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ゆたかしんまつ
5 years ago
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1 第一回生態影響試験チャレンジテスト ( 国立環境研究所の結果 ) 阿部良子 1 山岸隆博 1 堀江好文 2 渡部春奈 1 山本裕史 1 鑪迫典久 1 1 国立研究開発法人国立環境研究所 2 秋田県立大学

2 方法 ( 模擬排水の作成 ) 複数工場排水混合 130L ろ過後分配各試験機関に配送画像 : 至福の隙間 500mL~6L ph DO(mg/L) 電気伝導度 (ms/m) 塩分 (%) 7.75(26.4 の時 )

3 方法 ( 試験スケジュールと参加機関 ) 参加者募集平成 29 年 2 月 6 日 ~2 月 28 日 15 時まで民間企業 (GLP) 公的機関大学 ( 国環研含む ) 地環研総参加機関 14(4) 参加者確定試験排水調製と配布試験実施 3 月上旬 3 月中旬排水到着から5 月 8 日までの適当な時期国環研, 18 分析, 3 総試験数 83 ムレミカヅキモ生態影響試験, 12 ニセネコゼミジンコ生態影響試験, 9 試験結果データ送付 5 月 8 日必着その他生態影響試験, 30 ゼブラフィッシュ生態影響試験, 11 試験結果発表第 26 回環境化学討論会ムレミカヅキモ生態影響試験ゼブラフィッシュ生態影響試験ニセネコゼミジンコ生態影響試験その他生態影響試験国環研分析 2

チャレンジテスト国環研での試験一覧試験法 1 魚類胚仔魚期毒性試験 2 ニセネコゼミジンコ繁殖試験 3 藻類成長阻害試験 4 ヨコエビ急性毒性試験

藻類クロロフィル遅延発光試験 (2 種 ) 9 Microtox 試験 10 ホウネンエビ亜致死毒性試験 (RAPIDTOXKIT F) 11

ツボワムシ短期慢性毒性試験 (Short-chronic ROTOXKIT F) 14 繊毛虫慢性毒性試験 (Chronic PROTOXKIT F)

4 チャレンジテスト国環研での試験一覧試験法 1 魚類胚仔魚期毒性試験 2 ニセネコゼミジンコ繁殖試験 3 藻類成長阻害試験 4 ヨコエビ急性毒性試験 5 OECD TG203 (100% のみの限度試験 ) 6 メダカイムノクロマトビテロジェニンアッセイ 7 海産藻類生長阻害試験 8 藻類クロロフィル遅延発光試験 (2 種 ) 9 Microtox 試験 10 ホウネンエビ亜致死毒性試験 (RAPIDTOXKIT F) 11 ホウネンエビ急性毒性試験 (THAMNOTOXKIT F) 12 ツボワムシ急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT F) 13 ツボワムシ短期慢性毒性試験 (Short-chronic ROTOXKIT F) 14 繊毛虫慢性毒性試験 (Chronic PROTOXKIT F) 15 カイミジンコ亜慢性毒性試験 16 海産珪藻類生長阻害試験 (MARINE ALGALTOXKIT) 17 シオミズツボワムシ急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT M) 3

ヨコエビ 96 時間急性試験 (Environment Canada 2013) (Hyalella azteca) ヨコエビ96

観察は24 時間ごと ) 濃度区対照区 5, 10, 20, 40, 80% 試験生物数 10 頭 /1 容器 3 連試験溶液脱塩素水

5 ヨコエビ 96 時間急性試験 (Environment Canada 2013) (Hyalella azteca) ヨコエビ96 時間急性試験供試生物ヨコエビの生後 1~4 日の仔虫を 2 日間給餌し馴化して生後 3~6 日となったもの曝露期間 96 時間 ( 観察は24 時間ごと ) 濃度区対照区 5, 10, 20, 40, 80% 試験生物数 10 頭 /1 容器 3 連試験溶液脱塩素水試験液量 200 ml 約 3 cm 平方のナイロンメッシュ1 枚試験容器 300 mlトールビーカー明暗周期 16 時間明 8 時間暗換水なし給餌試験開始前と48 時間後に YCT 0.5 ml/ 容器エンドポイント生死 ( 生存 ) LC 50 ( 半数致死濃度 ) 解析手法対数ロジスティック法試験成立条件対照区に10% を超過した致死が認められないこと 5% 10% 20% 40% 80% 繰り返し 3 連 4

