起波長 560nm, 蛍光波長 580 nm) を分光蛍光プレートリーダー (FluorPlus,Tecan) により定量した 3) 珪藻 Asteroplanus karianus 溶藻因子の性状解析ここでは, あらかじめ調製保存しておいた海水懸濁物を材料に用いた海水試料は, 2014 年 9

Size: px

Start display at page:

Download "起波長 560nm, 蛍光波長 580 nm) を分光蛍光プレートリーダー (FluorPlus,Tecan) により定量した 3) 珪藻 Asteroplanus karianus 溶藻因子の性状解析ここでは, あらかじめ調製保存しておいた海水懸濁物を材料に用いた海水試料は, 2014 年 9"

ありさなつ
5 years ago
Views:

1 起波長 560nm, 蛍光波長 580 nm) を分光蛍光プレートリーダー (FluorPlus,Tecan) により定量した 3) 珪藻 Asteroplanus karianus 溶藻因子の性状解析ここでは, あらかじめ調製保存しておいた海水懸濁物を材料に用いた海水試料は, 2014 年 9 月の広島湾表層海水, ならびに 2015 年 1 月有明海における A. karianus ブルーム期間中の表層と底層の混合水であるこれらに含まれる懸濁粒子を孔径 3 μm ヌクレポアフィルター上に捕集し, 80 で凍結保存した当該サンプルを試験直前に解凍し,RNA 抽出 cdna 作製を実施した cdna 作製にはピコルナ系ウイルス RdRP の増幅プライマー (MplSC) ならびにランダムプライマー 6mer を用いたさらに, 作製 cdna( 鋳型 ) と MplSC プライマーを用いた PCR により, 懸濁物中に存在していた可能性のあるピコルナ系ウイルスのポリメラーゼ遺伝子領域の増幅を試みた (3) 結果及び考察 1) 珪藻 Asteroplanus karianus の栄養塩利用に関わる遺伝子の分布有明海北部では, 冬季になると毎年のように A. karianus が発生し, 養殖ノリの栄養不良色落ち被害を引き起こしている ( 松原ほか 2014,Yamaguchi et al. 2014) そのため, 本種の栄養塩摂取プロセスを明らかにし, それに基づいた栄養塩の変動予測技術を確立することが重要である今回,A. karianus による栄養塩摂取を理解するために, 本種無菌クローン株由来の mrna を網羅解析したところ, 多数の配列を得ることができ, とりわけ栄養塩利用に深く関わるとされる硝酸塩輸送体およびリン酸塩輸送体の配列を見出すことができた ( 表 1) これまでの事業成果により, 珪藻 Chaetoceros tenuissimus は窒素あるいはリン欠乏に陥ると, それぞれ硝酸塩輸送体およびリン酸塩輸送体の転写量を増大させることが明らかにされているしたがって, それらの転写量に基づいて, 窒素あるいはリン欠乏状態を推定することが可能と考えられる今回, その転写量の相対定量に欠かせないハウスキーピング遺伝子の候補も得られた現段階では, アクチンならびに TATA 結合タンパク質の配列がそれに該当する当初の予定よりもアノテーションが進んでいないが, 次年度に行う解析によって, より多くのハウスキーピング遺伝子の候補が得られるであろうまた今後, それらを用いた逆転写定量 PCR により,A. karianus の窒素リン利用, それらに関わる生理状態が診断可能になるものと期待される興味深いことに, 昨年度,A. karianus 無菌クローン株からはアルカリフォスファターゼフォスフォジエステラーゼの活性が検出されていないにもかかわらず, 今回の解析ではそれらの遺伝子発現が認められたこれらを総合すると,A. karianus は有機態リン分解に関わる酵素群 DNA を有しているものの, それらの転写量あるいは翻訳は何らかの理由で制限されているようであるそのため, 有機態リン分解活性としては検出できないレベルにあるのではないかと考えられる今後, 得られた各遺伝子の mrna 量 ( 転写 ) と活性 ( 翻訳 ) との関係を精査する必要がある 2) 正リン酸塩を迅速に蛍光定量可能な系の確立水中の正リン酸塩は, モリブデン酸と結合することで, モリブドリン酸と呼ばれる錯体を形成するこの錯体を還元することにより正リン酸塩を比色定量するのが, いわゆる定法モリブデンブルー法である我々が着目したのは, モリブドリン酸の濃度に比例して, 試薬ローダミン B 由来の蛍光が減衰するという化学反応 ( 本水ほか 2000) である本研究では, 当該反応を 96 穴プレートで引き起こし, ローダミン B 由来の蛍光強度をプレートリーダーで高速測定することで, 正リン酸塩の迅速なる蛍光定量系の基盤構築を果た 277

