剤耐性遺伝子検査法 HIV 薬剤耐性遺伝子検査は体内で増殖しているHIVの遺伝子解析を行い 検出したアミノ酸変異のパターンをデータベースや評価アルゴリズムと照合して薬剤耐性の度合いを間接的に評価する方法である 測定手順は まず検体からのウイルス核酸 (RNA) の抽出を行い RT-PCR 法により標的遺伝子の増幅を行った後 ダイレクトシーケンスで塩基配列を決定するのが一般的である 現在 検査対象となっているのは pol 領域のプロテアーゼ (PR) 逆転写酵素(RT) 前半部 及びインテグラーゼ (IN) である ( 図 5) 通常 血中 HIV RNA 量が1000コピー /ml 以上であればサブタイプに関係なく μLの血漿 ( 血清も可 ) で検査可能である 血中 HIV RNA 量が1000コピー /mlより低値の場合でも検査は可能ではあるが 成功率は低くなる また 超遠心操作等の濃縮により 検査が可能になることもあるが その場合 1 1.5mLの血漿 ( 血清 ) が必要となる 尚 PCR 法の限界 そして HIV 本来の特性である遺伝的多様性の理由により 血中 HIV RNA 量の高低に関係なくプライマーのミスマッチのため遺伝子増幅が出来ないことがある 次に 薬剤耐性遺伝子検査により検出されたアミノ酸変異がどの抗 HIV 薬に対し耐性を示すのかを判定する必要がある 様々な臨床試験や in vitro 試験によりそれぞれの抗 HIV 薬とそれにより誘導されるアミノ酸変異のパターンが報告されている その報告には 大別すると以下の 3 種類がある a) 抗 HIV 薬とそれにより誘導される薬剤耐性関連アミノ酸変異を示したもの b) 臨床試験により確認された抗 HIV 薬で誘導される薬剤耐性アミノ酸変異と耐性度を示したもの c) 独自のアルゴリズムにより検出された薬剤耐性アミノ酸変異を総合的に評価し耐性度を示したもの以下にDHHSガイドラインでrecommended alternative regimenとして記載される薬剤の耐性変異について述べる vif tat nef 5 LTR gag pol rev vpu env 3 LTR PR RT RNase IN vpr C2V3 図 5 HIV-1 遺伝子と薬剤耐性遺伝子検査と指向性検査の解析領域 11

12 薬剤耐性関連アミノ酸変異リストと参考事項 ( 表 1) 各薬剤とそれに対する薬剤耐性変異をまとめた薬剤耐性変異リストが International Antiviral Society-USAよりほぼ毎年更新 報告されている [47] 但し この表では耐性レベルの評価は考慮されていないことに留意することが必要である codon No A.A in wild type M A K D T K L V F R (1) R (3) R V R E V A L K K V V Y F E Q V Y M Y G L T K C V/I (2) V/I F V codon No A.A in wild type M A K D T K L V F V A L K K V V Y F E Q V Y M Y G L T K C (4) L N R W Y/FQ/E (6) L R N R WY/FQ/E (4, 6) L N R WY/FQE L V ins R WY/FQ/E R V (5) V I L Y M codon No A.A in wild type M A K D T K L V F V A L K K V(9) V Y F E Q V Y M Y G L T K C P F M I P N/S M I C/I L S/A H L (8) I P N/S A/M I C/I C/L/H A L I G I E/H/P (7) I A/G/K/Q D/F/T C/I/V S/A L E/P A/G/K/Q/R L C/I/V L Y C I/L P P F F M M codon No A.A in wild type L V G K L D V L E M K M I G I F I Q D I L I H A G T L V V N I I N L L I I/F/V/C E R/M/I/T/V I I I/F/V Q I/L/V I/L V L L/Y L/V/M/T/A E V L/M/V V/I/T/L C/S/T/A A/T/F/I V V S M L/M I I F (11) (12) V V M/L P V V V (10) codon No A.A in wild type L V G K L D V L E M K M I G I F I Q D I L I I/R/V I (11) (12) V V/L V V/T S I/R/V M/R I I I I/L V V/T S/A F/I N I I/L (13) V/T F/I/R/V (14) I I/L V V L/V/M S (10) F/I/R/V M/R I I F I/L V/A V L V/L/A/M/T/S P V/T S V F I/L/V T L V A/M/V E K/R P H A G T L V V N I I V V V I A/F/T/S I A/F/T I A/F/S/T A/F/S/T A/F/T/S L/T D V V V V V V N L L I (14) D/S I/M/V M M M M M codon No A.A in wild type T L E T E G Y S Q N M Q A A/K A/S R/H/C H/K/R H I/A/K Q/C A G R/H/K H A/K S/A H codon No A.A in wild type G I V Q Q N N D/S V A/M/E R H T D 表 1 抗 HIV-1 薬剤と誘導される耐性変異のまとめ (2013.Mar 版 IAS-USA を元にした ) 12