6 OECD TG203 (100% のみの限度試験 ) 生存率 (%) 試験条件 OECD TG203 供試生物ばく露方式ゼブラフィッシュ (Danio rerio) 半止水式試験期間 96 時間水温 (ºC) 26±1 光条件室内光レベル, 白色蛍光, 16 時間明 : 8 時間暗試験用水 ( 対照区 ) 活性炭ろ過水道水試験容器試料量 / 容器生物数 / 容器繰り返し濃度区 5L 容ガラス製水槽 3L 10 個体 ( オス5, メス5) 1 連 1 濃度区 ( 排水濃度 100% の限度試験 ) H 24H 48H 72H 96H 供試生物の齢給餌換水エンドポイント 2cm 前後の成魚なし毎日生存率 5

/ 容器繰り返し濃度区供試生物の齢 5L 容ガラス製水槽 2L 3 個体 ( オス3) 1 連 1 濃度区 ( 排水濃度 100% の限度試験 ) 3.

7 メダカビテロジェニン測定 ( 簡易イムノクロマト ) 試験条件供試生物メダカメダカビテロジェニン測定 (Oryzias latipes.) 簡易イムノクロマト原理ばく露方式止水式試験期間 72 時間水温 (ºC) 26±1 光条件室内光レベル, 白色蛍光, 16 時間明 : 8 時間暗試験用水 ( 対照区 ) 活性炭ろ過水道水試験容器試料量 / 容器生物数 / 容器繰り返し濃度区供試生物の齢 5L 容ガラス製水槽 2L 3 個体 ( オス3) 1 連 1 濃度区 ( 排水濃度 100% の限度試験 ) 3.5cm 前後の成魚学会誌 EICA 第 9 巻第 1 号 (2004) よりサンプル添加後 5 分以内 T ラインにバンドが認められない場合ビテロジェニン濃度は 0.1µg/ml 以下 5 分以内 T ラインにバンドが出現 C ラインより後に T ラインが出現 VTG 濃度 1.0μg/mL 以上給餌 1 日 2 回 ( 個 /Lを1.5mL) 換水なしエンドポイント血中ビテロジェニン濃度 6

8 Growth rate (log(cells/ml)/d) Growth rate (log(cells/ml)/d) 試験条件供試生物海産藻類生長阻害試験 OECD TG201 海産ラン藻 (Cyanobium sp.) ばく露方式止水式, 連続振とう100 rpm 試験期間 72 時間水温 (ºC) 23± μmol/m 2 /s 光条件白色蛍光, 連続光試験用水 ( 対照区 ) 試験容器試料量 / 容器生物数 / 容器繰り返し濃度区供試生物の齢給餌換水測定方法エンドポイント ASW-SN 培地 300 ml 容ガラス製三角フラスコ 100 ml cells/ml 6 連 ( 対照区 ) 3 連 ( 濃度区 ) 5 濃度区 ( 排水濃度 80, 40%, 20%, 10%, 5%, 2.5%) 2-4 日前培養した指数増殖期の細胞なしなし 24, 48, 72 時間後のOD 値測定波長 670nm 生長速度より区間生長速度 ( 海産ラン藻 ) h 24-48h 48-72h Control h 平均生長速度ムレミカヅキモ ** ** ムレミカヅキモ ** ** 海産ラン藻 ** 濃度 (%) ** ** ** ** ** Mean±SD EC50 EC10 NOEC TU <5 >20 海産ラン藻 <5 >20 7