2 すことに成功した今回の試験において正リン酸塩濃度 (P i ) の増大に伴う蛍光強度 (Fluor) の減少が認められ ( 図 1), 両者の関係は以下の対数関数 (1) で表すことができた (1) 本式から得られた理論値と実測値との間には, 有意かつ高精度な相関関係 (R 0.991,P < 0.01,N = 24) が認められたことから, 蛍光値から正リン酸を回帰できると判断された現在,QuAAtro(BL TEC K.K.) に代表される栄養塩自動分析であれば, 多検体にのぼる正リン酸塩の定量を約 1 時間程度で処理可能である従来の手分析ベースの定量に比べると, 労力の軽減が大幅に改善されているのは周知のとおりであるその一方で, 試料の用量は 5~10 ml/sample であり, また, それらを凍結保存するのであれば, 相当の保管スペースが必要となる今回, ローダミン B の消光法と定量機器プレートリーダーを組み合わせることで,100 近い多くの検体であっても 1 分以内に測定可能なことが示されたしかも, 定量に要する試料は, 一試料当たり 200 μl 程度に満たないほどの微量で事足りるこのように, 今回検討した正リン酸塩の定量系は, 試料の用量削減, それに伴う保存スペースの削減, さらに測定時間の大幅な短縮が図れる点で優れていると判断されるしたがって, 正リン酸塩の定量が関わる実験を効率よく推し進める上で, 今回の手法は有用なツールになろうと思われるモリブデンと錯体を形成する化合物の一つにケイ酸塩が挙げられるケイ酸塩と正リン酸塩が共存する場合, 前者が後者の定量に及ぼす負の影響を考慮する必要がある現段階では予備的ではあるものの, 本定量結果に及ぼすケイ酸塩の影響は無視できるほど小さいことが明らかになりつつある今後は, これら各種栄養塩ならびに塩分が蛍光値に及ぼす影響を検討することで, 海水中の正リン酸定量の正確性迅速性について評価できると期待される 3) 珪藻 Asteroplanus karianus 溶藻因子の性状解析近年の成果により,A. karianus の栄養塩摂取プロセスの解析は進展しつつあるものの, 摂取停止ひいてはノリ養殖場の栄養塩回復再生につながり得る本種の衰退プロセスについてはほとんど理解されていない昨年度に実施した培養試験によって, 我々は A. karianus 推定溶藻因子を発見するに到ったしかしながら, 本種ブルームに対する当該因子の関与については不明であり,A. karianus の衰退現象とそれに伴う栄養塩摂取停止現象については考察できなかった本年度, 有明海において発生した A. karianus 冬季ブルーム期間中の懸濁物サンプルより, ピコルナ系ウイルス (ssrna ウイルス ) のポリメラーゼ様配列 ( 約 500 bp,mplsc2 + 6mer, 2015_Jan) を検出することに成功した ( 図 2A) その配列を分子系統解析に供した結果, 当該配列は, 珪藻感染ウイルスの系統に含まれるものの, 新規な配列であることが示唆された ( 図 2B) これまでに, 我々は A. karianus 培養株の溶藻現象を見出し, その際行った透過電子顕微鏡観察により, ウイルス粒子と推察される因子を検出することに成功している今回,A. karianus ブルームの懸濁粒子から新規珪藻感染 RNA ウイルス配列を検出することができ, それを含めて総合的に考察すると,A. karianus 個体群減衰要因の一つに, ウイルス感染の影響が可能性として推察されるよって A. karianus 冬季ブルームに伴う栄養塩の消費を予 278

3 測する上で, ウイルス感染による消費停止プロセスは無視すべきではないと考える本事業の遂行にあたり, 貴重なサンプルの提供にご協力いただいた紫加田知幸博士松原賢博士に厚く御礼申し上げます 4) 引用文献松原賢, 横尾一成, 川村嘉応. 有害珪藻 Asteroplanus karianus の有明海佐賀県海域における出現動態と各種環境要因との関係. 日水誌, 80, , 本水昌二, 大島光子, 勝村直也. 海水中のリンの蛍光検出フローインジェクション法. J. Flow Injection Anal., 16, 101, Yamaguchi H, Minamida M, Matsubara T, Okamura K. Novel blooms of the diatom Asteroplanus karianus deplete nutrients from Ariake Sea coastal waters. Mar. Ecol. Prog. Ser., 517, 51 60,