13 (1) K65R は AZT 以外の全ての NRTI に対して耐性を呈する AZT に対してはむしろ感受性を高めるとされる [48] Thymidine analogue resistant mutation (TAM) との共存がしにくい事が報告されている [49, 50] それ以外にも M184V [51, 52] K70E とも共存しにくい事が報告されている [53] また この変異は Subtype C CRF01_AE において出やすいと報告されている [54] (2) M184V は単一で 3TC と FTC に対して高度耐性を呈する事が知られている ABC に対しては M184V 単独では数倍程度の耐性しか示さない M184V は K65R による TDF 耐性を相殺する しかし ddi と ABC の耐性レベルは増強するとされる さらに M184V と K65R の共存は fitness を著しく落とすことが報告されている [55] (3) ABC 耐性は単独では K65R+Y115F+M184V という組み合わせを取るが この組み合わせは高い耐性度を呈する 3TC 存在下では L74V+M184V を取るとされる [56] また L74V+Y115F+ M184V の組み合わせも ABC 耐性を呈する [57] (4) AZT により選択される変異 thymidine analogue related mutations (TAM) M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q は AZT 特異的に excision 効率を高め耐性を示すが 他の全てのヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤に対して ある程度 excision 効率を高め耐性になる事が知られている [58] (5) 近年新規に HIV/AIDS と診断された症例において T215C/D などの変異が観察されることがある 感染したウイルスが既に有していたいと推測されるが この変異自体は耐性変異では無い その起源については T215Y が AZT 等の投薬中止後に revert したものと考えられている T215C/D を有する HIV は AZT 耐性変異である T215Y/F を選択しやすいという報告もあるが まだ正確な意義は確定していない (6) TAM の集積により d4t 耐性になるが d4t は TAM を誘導しない d4t が誘導する耐性変異は長らく不明であったが 近年 CRF01_AE では K65R が選択されてくるという報告がなされている (7) K103N は EFV と NVP に対して高度耐性を呈する 我が国における新規 HIV/AIDS 診断症例の調査では 2 3% の症例に観察されており [27, 28] 新規診断時もしくは治療開始時に薬剤耐性検査を行い この変異が見られた際は EFV の投与を避けることが望ましい (8) A98G は subtype C と CRF02_AG に於いて頻度が高いとされている [59] A98S は subtype C に於いて耐性とする報告もあるが IAS-USA では取り上げられていない [60] (9) V106M は subtype C と CRF01_AE に於いて頻度が高いとされている [59] (10) LPV ATV DRV は複数の変異が集積することにより耐性を呈するようになる [61-63] (11) M36I は non-b subtype では野生型である [59, 64] (12) M46I/L は近年新規診断症例において観察されることがある変異である この変異は単独では高い耐性度を呈することはないため この変異の有無で治療を変えることは不要である [28] (13) I50L 変異は APV に対してはむしろ感受性を高める方向に働くとされる [65] (14) CRF01_AE では D30N は出現しない N88S は CRF01_AE で耐性を呈する [64] 13

