新技術説明会　様式例

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たつぞうさくもと
5 years ago
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1 1 大腸菌を用いたバイオマスからの有用物質生産と大規模な代謝経路解析独立行政法人産業技術総合研究所生物プロセス研究部門バイオマスリファイナリー研究センター主任研究員中島信孝

2 背景微生物による物質生産はバイオマス ( 再生可能な生物由来の資源 ) を原料として温和な条件下で行われるそのため従来の化学的に物質を合成する方法に対して低環境負荷省エネルギーである世界で最も研究が進んでいる微生物である大腸菌を用いて有用物質を生産するしかし天然の大腸菌のままでは有用物質生産に向かないことから遺伝子組換え技術を駆使しその代謝経路に改変を施す必要があるバイオマス安価再生可能大腸菌代謝経路有用物質高価 2

3 3 研究のポイント代謝経路改変に必要な多彩な遺伝子組換え技術を開発その例として遺伝子大量発現技術遺伝子サイレンシング技術生産の実例として工業価値が高いピルビン酸とイソブタノールを生産

4 4 代謝改変技術 2: ユニークな遺伝子大量発現技術非常に安価な発現誘導剤を用いる方法環状プラスミドを用いない抗生物質が不要な方法発現誘導剤誘導型プロモーター異種遺伝子誘導型プロモーター異種遺伝子 B 誘導型プロモーター異種遺伝子

5 5 代謝改変技術 3: 世界最高効率の遺伝子サイレンシング技術細菌にRNi 機構は発見されていないが一本鎖 antisense RN (asrn) によるノックダウンは機能する DN Ribosome mrn asrn IPT 誘導型 asrn 発現ベクター RNase

6 6 代謝改変技術 3: 世界最高効率の遺伝子サイレンシング技術 mp r phn kb pbr322 ori Kan r laci q P trc MS laci q ps101 H ori phn kb P trc inverted repeat py laci q ori phn kb RK2 ori hl r phn kb pr r P trc laci q P trc N N N N 5' N N N N antisense seq. pairedtermini

7 代謝改変技術 4: 炭素代謝に関する 71 遺伝子の asrn 発現ベクターを全て作成 phospho-enolpyruvate {PTS} glk glucose pyruvate glucose-6-phosphate pfk etc. gcd zwf glucono-1,5-lactone 6-gluco-Dgluconate {PPP, EDP} ppc acetate poxb phospho-enolpyruvate pps pyruvate pyk, pykf ldh lactate ack sfc, maeb pflb acetylphosphate pta acetyl-o oxaloacetate malate T [aceef-lpd] adhe citrate glt acn etc. ethanol acc {fatty acid synthesis} out in {F o F 1 } [atpibef HD] TP H + H + global transcription regulator arc: anaerobic fnr: anaerobic cra: gluconeogenesis mlc: glucose metabolism H e - H 2 {ETS} [cyobde], [cydb] ND + NDH DP [nuobdefhijklmn], ndh 7

8 8 ピルビン酸の生産について H 医薬品の原材料や食品添加物などとして利用される反応性に富み様々な物質の基になる基幹物質現在の市場価格は 1 kg あたり 2,000 円程工業的に有機化学法微生物発酵法両方で生産されている

9 9 ピルビン酸の生産経路ブドウ糖グルコース 6 リン酸酢酸 poxb ピルビン酸 ldh 乳酸 pflb aceef-lpd アセチル -o アセトアルデヒドエタノールクエン酸回路 asrn によるサイレンシング遺伝子破壊

10 Pyruvate (g/l) glucose 20 g/l, acetate 5 g/l glucose 20 g/l, acetate 5 g/l, MPS 0.1 M glucose 35 g/l, acetate 5 g/l, MPS 0.1 M glucose 35 g/l, acetate 5 g/l, MPS 0.1 M, Yeast Extract 2.5 g/l glucose 40 g/l, acetate 3 g/l, Yeast Extract 2.5 g/l etc. 10 試薬グルコースからのピルビン酸生産実証 M9 salts 培地 ulture time; hrs

11 Pyruvate (g/l) 11 試薬グルコースとスギ糖化液でのピルビン酸生産グルコース 12 酢酸ピルビン酸乳酸 8 4 アセチル -o 遺伝子過剰発現遺伝子破壊アンチセンス RN でのサイレンシング 0 試薬 glucose 野生株スギ糖化液改変株