4 表 1 Asteroplanus karianus の栄養塩利用に関わる cdna 配列のプロパティならびに内部標準に用いることが可能な候補配列のプロパティ ID Length E-value Top hit TR22107 c1_g NRT2, partial [Thalassiosira weissflogii] TR34288 c0_g Nitrate transporter [Thalassiosira pseudonana CCMP1335] TR1436 c0_g1_i1 431 < Nitrate transporter [T. pseudonana CCMP1335] TR15738 c0_g1_i1 298 < Nitrate transporter [T. pseudonana CCMP1335] TR21716 c0_g Putative nitrate transporter, partial [T. weissflogii] TR12848 c1_g1_i Inorganic phosphate transporter, partial [T. pseudonana CCMP1335] TR1436 c0_g1_i Phosphate transporter, partial [T. pseudonana CCMP1335] TR4545 c1_g1_i Phosphodiesterase/alkaline phosphatase [Phaeodactylum tricornutum CCAP 1055/1] TR30068 c1_g1_i Alkaline phosphatase, partial [T. pseudonana CCMP1335] TR13173 c0_g1_i1 377 < Action [Skeletonema marinoi] TR26703 c0_g1_i1 391 < Action [S. marinoi] TR28116 c1_g1_i1 >399 <10-66 Predicted protein [P. tricornutum CCAP 1055/1] TATA-binding protein-interacting protein [Plasmopara halstedii] 図 1 正リン酸濃度 (P i ) とローダミン B 由来の蛍光値 (Fluorescence) との関係. 図中の破線は想定される直線回帰の傾向を示し, 実線は正リン酸塩の回帰曲線を示している. 280

図 2 2014 年 9 月広島湾海水ならびに 2015 年 1 月 Asteroplanus karianus ブルーム海水に含まれる懸濁粒子より得られた PCR 産物の電気泳動像 (A),2015 年 1 月サンプルの一部 ( 囲み指定 )

5 図年 9 月広島湾海水ならびに 2015 年 1 月 Asteroplanus karianus ブルーム海水に含まれる懸濁粒子より得られた PCR 産物の電気泳動像 (A),2015 年 1 月サンプルの一部 ( 囲み指定 ) より得られた配列とその他のウイルス配列に基づいて作成した最尤系統樹 (B) 鋳型には懸濁粒子由来の RNA(cDNA) を用い,cDNA 合成および PCR のプライマーにはピコルナ系 RNA ウイルス検出用 deg. プライマー (MplSC1 および MplSC2) ランダムプライマー 6mer) を用いた分子系統樹の分岐箇所にはブートストラップ値が示されている 281

6 4) 栄養塩類等の水質環境が低次生産生物に及ぼす影響解明 1 海域の栄養塩環境が低次生産に及ぼす影響解明ア. 播磨灘における基礎生産簡易測定技術の開発兵庫県立農林水産技術総合センター水産技術センター宮原一隆, 原田和弘水産研究教育機構瀬戸内海区水産研究所阿保勝之 1 全体計画 (1) 目的近年, 瀬戸内海海域では, 貧栄養化が進行したことによる水産資源への影響が指摘されている同海域の低次生物生産に関しては, 各種モニタリングによって現存量のデータは整備されつつあるものの, 生産速度や転換効率に関する知見は断片的であり, 瀬戸内海各海域においてどのような生物生産構造が成り立っているのかについては明らかになっていないそこで. 瀬戸内海東部の播磨灘において, 栄養塩等の海域の水質環境調査を実施するとともに動植物プランクトンの低次生物生産に関する調査を行い, 水質環境が海域の生産力に及ぼす影響を把握するとともに, 基礎生産速度等を簡易に測定する技術の開発を目指す (2) 試験等の方法瀬戸内海東部の播磨灘において定点 ( 図 1, 計 6 定点 ) を設置し, 年 5 回の現場観測調査を実施する水温, 塩分, 光条件等の鉛直プロファイルを獲得するとともに, 採水調査およびネット採集調査を実施し, 低次生物生産量を算定するまた, 光合成活性を測定する機器 ( パルス変調型光合成測定装置 ) を活用し現場海域での水柱基礎生産量を推定するとともに, 従来法 ( 疑似現場培養法 ) による測定結果と比較検討する 2 平成 28 年度計画および結果 (1) 目的全体計画と同じ (2) 試験等の方法全体計画と同じ平成 28 年 6 月 3 日,7 月 15 日,9 月 13 日,11 月 16 日, 平成 29 年 1 月 16 日,3 月 9 日 ( 予定 ) に調査を実施し, 各分析を実施した ( 本報告では平成 29 年 1 月調査までの 5 回分をとりまとめた ) なお, 単年の調査結果のみでは, 基礎生産や光合成活性の季節変動や各環境要因との関連について十分には議論できないため, 本報告書では, 各調査期における植物プランクトンの発生状況, パルス変調による光合成測定 ( 以下,PAM 測定 ) の結果と明暗瓶法との比較を中心に記載した調査分析項目と分析方法 : 1) 全点実施 (Stn. H1,H2,H6,H7,H10,H29; 図 1) 282