14 薬剤別にみる薬剤耐性アミノ酸変異と耐性度 新規に抗 HIV 薬が開発 認可されるにあたり その効果を検討する臨床試験が行われる その ような臨床試験により明らかにされた薬剤耐性アミノ酸変異と耐性度に関する結果をここに記す 核酸系逆転写酵素阻害剤 (nucleos(t)ide analogue RT inhibitor:nrti) テノホビル tenofovir (TDF)( 商品名 : ビリアード 承認 2004 年 ) 高度耐性 : (1)K65R (2)T69ins + T215Y + (M41L, A62V, K70R, L210Wの内少なくとも2つ ) ラミブジン lamivudine (3TC)( 商品名 : エピビル 承認 1997 年 ) エムトリシタビン emtricitabine(ftc)( 商品名 : エムトリバ 承認 2005 年 ) 高度耐性 : (1) M184V/I (2) T69ins + T215Y + (M41L, A62V, K70R, L210Wの内少なくとも2つ ) 中度耐性 : (1) T69ins + T215Y 軽度耐性 : (1) E44D/A + V118I (2) Q151M complex (3) K70E (4) T69ins アバカビル abacavir (ABC)( 商品名 : ザイアジェン 承認 1999 年 ) [66] 高度耐性 : (1) M41L + D67N + L74V + M184V/I + L210W + T215Y/F (2) Q151M + F77L + (A62V, V75I, F116Yの内少なくとも1つ ) (3) T69ins + T215Y + (M41L, A62V, K70R, L210Wの内少なくとも2つ ) 中度耐性 : (1)M184V + (K65R, L74V, Y115Fの内 2つ以上 ) (2) T69ins + T215Y (3) Q151M + F77L 軽度耐性 : (1) M41L + E44D + D67N + L210W + T215Y/F (2) M41L + D67N + V118I + L210W + T215Y/F (3) M41L + D67N + L210W + T215Y/F (4) Q151M complex (5) T69ins 非核酸系逆転写酵素阻害剤 (non-nucleoside RT inhibitor:nnrti) エファビレンツ efavirenz (EFV)( 商品名 : ストックリン 承認 1999 年 ) 高度耐性 : (1)L100I, K103N, V106M, Y188L, G190C/Q/T/Sの内少なくとも1つ軽度耐性 : (1)G190E, M230L 14

15 エトラビリン etravirine (ETV)( 商品名 : インテレンス 承認 2009 年 ) [67] 可塑性に富むdiarylpyrimidine(DAPY) 構造をもっており NVPやEFV 耐性変異ウイルスにも有効とされる In vitroではnvp, EFV 耐性ウイルスの97% に対して有効性を呈しており また DUET studyではnvp, EFV 耐性症例に対する有効性が確認されている [68] 複数の変異集積により臨床的に問題となる耐性レベルを呈する様になる [69-71] 中 高度耐性 : (1)V90I, A98G, L100I, K101E/H/I/P/R, V106I, V179D/F/I/L/M/Tの内 4 個以上の集積 (2) Y181C/I, G190A/S, M230L (3)L100I + K103N + Y181C(43 倍 ) (4)V179F + Y181C(130 倍 ) (5)Y181C + H221Y (6) Y181V 軽度耐性 : (1)L100I, V179F/I, Y181C, G190F, M230L, Y318Fの内少なくとも1つ リルピビリン rilpivirine(rpv)( 商品名 : エジュラント 承認 2012 年 ) RPVはETV 同様に可塑性に富むdiarylpyrimidine(DAPY) 構造をもつNNRTIであり 野生株ならびに既存のNNRTIであるNVPやEFVに対して薬剤耐性を獲得したHIVにも有効性を示す [72] ECHO[73] 及びTHRIVE [74] study からはK101E/P E138A/G/K/Q/R V179L, Y181C/I/V, H221Y, F227C, M230I/Lの15 個の変異がRPV 耐性に関与すると報告されている 一番多く観察されたのが E138Kで 多くの場合 M184Iを伴っていた また これらの変異の殆どは単独で高度耐性を示すことは無く 複数の組み合わせにより臨床的に問題となる耐性レベルを獲得すると考えられる まだ臨床的な情報が不足しているが in vitro の解析では以下のパターンで10 倍以上の耐性を獲得することが報告されている [72] 中 高度耐性 : (1) E138K+M184I (2) K101P (3)K103N+Y181I (4)L100I+K103N+Y181C プロテアーゼ阻害剤 (protease inhibitor:pi) 現在用いられているPIは2000 年以降に登場してきたものであるが それ以前のサキナビル インジナビル ネルフィナビルの様に少数のmajor 変異の獲得により耐性を獲得するのではなく 複数の耐性変異の集積により臨床的に問題となる耐性を呈することが特徴的である [61-63] アタザナビル atazanavir (ATV)( 商品名 : レイアタッツ 承認 2003 年 ) [75] 中 高度耐性 :(1) L10I/V/F, K20R/M/I, L24I, L33I/F/V, M36I/L/V, M46I/L, G48V, 154V/L, L63P, A7IV/T/I, G73C/S/T/A, V82A/F/S/T, I84V, L90Mの内 5 個以上の集積 15

