2. 抗原抗体相互作用の物理化学的解析 1) 抗原抗体相互作用の親和性抗体が抗体と結合する際にはその抗原と抗体のアミノ酸とのさまざまな非共有結合が形成される 1 つの抗原抗体結合の強さを抗体の親和性特に固有の親和性 (intrinsic affinity) と呼ぶそれに対し 1 分子あたり複数

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さみかいて
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1 抗体デリバリー - 基礎から臨床まで - 抗体開発のための抗原抗体相互作用解析 * 東京大学大学院工学系研究科医科学研究所 * 津本浩平 Dissection of antibody-antigen interactions for development of antibodies Antibodies have been widely used for therapeutics and diagnosis due to their high specificity and affinity for the targets; development of antibodies has been extensively investigated in various DD S fields. Once we obtain the genes encoding a monoclonal antibody, we can engineer various molecules using the antibody genes as a recognition element. However, it is not so far since we could understand how an antibody creates the specificity and affinity for the target from structural and energetic viewpoints. In this review, we firstly summarize three methods for biophysical characterization of antibody-antigen interactions. Second, we review our recent progresses on understanding how an antibody recognizes the target antigen from structural and energetic viewpoints. Finally, we discuss how we can create and improve the affinity of an antibody toward the target. 抗体はその高い抗原特異性親和性から治療薬診断薬に用いられており各分野で抗体開発が盛んに行われている抗体配列遺伝子が手に入れば我々はその抗体が持つ機能を認識素子として利用しさまざまな改変抗体を構築することができるようになっているしかしながら抗体がどのように抗原に対して高い特異性親和性を創出するかについて構造的にまたエネルギー的に理解されるようになったのはごく最近のことである本稿では抗原抗体相互作用を生物物理学的にどのように性格づけするかについてまず代表的な解析方法についてまとめつづいて抗体が標的分子をどのように認識し高親和性を創出しているかについて述べる Kouhei Tsumoto * Keywords: interaction, thermodynamics, enthalpy, hot-spot, complementarity-determining region(cdr) * 1. はじめに抗体 (Immunoglobulin) は標的分子を特異的にかつ高親和性を持って認識することができる蛋白質であるイメージング生体内標的分子の動態解析や相互作用分子の同定標的分子の定量バイオセンサーなど幅広い領域で基礎研究に用いられているほか治療薬あるいは臨床検査薬に関する開発研究もさかんに行われている Milstein らが確立した細胞融合法によるモノクローナル抗体作製技術は近年の遺伝子工学技術の進歩さらに種々の調製法あるいはハンドリング技術の確立により抗体はいまや医薬品として利用 School of Engineering and Institute of Medical Research, The University of Tokyo されるようになっている最近では抗体が持つドメイン構造を利用した積み木細工による組換え型改変抗体の開発あるいは薬剤などの結合 (Antibody Drug Conjugate, ADC) がさかんに行われるなど抗体研究はさらに大きな発展を見せている一方抗原認識能の合理的デザインに関する関心も高い高い特異性親和性を持つ抗原分子認識機能は分子認識素子の開発という観点でも大変魅力的であるここではまず抗原抗体相互作用解析として汎用されている手法の中で特に熱力学的解析速度論的解析 KinExA について簡潔に述べる続いて抗体変異体を用いた解析から明らかになった抗体の特異性親和性創出の分子機構について筆者らの研究を紹介する 412 Drug Delivery System 28 5, 2013