9 13 藻類の遅延発光による影響評価法 ( 遅延発光法 ) 光遅延発光 ( 光合成の逆反応 ) 藻類光合成バイオマス生産化学物質による代謝阻害細胞生長藻類藻類発光量の増加速度 ( 光合成できる生物量に相当 ) 遅延発光法生物量の増加速度藻類生長阻害試験藻類を試薬化した迅速簡便な試験手順 1 時間 24 時間 8

10 低下率 (%) 藻類の遅延発光による影響評価法 ( 遅延発光法 ) ムレミカヅキモ (Pseudokirchneriella subcapitata) 海産ラン藻 (Cyanobium sp. ) 比較 100 海産ラン藻ムレミカヅキモムレミカヅキモ海産ラン藻 EC 50 EC 10 NOEC TU <5 > 検体濃度 (%) 9

Microtox 試験 Microtox 試験とは海洋性発光細菌 (Vibrio Fisheri ) を用いてその光の変化量を測定することにより水生毒性を評価する方法原理海洋性発光細菌を試料にばく露し 5 15 分後の発光阻害を測定 FMNH2+O2+RCHO 発光 +FMN+H2O+RCOOH フラビンモノヌクレオチド (FMN) が還元され FMNH2

11 Microtox 試験 Microtox 試験とは海洋性発光細菌 (Vibrio Fisheri ) を用いてその光の変化量を測定することにより水生毒性を評価する方法原理海洋性発光細菌を試料にばく露し 5 15 分後の発光阻害を測定 FMNH2+O2+RCHO 発光 +FMN+H2O+RCOOH フラビンモノヌクレオチド (FMN) が還元され FMNH2 になりこれがルシフェラーゼと反応毒性物質が発光細菌に作用すると反応が阻害され発光量が減少 by E Nelson and L Sycuro, provided courtesy of the Vibrio fischeri Genome Project. 発光量からガンマ関数を算出 γ =(I(0) BR-I(t))/I(t)=I(0) BR/I(t)-1 I(0): 試料を入れる直前の発光量 I(t): 試料添加 t 分後の発光量 BR: 試料添加 t 分後の対照の発光量 / 試料を入れる直前の対照の発光量 E(%)= I(0) BR-I(t) / I(0) BR 100= γ /1+ γ 100 E : 阻害率 (t 分後に阻害を受けなければあるはずの光の量に対する t 分後に失われた光の量の比 ) EC50 は γ1 のときの濃度 % 5 分後 15 分後 EC ( ) >80 EC20 >80 >80 EC50 >80 >80 10

12 ホウネンエビ亜致死毒性試験 (RAPIDTOXKIT F) ビーズ投入 15~30 分ホウネンエビ急性毒性試験 (THAMNOTOXKIT F) 500μl 中のホウネンエビ 1 時間ばく露固定液エンドポイント粒子摂餌個体をカウント 50 個体 Control 80% 100% 各 10 個体 Control 5% 10% 20% 40% 80% エンドポイント 24 時間後の死亡数をカウント 11

13 (%) Mortality (%) ホウネンエビ亜致死毒性試験 (RAPIDTOXKIT F) ホウネンエビ急性毒性試験 (THAMNOTOXKIT F) RAPIDTOXKIT F THAMNOTOXKIT 100 粒子取り込み阻害率 (%) % 100% 0 Control 5% 10% 20% 40% 80% 濃度濃度粒子取り込み阻害率 =( コントロールの着色生物率 - 試験区の着色生物率 )/ コントロールの着色生物率 100 コントールの着色生物率 = コントロールの着色生物数 / コントロールの生物数

14 ツボワムシ (Brachious calyciflorus) 急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT F) ツボワムシ (Brachious calyciflorus) 短期慢性毒性試験 (Short-chronic ROTOXKIT F) シオミズツボワムシ (Brachious plicatiliis) 急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT M) 耐久卵のふ化 16 時間耐久卵のふ化 24 時間耐久卵のふ化 16 時間 50 匹各 5 匹 24 時間後生死の観察 10 匹各 1 匹 48 時間後繁殖数の観察 50 匹各 5 匹 24, 48 時間後生死の観察ニセネコゼミジンコの 1/4 サイズ 13