16 ロピナビル lopinavir (LPV)( 商品名 : カレトラ 承認 2000 年 ) [76] 中 高度耐性 :(1) (I50V, I54A/M/S/T/V, V82A/F/Sの内いずれか1つ ) + (L10F/I, GI6E, K20I/M, V32I, L33F, E34Q, K43T, M46I/L, I47V, G48M/V, I50V, I54A/M/S/T/V, Q58E, L63T, G73T, T74S, V82A1F/S, L89I/Mの内 5 個以上の集積 ) (2) L10F/I, G16E, K20I/M, V32I, L33F, E34Q, K43T, M46I/L, 47V, G48M/V, I50V, I54A/M/S/T/V, Q58E, L63T, G73T, T74S, V82A/F/S, L89I/Mの内 7 個以上の集積 ダルナビル darunavir (DRV)( 商品名 : プリジスタ 承認 2007 年 ) [77] 既存のPIを含むART 治療で治療失敗を経験した患者に有効である [78-80] プロテアーゼの主鎖と結合する様にデザインされており 耐性を獲得しにくい また 基質との競合阻害に加えてプロテアーゼの 2 量体を阻害する 中 高度耐性 : (1)I50VもしくはV32I + I47V (2)I50V + I54L + L76V (3)L33F + I54M +I47V + T74P + I84V (4) V11I, V32I, L33F, I47V, I50V, I54L/M, T74P, L76V, I84V, L89Vの内 4 個以上の集積軽度耐性 : (1)V11I, V32I, L33F, I47V, I50V, I54L/M, T74P, L76V, I84V, L89Vの内 3 個以上の集積 インテグラーゼ阻害剤 (integrase strard transfer inhibitor:insti) ラルテグラビル raltegravir (RAL) ( 商品名 : アイセントレス 承認 2008 年 ) [81] RAL 耐性には大まかに3つの経路 (Y143C/H/R Q148R/H/K N155H) が知られている [82, 83] 過去にウイルス学的治療失敗の履歴がある症例ではラルテグラビル変更による失敗率が高い事が明らかにされた 一方 治療失敗履歴の無い症例では有意な差は認められなかった [84] 高度耐性 : (1) Y143C/H/R Y143R/C/H 単独では低 中程度の耐性であるが T97A, S230Rを伴う事により150 倍以上の高度耐性になる [85] (2) G140S+Q148R/H/K 高い確率でG140S を伴うが これにより耐性度が高まるとともに複製能力が改善する [83, 86] (3) N155H 高い確率でE92Q を伴うが これにより耐性度が高まるとともに複製能力が改善する 16