2 2. 抗原抗体相互作用の物理化学的解析 1) 抗原抗体相互作用の親和性抗体が抗体と結合する際にはその抗原と抗体のアミノ酸とのさまざまな非共有結合が形成される 1 つの抗原抗体結合の強さを抗体の親和性特に固有の親和性 (intrinsic affinity) と呼ぶそれに対し 1 分子あたり複数の結合部位が存在する場合にみられる親和性をアビディティ (avidity) と呼ぶ抗体は 2 つ以上の抗原結合部位を持っていることから実際に測定される値はすべて後者となる 2) 抗原抗体相互作用の熱力学的解析抗体が抗原と結合する場合さまざまな非共有結合が形成されるため結合に際して熱が発生するこの熱を解析することによりその抗体の特性を解析できる一般に抗原抗体相互作用を熱力学的に解析する場合は等温滴定型熱量測定装置が利用されるこの装置は抗体を満たしたセルを一定温度に維持しそこに抗原を滴下することで発生する熱量を観測するというものである観測される熱量からは結合におけるエンタルピー変化が算出されその変化から平衡結合定数 (Ka ) が算出される相互作用前後のギブスエネルギー変化と平衡結合定数は次式で関係づけられているためギブスエネルギーが算出される ( 式 1) G = RT ln Ka (1) また複合体形成のギブスエネルギーはエンタルピーとエントロピーの間のバランスとして次式のように定義されるため結合のエントロピー変化が算出できる ( 式 2) G = H T S (2) 一般的に負のエンタルピー変化はファンデルワールス力や水素結合イオン性相互作用から生じることが知られておりこれらが親和性に positive な貢献をする場合はエンタルピー得といわれるエントロピーの変化について考えると結合により蛋白質中の動いているセグメントや側鎖のコンフォメーショナルエントロピー別々の分子の自由回転並進エントロピーは減少するこれらは親和性には negative な貢献をするためエントロピー損と呼ばれる一方分子表面あるいは周辺に存在していた秩序だった水分子について考えると複合体形成により水と蛋白質との相互作用は抗原抗体相互作用による非共有結合形成にとって代わられその結果水分子は溶媒に放出されるこれによりエントロピーは増加しエネルギー的貢献を果たすことになるこのような変化をエントロピー得と呼ぶこのように相互作用の熱力学的パラメータを算出することによりその結合様式についての知見を得ることができるこれまでの熱力学的解析の報告からは抗原抗体相互作用の多くはエンタルピー駆動型すなわち相互作用により獲得されたエンタルピー得がエントロピー損によって失われるような相互作用であることが示されている 3) 抗原抗体相互作用の速度論的な解析抗原抗体相互作用の速度論的解析には一般に表面プラズモン共鳴法による解析が用いられる相互作用する片方の分子をセンサーチップと呼ばれる金の薄膜が蒸着されたガラスに固定化しそこに他方の分子を添加した際にセンサー表面で起こる特異的相互作用を微細な質量変化として測定する観測された質量変化から結合の強さのみならず結合解離の速度についての情報が得られる溶液中で分子 A と分子 B が相互作用して複合体 AB となる場合の反応は以下の式で示される ( 式 3) A+B k on AB (3) k off ここで kon は結合速度定数 (association rate constant, 単位 :M s -1 ) koff は解離速度定数 (dissociation rate constant, 単位 :s -1 ) である各分子の t 時間後における濃度を [A] [B] [AB] とすると複合体の濃度変化率は式 (4) で表される Drug Delivery System 28 5,

3 d[ AB] = kon[ A][ B] koff [ AB] (4) dt d [ AB] 平衡状態では結合速度とはゼロとなるため dt k k on off [ AB] = = Ka [ A][ B] (5) となる表面プラズモン共鳴法では実験データに対して理論曲線をカーブフィッティングすることで結合速度定数 (kon) と解離速度定数 (koff) を算出しそれらの比から平衡結合定数 (Ka ) が算出されるしたがって結合定数のみならず結合と解離の過程の寄与についてのより詳細な情報を得ることができる前述の熱力学的解析とは異なる情報が得に通すと抗原抗体複合体を形成していない抗体を捕捉できる捕捉された抗体量の蛍光を測定することにより複合体形成時の未反応抗体量を測定その量から理論曲線に基づき平衡定数を求める方法であるビーズに通す速度を変化させることで速度論的な解析も可能となる本手法は特に抗原に対する高い親和性を有する抗体の解析に有効であり SPR 法と補完的な位置づけにある事実 SPR では解離速度定数が顕著に低い ( 抗原から解離しづらい ) 抗体に関する分析に関しては定量性が必ずしも十分でないのに対し KinExA 法はその原理から抗原が解離しづらい抗体の分析に適している抗体医薬品開発においては解離速度定数が低い抗体をいかに選別するかが重要な課題の 1 つでありそのような観点でも大変有益な情報を与えるられるため相互作用の本質を理解するためには双方を組み合わせることが好ましい 3. 