12 12 71 個の asrn 発現ベクターによる包括的な中央代謝経路解析 gene compound name increase/ decrease fold acee pyrvate 146 fumarate 0.02 acetate 1.68 acn pyrvate 45.8 fumarate 0.59 pflb pyrvate 15 acetate 0.5

13 13 phospho-enolpyruvate pyruvate ピルビン酸生産に影響のある遺伝子 {PTS} glucose glk glucose-6-phosphate pfk etc. gcd zwf glucono-1,5-lactone 6-gluco-Dgluconate {PPP, EDP} ppc phospho-enolpyruvate acetate poxb pps pyruvate pyk, pykf ldh lactate ack sfc, maeb pflb acetylphosphate pta acetyl-o oxaloacetate malate T [aceef-lpd] adhe citrate glt acn etc. ethanol acc {fatty acid synthesis} global transcription regulator arc: anaerobic fnr: anaerobic cra: gluconeogenesis mlc: glucose metabolism H + H e - H 2 out {ETS} [cyobde], in {F o F 1 } [cydb] [atpibef ND + NDH HD] TP DP [nuobdefhijklmn], H + ndh

14 14 イソブタノールの生産について燃料として isobutanol/butanol を ethanol と比較する H H H エネルギー密度が30% 大きい腐食性が低いガソリン軽油との混合が容易蒸気圧が低い既存のインフラを使って輸送貯蔵が可能

15 15 イソブタノールの生産経路 glucose 2-ketoisovalerate valine, leucine, pantothenate kivd (L. lactis) acetate poxb pyruvate ldh lactate isobutylaldehyde pflb aceef-lpd DH2 (S. cerevisiae) ack-pta isobutanol acetyl-o adhe ethanol 異種遺伝子発現 T 同種遺伝子発現遺伝子破壊

16 isobutanol (g/l) glucose (g/l) 16 試薬グルコースからのイソブタノール生産実証 time (hrs) time (hrs) M9 salts + 40 g/l glucose + 5 g/l yeast extract semi-aerobic

17 ピルビン酸想定される用途イソブタノールコハク酸 ( カルボン酸 ) アラニン ( アミノ酸 ) エタノール ( アルコール ) 他酢酸アセトイン脂肪酸関連物質イソプレノイド関連物質各種タンパク質など 17

18 18 想定される用途 : ピルビン酸誘導体糖リグノセルロースバイオマスピルビン酸エステル類アラニン IPP DMP PP H PP NH 2 フマル酸化学的にエステル化 +1 酵素 +7 酵素 H +1 酵素 H H H +1 酵素 (+ bezaldehyde) +1 酵素 H H H ベンジルアルコール +1 酵素リンゴ酸 H +1 酵素 (+ bezaldehyde) ピルビン酸 H +5 酵素 +2 酵素 H コハク酸 H +1 酵素 H 2,3-ブタンジオール L-phenylacetylcarbinol H イソブタノールアセトイン

19 19 実用化に向けた課題微生物での物質生産の最大の問題はコスト生産量を上げる生産時間を短くする培地成分を簡素化するなどの工夫が必要今後様々な物質の生産に対応できるようさらなる遺伝子改変技術の開発が必要実バイオマスを用いた実証研究が必要

20 20 企業への期待どのような物質を生産させたらよいかを判断するのが研究者ではとても困難企業との連携によって生産すべき物質を見極め実用化まで漕ぎ着きたい

21 21 本技術に関する知的財産権大腸菌において混合糖から有機物質を生産する方法特願 H23/06/24 出願特開 H25/01/10 公開中島信孝田村具博独立行政法人産業技術総合研究所細菌の中央代謝経路を解析する方法及び該方法に用いるアンチセンス RN 発現ベクターのセット特願 H24/09/11 出願中島信孝田村具博独立行政法人産業技術総合研究所

22 22 お問い合わせ先 ( 独 ) 産業技術総合研究所ライフサイエンス分野研究企画室 TEL FX life-liaison-ml@aist.go.jp

PowerPoint プレゼンテーション

PowerPoint プレゼンテーション応用微生物学 ( 第 2 回 ) アルコール微生物による物質生産のための Driving Force 1. ガス状分子の放出 2. 不可逆的反応あるいはポリマー化反応の存在 3.Futile cycle による ATP の消費あるいは ATP シンターゼの破壊 (ATP 生成が関与している場合 ) 4. 外部 sink への電子授受 5. 相分離による生産物除去 Appl. Environ. Microbiol.,

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