17 エルビテグラビル elvitegravir (EVG) ( 商品名 : スタリビルド 承認 2013 年 ) [87] EVGは 2 つ目のインテグラーゼ阻害剤として 2013 年に承認された 尚 薬剤は TDF/FTC/EVG/cobisistatの合剤としての販売のみで 単剤で使用することは出来ない EVGはY143Xを誘導しないが 伴う2 次変異の種類により中程度の交差耐性を示すとされる [85] 下記に示す様にRAL 治療に失敗した症例にはEVGの使用は効果が期待できない [88] 高度耐性 : (1) G140S+Q148R/H/K 中程度耐性 : (2) E92Q この変異単独では RAL 耐性を示さないが EVGに対しては 50 倍以上の耐性を呈する (3) N155H (4) T66I/A T66Iは33 倍耐性 T66Aは数倍 ( 軽度耐性 ) 上記以外にも H114Y, L74M, A128T, E138K, S230R, R20K 等の変異がin vitroの耐性誘導実験では観察されている ドルテグラビル dolutegravir (DTG) ( 商品名 : テビケイ 承認 2014 年 ) [89] DTGは3 番目のインテグラーゼ阻害剤として2013 年 12 月にFDAに承認された この薬剤の最大の特徴は先行するRAL EVG に対する耐性変異に対してほとんど交差耐性を示さない事 そしてDTGに対して高度耐性を示す変異も現在のところ見つかっていない事である 現時点では DTG 失敗症例にR263Kが観察されたことが報告されており in vitro の耐性誘導においてR263Kが軽度の耐性を示し 2 次変異のM50Iが加わるとその耐性度が高まることも示された その一方でこれらの耐性によりウイルスの増殖能が低下することも示唆されている [90, 91] 他にもin vitro の耐性誘導ではL101I/T, T124A/S, S153A/F が出現するが これらの変異はnatural polymorphismとして存在する可能性があり その臨床的評価については現時点では不明である またG140S/Q148HにT97A, M154IやV201Iが加わると耐性度は高まる [92] Q148H/Rから耐性誘導を始めるとV75I/E138K/G140S/M154Iが集積する RAL 耐性症例を対象にした臨床試験では Q148H+1つ以上の関連変異を獲得した症例で DTG 治療の有効性の低下が認められた CCR5 阻害剤マラビロク maraviroc (MVC)( 商品名 : シーエルセントリ 承認 2007 年 ) [93] MVCはHIVのco-receptor CCR5を標的にした侵入阻害剤である 有効性がCCR5 指向性 HIVに限定される事から投与前にウイルスの 指向性検査 が必要である MVC 耐性 (X4 指向性へのスイッチを省く ) に関してはgp120のV3 領域および CCR5の N 末端が結合するV3の基部周辺 (V4など) 等幾つか報告されているが 情報は限定されており耐性のメカニズムはいまだ不明な部分が多い [94, 95] * 指向性検査に関する記述 判定方法に関しては後述の 指向性検査 を参照のこと 17

18 アルゴリズムを取り入れた薬剤耐性遺伝子検査の評価方法薬剤耐性遺伝子検査によって得られる情報は感染者血中ウイルスのプロテアーゼ 逆転写酵素 あるいはインテグラーゼに観察されたアミノ酸置換の種類となるが そのままではどの程度の耐性を示すのか判断は難しい 薬剤耐性遺伝子検査の結果をより理解し易くするために用いるのが 薬剤耐性評価のアルゴリズムである 獲得した変異のパターンから薬剤耐性のレベルを評価する研究は競争の激しい分野であり 多くのグループが独自の考え方に基づいてアルゴリズムを考案している 一般に公開され使用が可能なものとしては以下が挙げられる 1. スタンフォード薬剤耐性データベース ( 2. The Agence Nationale de Recherche sur le SIDA (ANRS) 薬剤耐性評価 ( 3. Rega Institute in Leuven Belgiumの研究グループが開発したものスタンフォード薬剤耐性データベースの評価は薬剤耐性に寄与する度合いによって変異毎に点数が決められており これを合計することによる総合点数の大小で耐性レベルを判定する ( スコアリング ) これに対して ANRSとREGAのものは耐性変異の組み合わせのパターンに基づき耐性を推定する 一般には公開されていないが この他に検査会社や薬剤耐性遺伝子検査キットを販売している会社が独自に開発した評価方法が幾つかある ユニークなものとして米国 VIRCO 社が開発したヴァーチャル フェノタイピングがある この方法は同社が提供している薬剤感受性検査の結果と遺伝子検査の結果を対比させるかたちでデータベースに登録し 遺伝子配列の最も近いものを検索して推測する方法である ( データベース検索 ) この他 新たな試みとして neural network を用いた 薬剤耐性症例の治療結果予測システムを開発している英国の研究グループHIV resistance response database initiative (RDI) がある ( 使用する評価方法により同じアミノ酸配列であっても異なる結果が導き出されることがある 今までに幾つかの研究グループがアルゴリズム間の違いを解析し報告をしている Revela 等は4 つのアルゴリズム (ANRS, Stanford, Rega and Bayer) を用いて同じアミノ酸配列の評価を行った [96] その結果評価が4つのアルゴリズム全てで一致したものは 66.4% 結果が多少乖離したもの ( 感受性が軽度耐性 軽度耐性が耐性 ) は29.2% であった つまり 95% はどの方法を用いても概ね一致した評価が得られたことになる その一方で5% については全く異なる評価結果 ( 感受性が耐性 ) が得られており 更なる解析プログラムの精度の向上が必要と思われる 現在のところいずれの評価アルゴリズムもサブタイプ Bを主に作られており サブタイプの違いが評価の結果を左右することが指摘されている [97] 我が国ではサブタイプBに次いでCRF01_AE 症例が多いことから 今後 CRF01_AEの評価方法について取り組んでいくことが必要と思われる 18