抗体の分子認識機構蛋白質とリガンドとの相互作用においては結合定数のきわめて高いものが見られるが ( 例えばビオチン-アビジン間の相互作用は M -1 ) 抗原抗体相互作用の速度論的な解析によれば抗体の結合定数は M -1 を超えないこれは親和性の天井と呼ばれる単量体の抗原と抗体の相互作用の最大結合速度定数は 10 7 M sec -1 程度でありその値はそれぞれの分子の拡散定数によって制御される一方解離速度定数については制限がほとんど存在せず抗体の親和性には解離速度定数が変化することにより決定されているしかし天然に存在する抗体の解離速度定数は一般に 10-3 ~10-6 s -1 程度であり非常に遅い定数をもつ抗体分子は免疫系において選択されない 1) 抗体の構造抗体分子は大小 2 種類のポリペプチド鎖 (H 鎖と L 鎖 ) からなる分子である骨格構造の違いにより IgM IgG IgA IgD IgE の 5 つのクラスに分類されるいずれの抗体分子もクラスを問わず構成するすべてのドメインが immunoglobulin fold と呼ばれる 1 対のジスルフィド結合により安定化されたおよそ 100 アミノ酸残基からなる強固なβ バレル構造により形成されている 5 つのクラスのうち IgG は血清中に最も多く存在し汎用的に用いられている抗原との結合性は可変領域 (Fv: fragment of variable region) と呼ばれる分子量約 25k のドメインにより決定される ( 図 1a) 1~3) H 鎖の可変領域は VH ドメイン L 鎖の可変領域は VL 4)KinExA(Kinetic Exclusion Assay) 速度論的排除法 (Kinetic Exclusion Assay KinExA ということが多い ) は溶液中で行える測定法であること二次蛍光レポーター分子を必要とする点でいままでの生物物理学的手法とは異なる KinExA 装置はフロー型の蛍光分光光度計である測定したい試料溶液に蛍光標識抗体を混合し標的分子と抗原抗体複合体を形成させ平衡化するこの溶液を固定化した抗原を結合させてあるビーズドメインと呼ばれこれらはさらに相補性決定領域 (CDR:complementarity determining region) と呼ばれる特に配列変化に富む 6 つのループ (VH, VL 各鎖 3 つずつ ) とそれらを連結する骨格領域 (FR:framework region) から構成される ( 図 1b) 6 個 ( 重鎖から 3 個軽鎖から 3 個 ) の CDR が可変領域の一方に固まって存在し抗原認識領域を構成している ( 図 1b) CDR ループの立体構造についてはカノニカル 414 Drug Delivery System 28 5, 2013

4 図 1(a) F v H 鎖図 1(b) CDR V L V H V H VL L 鎖 CDR-L2 CDR-H3 CDR-H1 CDR-H2 C H1 C H1 C L CL F ab CDR-L1 CDR-L3 C H2 C H2 F C V L C H3 C H3 IgG V H 図 1 IgG の構造 (A)IgG の模式図各々の四角が Ig フォールドを表す灰色の線はサブユニット間のジスルフィド結合を表す (B)Fv 断片の構造 6 つの相補性決定領域 (CDR) を示してある構造と呼ばれるごく限られた主鎖の構造しかとらないことが示されている 4,5) 抗体の抗原認識能は各々の CDR のコンフォメーションと 6 つの CDR の相対的な配置そして CDR に存在するアミノ酸残基の側鎖の特徴によって決定されている 2) 抗原抗体相互作用の構造的特徴抗体は CDR により形成される立体構造により抗原を特異的に認識する抗原と抗体との間には形状相補性 (shape complementarity) が成り立っている 6) CDR のアミノ酸配列を変化させることにより低分子化合物から DNA やペプチド可溶性蛋白質ウイルス細胞表面抗原といった巨大分子までさまざまな分子を認識して結合するドメインの基本構造を維持した状態で結合特性を自在に変化させることができるのであるさまざまな抗体の抗原認識機構が詳細に解析されている低分子化合物の認識においては鍵と鍵穴のように CDR 領域に鍵穴が用意されておりそこに抗原がぴったりとはまり込む形で認識されることが多い我々は平間らが全合成に成功したエーテル環がトランス縮合で連なった構造を持った毒素シガトキシンを特異的に認識する抗体について詳細な解析を進めたが 7,8) 基本的には鍵と鍵穴の認識様式であり抗体のドメインレベルでの構造変化によって高い親和性を創出していたまた DNA やペプチドの認識においては構造変化を伴う誘導結合型の認識蛋白質の認識においては比較的平坦な面による認識が多い 9~11) このような観点から糖鎖認識を考えると糖鎖に特異的に結合できる抗体の調製が難しいことがわかる自己抗原に構造が類似しているという生物学的な理由のみならず化学構造の厳密な識別が抗体が準備する高次構造においては難しくかつ後述の水和脱水和によるエネルギー的な影響がきわめて大きいのである相互作用界面には多くのファンデルワールス相互作用水素結合イオン性相互作用芳香族性相互作用が形成され形状と電荷における相補性が存在する 6) 水分子が抗原抗体間に入りアミノ酸残基だけでは創出が難しい形状相補性に重要な役割を担う場合も多い 12,13) 興味深いことに CDR に存在して分子認識に用いられるアミノ酸の種類には偏りがある 14) すなわち 20 種のアミノ酸のうち芳香環では Tyr Trp それ以外としては Asn や Ser が CDR での出現頻度が高く抗原認識に関与することが多い Tyr Trp については側鎖がかさ高く疎水的相互作用やファンデルワールス相互作用をしやすいこと Drug Delivery System 28 5,

