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1 1 半導体チップを用いた生体分子のラベルフリー 電気的検出 名古屋大学大学院工学研究科電子情報システム専攻教授 中里和郎

2 化学集積素子 - チップ上に化学を集積 2 輸送 化学反応 検出 制御 ~1cm 特長 smart lab-on-a-chip 化学反応の検出 特定の分子のセンシング 化学反応の制御 特定の分子の増幅 輸送分子の搬送と選別 ノイズに強く微小信号を捉えることができる 高速 (1ms) 局所 (1~100mm) 計測 同時並列計測が可能化学反応分布の実時間観測多種反応の同時計測 化学反応の制御温度 電界 磁界 溶液の流れ 小型 (1cm 2 )

3 センサ アレイによる化学反応の検出 頻度 3 センサ アレイ 同時並列計測 反応の 2 次元可視化 欠陥があってもほとんど影響を受けない 平均では信号弱い 大きな信号を検出 冗長性 研究方針 半導体チップは標準 CMOS 製品ラインで作製 ポストプロセスとして膜形成等 数ステップを付加 アレイのユニット セル回路に注力 化学反応系に干渉しない 高密度 ( 最小素子数 ) 低消費電力 ( 弱反転動作 ) 安定動作 ( 低出力抵抗 ) 欠陥があると信号が検出できなくなる 不良セル 出力信号 ph9 ph6

4 MOSFE (Metal-Oxie-Semiconuctor Fiel Effect ransistor) 4 MOSFE 構造 n + n + p 金属酸化膜 半導体 現在の集積回路は MOSFE で構成 1cm 角のチップに 10 億個以上の MOSFE が搭載可能 一度に大量のチップの作製が可能 (1 万チップ / ロット ) 初期費用が高い 標準製造工程以外の工程は困難 量産化によりチップ単価は非常に安くなる 加工レベル初期費用チップ単価 0.6mm 130 万円 150 円 / チップ 0.25mm 750 万円 210 円 / チップ 0.18mm 1,900 万円 260 円 / チップ 0.13mm 4,800 万円 400 円 / チップ 初期費用 : ホトマスク代チップ単価 : チップサイズを固定 (1cm 角 ) したときの単価 少量生産には向かない 半導体のメリットを活かすには標準化が必要

5 小型可搬型 遺伝子ベース診断システム 5 食の安全健康に対する不安感染症の拡大防止体質にあった投薬 ケア在宅医療 誰でもどこでも直ちに 小型可搬型 遺伝子ベース診断システム label free, 電気的検出の DN チップの実現 従来の DN チップ蛍光体検出 蛍光体をつけるのに専門技術が必要 光学装置のため高額 携帯困難 system-on-a-chip + lab-on-a-chip 半導体集積回路の新しい展開 More than Moore 小型 携帯型 医療検査装置 ( 在宅医療 ) 感染症の水際阻止 ケア ( 健康 食品 運動 ペット ) 食の安全 環境

6 電気化学計測法 6 potentiometric amperometric impeimetric 電位もしくは電荷 酸化還元電流 インピーダンス

7 直接電荷検出法 7 immobilization prove の固定 素性の判っている分子 特定の分子とのみ結合 hybriization target 調べたい分子 電荷 Q を持つ 反応させた後 結合しなかった分子は洗い流す もし target の中に特定の分子が含まれていれば電位の変化として検出

8 参照電極 otentiometric sensor 回路 理想的な検出 被測定対象に影響を与えないこと 8 溶液 入力インピーダンスが DC, C 共に大きいこと CMOS source-rain follower 分子 V G 電極 センサ トランジスタ V S = V G + const. V D = V G + const. V S V D K.Nakazato, M.Ohura & S.Uno IEICE rans. Electron. E91-C (2008) 1505 従来回路と比較して面積 1/30 消費電力 1 万分の1 精度 100 倍 V G V OU = V G

9 81.4 mm 16 x 16 sensor array 9 1.2mm 標準 CMOS プロセスチップ消費電力 0.5 mw sensing area sensor unit current reference (50n) reference cells input aress aress buffer X ecoer 16 x 16 sensor cell array 112 mm RS CS MUX Y ecoer aress buffer OU REF 5mm

10 Cumulative robability [%] Cumulative robability [%] V OU [V] Catalytic-CVD Si 3 N 4 を用いた ph 測定 10 参照電極溶液 flow H + Si 3 N 4 電極センサ トランジスタ ph9 ph8 ph7 ph V OU [V] ph5 ph9 ph ph - 40mV/pH ph sensitivity [mv/ph]

11 乳酸菌の測定 11 現在の細菌検査方法 採材 検体処理 分離培養 純培養 鑑別検査 菌の特定菌の特定までに長時間が必要 短時間 ( 数時間 ) での菌の特定が目標 細菌の生体反応 測定対象 : 乳酸菌測定内容 : 乳酸菌の資化反応から生じる酸による ph 変化を観測 リン酸緩衝液 ( 糖類なし ) 培地 ( 培養液 : 糖類あり ) 乳酸菌投入 37 インキュベータ内