19 Stanford 大学 Medical Centerの研究チームが公開している HIV 薬剤耐性データベース ( の利用方法 ( 図 6) このサイトはインターネット上で一般に公開されており 時に難解な薬剤耐性の評価を理解し易い形で提示し 利用者にとって解釈が容易であるため広く用いられている この利用法について紹介する (1) データの入力トップページ ( 図 6) 右上に表示される HIV db PROGRAM のアイコンをクリックすると 図 7のような薬剤耐性解析のためのページに切り替わる ここでは以下 2 種類のデータ入力方法が準備されている 図 6 HIV 薬剤耐性データベースのトップページ 図 7 解析方法の選択画面 19

20 1. 耐性変異の入力 : ANALYSIS MUTATION LIST ( 図 7 1) すでに薬剤耐性アミノ酸変異の情報を持っている場合に便利な方法である 図 8の解析画面で それぞれのアミノ酸配列のプルダウンメニューを操作して どのアミノ酸がどのように変化したかを入力する ( 例 :RT65 番目のリシン (K) がアルギニン (R) に変異した場合 RTの65 番目のアミノ酸のプルダウンメニューをクリックし リストの中に現れる R を選ぶ 3の矢印を参照のこと ) 全ての変異の入力が終わったら 画面右下にある黄色いアイコン 4の ANALYZE をクリックすると 結果画面 ( 図 9) が現れる 図 8 左下の Identifier の欄には必要に応じてサンプル名を入力できる 同じく左下の Date の欄には解析日などを入力できる 2. 遺伝子配列からの評価 : ANALYSIS SEQUENCES ( 図 7 2) この方法では遺伝子配列をアミノ酸配列に翻訳する必要が無く アミノ酸変異を1つずつ入力する手間も省け便利である またFASTA 形式 ( 註 3) であれば複数の配列を同時に入力する事ができ どの領域の配列であるかも自動的に認識し解析される上 RT PR 及びIN 各々の領域についてサブタイプの判定も可能である ( 註 5) 図 7の2のアイコンをクリックすると 図 10に示すようなデータ入力画面が表示される データ入力には A B C の3 通りの方法がある 簡便なのは A の TEXT INPUT で 白枠(5) の中に解析したRT PRあるいはINの遺伝子塩基配列を直接コピー & 図 8 薬剤耐性変異アミノ酸の入力画面 20

21 図 9 薬剤耐性度の結果表示画面 図 10 シーケンスデータの入力画面 21

22 ペーストで入力する方法である 遺伝子配列を入力後 右下の黄色いアイコン 6 の ANALYZE をクリックすると 結果画面が現れる B では FASTA 形式で保存した配列 ファイルをアップロードして解析する事が出来る (2) 結果の表示 :( 図 9) 薬剤耐性度のレベルは獲得スコア ( 註 4) に応じて薬剤ごと以下の5 段階で表示される Susceptible ( スコア :0 9) Potential low-level resistance( スコア :10 14) Low-level resistance( スコア :15 29) Intermediate resistance( スコア :30 59) High-level resistance( スコア :60 以上 ) 尚 遺伝子配列から解析した場合はサブタイプの結果も画面内に表示される ( 註 5) 註 3:FASTA 形式とは以下の形式で記載された遺伝子情報である > サンプル名 サンプル情報 ( 簡単な情報を入れられる ) ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG. 例 ) >1234ABCD HIV PRRT 1017bps AATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGAGTTTTTAGATGGAATAGATAAG.. >5678EFGH HIV PRRT 1017bps AATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGAGTTTTTAGATGGAATAGATAAG.. 註 4: スコアスコア表の数値は別リンクとなっており 数値をクリックすると別ウィンドウで各薬剤に対する耐性変異に関する情報や文献が表示される 文献へのリンクも貼ってあり PubMedでの文献取得も一部は可能である 結果画面は図 9とほぼ同様で 遺伝子配列から読み取った薬剤耐性変異アミノ酸と各薬剤に対する耐性度が5 段階で評価される 註 5: サブタイピングについて このデータベースのプログラムで得られるサブタイプの結果はあくまでも参考値であり 正確なサブタイプの判定には系統樹解析が必要である 22