15 Mortality (%) 成長阻害率 (%) Mortality (%) ツボワムシ (Brachious calyciflorus) 急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT F) ROTOXKIT F 濃度 24H ツボワムシ (Brachious calyciflorus) 短期慢性毒性試験 (Short-chronic ROTOXKIT F) ROTOXKIT F CHRONIC % 10% 20% 40% 80% 濃度成長阻害率 =( コントロールの増加率 - 濃度区の平均 ) / コントロールの増加率 100 コントロールの増加率 =( コントロールの平均 -1)/2 EC50 EC10 NOEC TU ROTOXKIT F <5 <5 <5 >20 ROTOXKIT M 24h N.D N.D N.D N.D シオミズツボワムシ (Brachious plicatiliis) 急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT M) ROTOXKIT M 24h 48h 濃度 ROTOXKIT M 48h ROTOXKIT F CRONIC N.D N.D N.D N.D 14

16 繊毛虫慢性毒性試験 (Chronic PROTOXKIT F) サンプル 2mL 餌 40μL テトラヒメナ 40μL 440nm で OD 値 ( 濁度 ) を測定 440nm で OD 値 ( 濁度 ) を測定 24 時間 30 対照区ばく露区 1cm セル 0 時間 24 時間 15

17 阻害率 ( %) 繊毛虫慢性毒性試験 (Chronic PROTOXKIT F) 時間阻害率 24 時間阻害率 % 10% 20% 40% 80% 濃度 16

18 OSTRACOD TOXKIT F ( カイミジンコ亜慢性毒性試験 ) 成長阻害率 (%) 死亡率 (%) 培地 2mL 土壌 1mL 藻類 ( 餌 ) 2mL ふ化後 52 時間カイミジンコ 10 匹濃度 90 対照区 2.5 % 5 % % 20 % 40 % 暗所 25 6 日間ばく露生死観察体長測定 % 5% 10% 20% 40% 濃度 17

海産珪藻類生長阻害試験 (MARINE ALGALTOXKIT) Growth rate (log(cells/ml)/d) Growth rate (log(cells/ml)/d) Cell density (ells/ml) 試験条件 MARINE ALGALTOXKIT 細胞濃度 Control 5 10 供試生物 20 40 80 珪藻 10000000 (Phaeodactylum

19 海産珪藻類生長阻害試験 (MARINE ALGALTOXKIT) Growth rate (log(cells/ml)/d) Growth rate (log(cells/ml)/d) Cell density (ells/ml) 試験条件 MARINE ALGALTOXKIT 細胞濃度 Control 5 10 供試生物珪藻 (Phaeodactylum tricornutum) ばく露方式止水式, 試験期間 72 時間水温 (ºC) h 平均生長速度 lux ( サイドの照明 ) 又は 0.3 光条件 lux ( 下からの照明 ) 0.2 * ** ** 白色蛍光, 連続光試験用水 ( 対照 0.2 0h 24h 48h 72h キット付属の培地用試薬で調製 Time (h) 区 ) 0.1 区間生長速度 Control 5 前培養 72 時間試験容器キット付属のセル ( 約 30mL) 試料量 / 容器 25mL 生物数 / 容器 algal/ml Control 繰り返し 3 連濃度区 ( 排水濃度 100%, 80%, 0.3 濃度区 EC50 EC10 LOEC NOEC TU %, 20%, 10%, 5%,) 時間前に前培養した指数増 TOXKIT >80 > 供試生物の齢 0.0 殖期の細胞ラン藻 (0.1) 0-24h 24-48h 48-72h 給餌なし <5 >20 (TG201) (0.2) 換水なしラン藻 24, 48, 72 時間後のOD 値測定測定方法 ( 遅延発波長 670nm 光法 ) エンドポイント成長阻害 18