12 DN hybriization の検出 12 u (50nm) / i(20nm) 6.5 mm 4.2 mm Immobilization Hybriization ECVD Si 3 N 4 (750nm) SiO 2 (400nm) l (1mm) 11.2mm probe: 5 thiol moifie GGGGGG target: CCCCCC buffer: 1mM NaCl & 1uM ED & 1mM KH 2 O 4 & 1mM K 2 HO 4 (ph7.0) - - robe ssdn target ssdn 参照電極 K.Nakazato Sensors 9 (2009) 8831 溶液セル

13 ここまでの配列が probe DN と相補的であれば伸長反応が起こる C G C G C G C G 電荷量の変化 hybriization G G G G C G C G C 溶液絶縁膜半導体 n + n + p Genetic Fiel Effect ransistor.sakata & Y. Miyahara Biosensors Bioelectron. 22 (2007) 1311 probe DN target DN G G G G C G C C 伸長 N DN polymerase 13

14 生体分子電荷の直接検出の問題点 14 電荷遮蔽 電極 構造変化による影響 生体分子の電荷 溶液イオンによる遮蔽 溶液濃度 遮蔽距離 1 mm 10 nm 100 mm 1 nm 電荷を検出しようとすると溶液濃度小 高インピーダンス状態 信号が不安定 hybriization 特にフロー系では溶液中での分子の動き 信号の不安定 電荷の変化を見てるのか構造の変化を見てるのか解らない 浮遊ゲート 絶縁膜 or SM 電極 初期電荷 大きな閾値ばらつき

15 電位 [mv] 7.5 mm 出力電圧 [mv] Interfacial otential [mv] 電位 [mv] 酸化還元電位センサ forwar backwar Ratio of hexacyanoferrate ( Ⅲ) to (Ⅱ) 酸化物質 (Ox)/ 還元物質 (Re) 直接電荷検出方式 変動 30 mv/hour 時間 [hour] 7.5 mm フェロセン修飾金電極 フェロセン Fe S Ox Re S Fe Fe 金絶縁膜シリコン基板 S 信号安定性 2 桁向上 酸化還元電位検出方式 変動 0.5 mv/hour 時間 [hour]

16 FE 方式酵素センサ 16 測定対象物質 S 酵素反応系酵素 E 反応産物 利点 溶液の ph に依存しない 感度大 安定 再利用可能 汎用 hexacyanoferrate 酸化物質 Ox Re 還元物質 Fe(CN) 6 3- Fe(CN) 6 4- フェロセン 11-FU 11-ferrocenyl-1-unecanethiol Fe(II) Fe Fe Fe Fe Fe(III) Fe S S S S 金電極 S V = V 0 k B nq log e 測定対象物質濃度

17 Change 出力電圧 in potential [mv] [mv] 出力電圧 [mv] 応用例 17 コレステロール測定 サンプル量 : 2.5mL 33±2.5 mg/l Cholesterol + ND CDH Cholestenon +NDH 2[Fe(CN) 6 ] 3- + NDH Diaphorase 2[Fe(CN) 6 ] 4- + ND グルコース測定 グルコース + ク ルコース6リン酸 + ND 2[Fe(CN) 6 ] 3- + NDH HK ク ルコース6リン酸 + D G6DH ク ルコノラクトン6リン酸 + NDH Diaphorase 2[Fe(CN) 6 ] 4- + ND コレステロール濃度 [mg/l].ishige, M. Shimoa & M. Kamahori Biosensors Bioelectron. 24 (2009) グルコース濃度 200 mg/l 25 mg/l 50 mg/l 100 mg/l 時間 ime [[s] 秒 ] H. nan,.ishige, M. Kamahori, & K. Nakazato Sensors an ctuators B: Chemical (2013)

18 酸化還元反応検出方式 DN シーケンサ 18 ビーズ 金電極 ビーズ arget DN G C robe DN DN olymerase N 酵素反応系 伸長 i (pyrophosphate) 酸化還元物質 MOS transistor e - 分子反応部と検出部の分離 信号の増大と安定 汎用性 再利用可能 11-FU (11-ferrocenyl-1-unecanethiol) S Fe Fe Fe Fe S S S 金電極 S Fe

19 current current amperometric sensor array 19 電流検出の原理 微小電極 Electrolyte Re - Ox + 拡散層の形状半球状 電流の時間変化 数秒 ~ 数十秒 Electroe Insulator Microelectroe array Re - e - Current Ox 2D mapping Display evice ne - Microelectroe < 10-5 m time 定常電流が得られる. 微小電極アレイ拡散層の形状電流の時間変化平面状 酸化還元反応で移動した電子を電流として検出 Microelectroe array time 電流は減少し続け 定常電流が得られない