7 CTD 観測 ( 水温塩分蛍光強度 DO), 透明度多項目式 CTD(JFE アドバンテック RINKO Profiler), セッキ板を用いて測定した動物プランクトン採集( 改良型ノルパックネット,100μm メッシュ ) 濾水計を装着したネットを海底まで垂下し, おもり着底後から海面まで約 1m/ 秒の速度で鉛直曳網した採取したネットプランクトンサンプルは, 中性ホルマリン ( 最終濃度約 10%) で固定し, 課題 4-1-エの解析に供した栄養塩(DIN,DIP,D-Si), クロロフィル a(chl.a) 濃度, 植物プランクトン組成栄養塩濃度は, 自動分析装置 (QuAAtro, ビーエルテック株式会社 ) を用いた比色法によって測定した Chl.a 濃度は, アセトン抽出蛍光法を用いた植物プランクトン組成は, 原則として表層 (0.5m 深 ) の試水 1mL に含まれる全数を計数した PAM 測定光合成測定装置 (WATER-PAM CUVETTE-Version,WALZ 社 ) を用いた測定用の試水は表層から採水し,300μm メッシュのネットにより動物プランクトン等の捕食生物を除去した濾水を 500mL 褐色瓶に入れて密封遮光した後, 船上に設置した大型コンテナ内に海水を満たし, その中で保管することによって温度を一定に保った ( 海水は適宜交換した ) 光合成の測定は, 研究室に戻り次第実施した測定条件は, 試水量 1.2mL( 専用キュベットを使用 ),ML レベル 12 以下,Gain レベルはデフォルト,PM-gain レベル 14 以下,PAR( 光合成有効放射 ) の測定間隔は 30 秒とした測定 PAR 値は, 機器固有の設定 (0~2678 の 9 段階 ) を使用し, それぞれの PAR 条件で得られた retr(=par ΦII, 相対電子伝達速度,μmol electron mg/chl.a/s) とのデータセットから, 光合成曲線 :retr=etr max (1-exp(-(a PAR)/ETR max )) にあてはめた場合の残差平方和が最小となるように 2 種類のパラメータ (ETR max = 最大電子伝達速度 μmol electron mg/chl.a/s, a= 曲線の傾きを示す指標 ) を算出したなお, 以下の特定点では, 透明度の測定値から, 光量子量が表層の 48%( 以下, 中層 1),33%( 中層 2) にそれぞれ減衰する層を船上で推定し, それぞれから採取した中層水についても PAM 測定を実施し, 表層水と同様の方法で光合成曲線を推定した 2) 特定点実施 (Stn.H2 と H10) 光量子量測定光量子計 (LI-COR 社球形光量子センサーまたは JFE アドバンテック DEFI-L) を用いて, 鉛直垂下により現場観測した明暗瓶法( 酸素法 ) PAM 測定に供した海水 ( 表層, 中層 1, 中層 2 の計 3 層分 ) と同じ試水を用いたそれぞれの試水を明瓶と暗瓶 ( 各 duplicate) にてインキュベータ内で 12 時間培養した後, 溶存酸素濃度の差から算出した培養温度は, 調査日の播磨灘北部 ( 兵庫県明石市二見町地先, 水産技術センター定置観測 ) の水温とした光条件は, 蛍光灯を用いて, 表層海水は 480μmol/m 2 /s, 中層 1 はその 48%, 中層 2 は 33% となるように黒色遮光幕を使って減衰設定した各 2 本の平均値の明暗瓶差から酸素発生量を算出し, 283

環境科学部年報（第16号）－04本文-学位論文の概要.indd

環境科学部年報（第16号）－04本文-学位論文の概要.indd 琵琶湖におけるケイ素画分の特徴とそれに影響を及ぼす要因安積寿幸環境動態学専攻はじめに近年人間活動の増大が陸水や海洋において栄養塩 ( 窒素リンケイ素 ) の循環に影響を与えているこの人間活動の増大は河川や湖沼海洋の富栄養化を引き起こすだけでなくケイ素循環にも影響をおよぼす特に陸水域における富栄養化やダムの建造は珪藻生産珪藻の沈降堆積を増加させ陸域から海洋へのケイ素の輸送を減少させる

起波長 560nm, 蛍光波長 580 nm) を分光蛍光プレートリーダー (FluorPlus,Tecan) により定量した 3) 珪藻 Asteroplanus karianus 溶藻因子の性状解析ここでは, あらかじめ調製 保存しておいた海水懸濁物を材料に用いた 海水試料は, 2014 年 9

起波長 560nm, 蛍光波長 580 nm) を分光蛍光プレートリーダー (FluorPlus,Tecan) により定量した 3) 珪藻 Asteroplanus karianus 溶藻因子の性状解析ここでは, あらかじめ調製保存しておいた海水懸濁物を材料に用いた海水試料は, 2014 年 9