20 まとめ試験法 NOEC EC50 EC10 (%) TU 1 魚類胚仔魚期毒性試験 6.06 < ニセネコゼミジンコ繁殖試験藻類生長阻害試験 <5 >20 4 ヨコエビ急性毒性試験 >80 > OECD TG203 (100% のみの限度試験 ) N.D N.D N.D N.D 6 メダカビテロジェニンアッセイ N.C N.C N.C N.C 7 海産藻類生長阻害試験 <5 >20 8 藻類遅延発光法 ( ムレミガヅキモ ) <5 >20 8 藻類遅延発光法 ( 海産ラン藻 ) Microtox 試験 >80 >80 >80 < ホウネンエビ亜致死毒性試験 (RAPIDTOXKIT F) <80 <80 <80 > ホウネンエビ急性毒性試験 (THAMONOTOXKIT F) N.D N.D N.D N.D 12 ツボワムシ急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT F) <5 <5 <5 >20 13 ツボワムシ短期慢性毒性試験 (Short-chronic ROTOXKIT F) N.D N.D N.D N.D 14 繊毛虫慢性毒性試験 (Chronic PROTOXKIT F) N.D N.D N.D N.D 15 カイミジンコ亜慢性毒性試験 N.D N.D N.D N.D 16 海産珪藻類生長阻害試験 (MARINE ALGALTOXKIT) >80 > シオミズツボワムシ急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT M) N.D: No data, N.C: No calculation 19

21 まとめと考察 TG201 で海産ラン藻と淡水のムレミカヅキモは同程度の感受性を示した TOXKIT では海産珪藻は海産ラン藻に比べやや感受性が低い遅延発光法では TG201 と同等の結果が得られた試験法が異なっても検出が可能ワムシは淡水海水共に急性毒性試験では影響が検出できたが短期慢性毒性試験は検出できなかったワムシの扱いには技術を要するため試験者の鍛錬が必要であるメダカ簡易イムノアッセイよりビテロジェニンが検出された内分泌かく乱作用 ( 女性ホルモン作用 ) が検出されたヨコエビホウネンエビの急性毒性試験カイミジンコの亜慢性毒性試験ゼブラフィッシュの急性毒性試験 TOXKIT 繊毛虫の慢性毒性試験 Microtox 試験では影響が検出できなかった生物応答を用いた排水管理手法試験の代替法の開発に際して試験生物や試験方法を十分に考慮する必要がある 20

22 各試験担当者魚類胚仔魚期毒性試験 : 八木, 秋田県立大学堀江様ニセネコゼミジンコ繁殖試験 : 生態毒性研究室渡部藻類成長阻害試験 : 山岸ヨコエビ急性毒性試験 : 生態毒性研究室渡部 OECD TG203 (100% のみの限度試験 ) : 八木メダカイムノクロマトビテロジェニンアッセイ : 小塩海産藻類生長阻害試験 : 山岸藻類クロロフィル遅延発光試験 (2 種 ): 山岸 Microtox 試験 : 阿部ホウネンエビ亜致死毒性試験 (RAPIDTOXKIT F): 阿部ホウネンエビ急性毒性試験 (THAMNOTOXKIT F): 阿部ツボワムシ急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT F): 阿部ツボワムシ短期慢性毒性試験 (Short-chronic ROTOXKIT F): 阿部繊毛虫慢性毒性試験 (Chronic PROTOXKIT F): 阿部, 山岸, 小塩カイミジンコ亜慢性毒性試験 : 阿部海産珪藻類生長阻害試験 (MARINE ALGALTOXKIT): 阿部, 山岸シオミズツボワムシ急性毒性試験 (Acute ROTOXKIT M): 阿部 21

Ⅵ 魚類急性毒性試験

Ⅵ 魚類急性毒性試験目的本試験は魚類を被験物質に 96 時間暴露し死亡率を測定することにより魚類に対する被験物質の毒性を明らかにすることを目的とする 1 供試生物メダカ ( ヒメダカ ) が推奨されるが例えば付表 1に示す魚種などを使用してもよい魚は良好な健康状態にあり外見上の奇形があってはならない付表 1 魚種推奨試験温度試験魚の推奨全長 ( ) ( cm) Brachydanio