20 微小電極アレイ構造 20 従来の構造 提案する構造 WE WE E WE : Working electroe 目的の酸化還元反応が起こる 拡散層が重なり合う 平面状の拡散層が形成される E: uxiliary electroe WE と反対の酸化還元反応を起こす 拡散層が各作用電極付近に閉じ込められる 拡散層の重なりが低減される

21 I [n] 微小電極アレイセンサー 21 単体の微小電極 従来の微小電極アレイ 提案する微小電極アレイ 提案する微小電極アレイ 単体の微小電極 100 mm Na 2 SO 4 1 mm K 4 [Fe(CN) 6 ] 双スイッチ方式により常に電極電位を固定 従来の微小電極アレイ ( 定常電流が得られず定量化不可 ) time [s] J.Hasegawa, S. Uno & K. Nakazato Jpn. J. ppl. hys. 50 (2011) 04DL03

22 キャパシタンス検出 CBCM (Charge Base Capacitance Measurement) V SW 1 SW 2 SW1 C i 22 SW1 SW2 C X2 Q=CV Q=0 V B V CM V OU C X1 SW1 SW2 電流 = fcv SW 1 SW 2 C i この繰り返しを周波数 f で実行 Sensing Cell Output Circuit SW1 実際には差分により精度向上 電極 C=C M C=0 I 1 = f(c M +C p )V I 2 = fc p V V = (I 1 -I 2 ) = fc M V 電極 4mmx4mm

23 キャパシタンスによる DN 検出 23 bare electroe probe DN immobilization target DN hybriization Y.B.Yusof, K.Sugimoto, H.Ozawa, S.Uno & K. Nakazato Jpn. J. ppl. hys. 49 (2010) 01G05

24 Electrochemical Impeance Spectroscopy (EIS) 24 20mm probe DN robe DN + mercaptohexanol 1 mm 金電極 DN の固定化法に敏感 DN の状態は単純なキャパシタンスや抵抗の変化では無く constant phase element の因子 a の変化として現れる Z = 1 Q jω α j = 1 Z imaginary Z real = tan απ 2

25 current Constant hase Element 25 分布として捉える必要 構造の変化として捉える必要 R 0 R i C 0 C i t α time t exp t C i R i Y.B.Yusof 名古屋大学工学研究科学位論文 (2011 年 10 月 )

26 インピーダンスによる 1 分子検出 26 細菌 ウィルス捕獲膜 溶液 細菌 ウィルス 絶縁膜 電極 電極実効面積の減少 キャパシタンス減少抵抗増大 DN ウィルス 細菌 細胞 インピーダンス増大 1nm 10nm 100nm 1mm 10mm ナノポア 現在の半導体技術で 1 分子サイズの電極の形成が可能 平均値測定と 1 分子測定では検出信号に質的な差

27 , S インピーダンスによる 1 細菌検出 log( Z ) 27 細菌 R S C p C R S 細菌有細菌無 C p C 電極 等価回路 寄生容量の削減 log( f ) インピーダンス Z の周波数 f 依存性 電極を直接外部に接続すると大きな寄生容量が付く 内部回路により寄生容量 3 桁低減 内部回路 10-5 理想的な特性 回路専用 (b) 回路 I SS input R オペアンプ回路 (a) 回路 C p ~100pF C p ~0.1pF K 10K 100K 1M 10M 100M f, Hz

28 細菌カウントチップ 28 細菌捕獲セル 細菌 細菌 B フローセル流路 抗体 細菌 電極 半導体チップ 絶縁膜 MOSFE 局所インピーダンスセンサ回路 細菌 C 細菌 D 半導体チップ フローセル流路 ボンディングパッド

29 222.74mm 異種項目同時計測による総合的な分析 29 測定項目記号測定方式解説 ヘマトクリット値 Hct インピーダンス血液中の血球容積 ヘモグロビン Hb 酸化還元電流赤血球中のヘムタンパク質 グリコヘモグロビン Hb1c 電位 ヘモグロビンb 鎖のN 末端に グルコースが結合した糖化タンパク質 グルコース GLU 電位血液中の代表的な糖質 酸化還元電流検出 mm ph 検出 電位検出 インピーダンス検出

30 試作機 30 2cm C CU SRM Flash memory USB interface GIO MCU igital level shifter DC RS CS aress buffer Y ecoer sensor array MUX X ecoer aress buffer current reference スタンドアローン デモ機 14cm x 20cm x 11 cm (H) LCD river LCD output buffer amplitue etector chip フローセル流路を含めた形でプロトタイプを完成 (2013 年 4 月 ) し 評価していただけるようにしたい

31 ユビキタス情報社会 31 交通 生活 環境 流通 金融 オフィス 認証チップ 高密度低消費電力 LSI 小型低電力センサ 化学集積素子 バイオチップ lab-on-a-chip 農業 医療 看護 食品 I 通信 創薬