23 指向性検査 Geno2pheno[coreceptor] 1. Trofile から遺伝子型による判定へマラビロクの使用にあたっては 指向性検査 を行いCCR5 指向性 (R5) ウイルスの感染であることを確認する必要がある これまで 指向性検査 として米国モノグラムサイエンス社 [98] が Trofile というフェノタイプ試験を行ってきたが Beerenwinkel 等は 遺伝子型と表現型が一致した1100 例のデータに基づき 遺伝子型からX4 指向性の確率を評価する Geno2pheno[coreceptor]( 以下 G2P) を構築した ( 図 11) このサイトでは HIVのgp120 のV3 領域を含む塩基配列を入力すると自動的にCXCR4 指向性 (X4) が誤ってCCR5 指向性と判定される確率をFalse Positive Rate(FPR) として表示する また 指定したFPR cut offに従いccr5 阻害剤が有効かどうか ( 結果例 ; 図 12a b) の結果を表示する 図 11 Geno2pheno[coreceptor] サイトトップページ及びデータ入力画面 23

24 図 12a R5 指向性 図 12b X4 指向性 図 12 指向性の判定結果表示画面 2. Cut-off 値 Cut offに関してmotivate [99] Study1029 [100] あるいはMERIT studyの症例再解 [101] 析では5.75% European guidelinesでは10% [102] など複数の数値が提案されているが 臨床的なデータに基づく根拠があるのは現時点では MOTIVATE/1029 再解析研究の5.75% しかない 尚 この再解析研究では % の症例群も5.75% 以上の症例群と互角の臨床成績を呈しており2 5.75% の範囲でもマラビロクの使用が考慮に値すると思われる しかしながら 2% 以下の症例の臨床成績はTrofileでX4と判定されたものと一致しており マラビロク使用には一考が必要であろう 一方 European guidelinesの10% という閾値に関しては原文にも Although a G2P cutoff (false-positive rate) of 5.75% was a good predictor of a sustained response in retrospective analyses of clinical trial data, the panel has concerns for direct translation of these data into routine clinical practice and prefers to advise a more conservative higher false-positive rate cutoff. とあるように科学的 臨床的な根拠はなく あくまでも5.75% という数値を基点に より安全な数値を選んだに過ぎない また FPRの数値の評価は感染初期と病気が進行した状況では異なる可能性があり さらには血清中の HIV RNAで検査した場合と末梢血単核球から抽出された proviral DNA で検査した場合とでも評価が変わってくる可能性がある いずれにせよ FPRと治療効果の関連を示す臨床情報が不足している現状ではこれ以上の議論は困難であり 本ガイドラインでは FPR の判定を図 13のように提案する 24

25 図 13 指向性検査の判定に用いられる cut-off 値のまとめ 3. サブタイプによる判定基準の違いについて本邦ではサブタイプBに次いでCRF01_AEによる感染が多いが CRF01_AEにおいてG2P の判定が適用できるか結論が出ていない Los Alamos HIV Sequence Databaseに登録されたV3 配列および我々が検査した範囲では CRF01_AEはG2PでX4 指向性と判定される割合がサブタイプBよりも高いことがわかっている CRF01_AE 症例でマラビロクの使用を検討する際は FPRの数値に加えて病期 CD4 陽性 Tリンパ球数 血中 HIV RNA 量などの臨床情報を重視することが望ましい 4. Geno2pheno 以外の判定アルゴリズム遺伝子型により指向性を推定する方法としては G2P 以外にも数種類が知られており ウェブサイトから自由に利用することができる Fortinbras PSSM ( では Jensen 等が構築したPSSM(position-specific scoring matrices) [103, 104] [105] とPoveda 等によるその改良法が利用可能である PSSMは MOTIVATEにおいて G2Pと並んで指向性評価に用いられた その他 Wetcat ( では C4.5 C4.5with positions 8 to 12 only, PART, SVM, Charge Ruleの各ソフトが利用可能であるが [106] 最近の臨床研究ではほとんど利用されていない これらの指向性判定アルゴリズムの比較評価に関する研究が2008 年に報告されている 25

26 5. 指向性検査のタイミングと検体 ( 図 14) 指向性検査は以下のタイミングで施行することが推奨される 1) 初回治療もしくはサルベージ治療としてCCR5 阻害剤の使用を考慮する時 2) CCR5 阻害剤の使用で十分な抑制が認められない時 3) 経過が良好であってもCCR5 阻害剤を含む治療に切り替える場合 指向性遺伝子検査は血中 HIV RNA 末梢血単核球中のHIV DNAいずれからも実施をすることは可能であるが 血中 HIV RNAからの解析は血中 HIV RNAコピー数に大きく依存し 一般に血中 HIV RNAが <1000コピー /mlの場合 血中 HIV RNAからの解析成功率は大きく下がる 一方 HIV DNAはVLが低くとも解析に成功する確率が高い このことから本ガイドラインでは血中 HIV RNA 量が1000コピー /ml 以上の場合はRNAからの検査を 1000コピー /mlを下回る場合はdnaからの解析を推奨する ( 図 15) 尚 長期間に渡りVLが検出限界以下を維持しているような経過が良好な症例では HIV DNAからの検査の場合でもHIVの遺伝子増幅がうまくいかず解析できない場合があるため 検査会社あるいは巻末の研究機関等に相談されたい 図 14 指向性遺伝子検査を行うタイミング 図 15 指向性遺伝子検査実施の際に用いる検体 鋳型 26

27 参考文献 1. Durant, J., et al., Drug-resistance genotyping in HIV-1 therapy: the VIRADAPT randomised controlled trial. Lancet, (9171): p Clevenbergh, P., et al., Persisting long-term benefit of genotype-guided treatment for HIV-infected patients failing HAART. The Viradapt Study: week 48 follow-up. Antivir Ther, (1): p Baxter, J.D., et al., A randomized study of antiretroviral management based on plasma genotypic antiretroviral resistance testing in patients failing therapy. CPCRA 046 Study Team for the Terry Beirn Community Programs for Clinical Research on AIDS. AIDS, (9): p. F Cingolani, A., et al., Usefulness of monitoring HIV drug resistance and adherence in individuals failing highly active antiretroviral therapy: a randomized study (ARGENTA). AIDS, (3): p De Luca, A., et al., Three-year clinical outcomes of resistance genotyping and expert advice: extended follow-up of the Argenta trial. 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31 HIV 薬剤耐性遺伝子検査に関する問い合わせ先 札幌仙台新潟さいたま東京茅ヶ崎横浜名古屋大阪福岡沖縄 北海道大学大学院保健科学研究院 病態解析学 吉田繁独立行政法人国立病院機構仙台医療センター 伊藤俊広新潟大学医歯学総合病院感染管理部 田邊嘉也埼玉県衛生研究所ウイルス担当 内田和江東京都健康安全研究センター微生物部 貞升健志独立行政法人国立国際医療研究センターエイズ治療 研究開発センター 潟永博之神奈川県衛生研究所微生物部 近藤真規子横浜市立大学大学院医学研究科病態免疫制御内科学 上田敦久独立行政法人国立病院機構名古屋医療センター 杉浦亙独立行政法人国立病院機構大阪医療センター 白阪琢磨大阪府立公衆衛生研究所ウイルス課 森治代独立行政法人国立病院機構九州医療センター 南留美琉球大学大学院感染症 呼吸器 消化器内科学 健山正男 31

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