5 に加え水素結合や芳香族性の相互作用 (π-π 相互作用, カチオン-π 相互作用 ) も形成できるためと考えられる 3) 抗原抗体相互作用の熱測定 : モデル抗体を用いた分子認識機構解析蛋白質性抗原と抗体の相互作用は蛋白質性のプロテアーゼ阻害剤の相互作用と合わせて蛋白質間相互作用のモデルケースとしてもさまざまな観点から研究されてきた 12~14) 実際の官能基レベルでの議論には構造情報に基づいた変異導入解析が必要不可欠である熱力学的解析は相互作用によってやり取りされる熱量を測定することから相互作用に関与する残基を特定して変異体を調製熱量を測定することで各残基の熱力学的寄与について考察が可能となるさらに変異抗体と抗原との複合体の構造解析を組み合わせることで変異導入の効果を原子レベルで議論することが可能となる 15) 著者らは抗ニワトリリゾチーム (HEL) 抗体 HyHEL 10 の可変領域と抗原との相互作用をモデルとして抗体の分子認識機構の記述をめざしてきた 15) HEL 4)Tyr が果たす役割抗体は CDR のアミノ酸配列を変化させることにより抗原への特異性を獲得する先に述べたように CDR に存在するアミノ酸の種類には偏りがあり 16) 特に Tyr の CDR での出現頻度が高く抗原認識に関与する場合がきわめて多いそこで HyHEL 10 リゾチーム相互作用について抗原認識に直接関与している 6 つの Tyr について Phe あるいは Ala に置換し Tyr の役割を検討した相互作用の熱力学的解析結果を Table 1 に複合体の結晶構造を図 2に示す 17,18) どの Tyr も変異導入によって親和性が減少した得られた結果から Tyr は1 水酸基による相互作用に重要な水素結合の形成 2 芳香環によるファンデルワールス相互作用 3 NH π 相互作用 π π 相互作用形成 4 芳香環を用いた協同的抗原認識を可能にすることが明らかとなった変異導入効果は基本的にはエンタルピー - エントロピー補償則 19~21) に従っていたこの補償則から外れ親和性に大きく寄与している部位が energetic hot-spot となっているまた NH π 相互作用とπ π 相互作用がエントロピー損を最小限に抑えることで親和性に大きく寄与していることが明らかとなった芳香環と水酸基が持つ化学的な性質を巧みに利用して多様な特異性と高い親和 Table 1 Thermodynamic parameters of the interactions between hen lysozyme and HyHEL-10 wild-type and mutated Fvs at 303K (Tyr mutants) 1) 図 2 V H H-Y53 H-Y33 H-Y50 H-Y58 L-Y96 L-Y50 V L 抗ニワトリリゾチーム抗体 HyHEL-10Fv の抗原認識に関与する Tyr 残基これらの部位について部位特異的に変異体を作製し相互作用を熱力学的構造学的に解析した mutants stoichiometry ΔG [kj mol -1 ] ΔH [kj mol -1 ] ΔS [kj mol -1 K -1 ] Wild-type HY33F HY50F HY53F HY53A HY58F HY58A HY33A53A LY50A LY96F HY33A, HY50A 2) N.D. 1)VP ITC を用いて決定した 2) 親和性クロマトグラフィーでは精製できなかった 416 Drug Delivery System 28 5, 2013

6 H-Lys97 H-Trp95 H-Tyr33 W15 H-Ala96 H-Asp101 H-Asp32 H-Asn94 図 3 HyHEL-10Fv とニワトリリゾチーム (HEL) との相互作用における塩橋の役割変異導入箇所周辺を示してある VH 鎖 Asp96 への変異導入によって界面に水分子が残り水素結合を形成していることがわかる性を与えることが可能となるわけであるあらゆる抗体で芳香環が分子認識に用いられていることを考えればある特定の抗原に対する特異性は芳香環が適切に配置され荷電残基の適切な配置から創出される相互作用表面の形状相補性から生じるといってよいのかもしれない Sidue らは CDR への無作為変異導入によって Asp Ser Tyr のみのアミノ酸で構成される CDR により特異的な分子認識ができる可能性を報告しており 22, 23) 単に親和性が高いというだけでなく高特異性創出の可能性がある点で興味深い 5) 塩結合 ( 塩橋 ) 静電的な相補性は生体高分子の相互作用において不可欠である 24~26) 負電荷のアミノ酸側鎖と正電荷の側鎖の間に形成される静電的相互作用 ( 塩橋塩結合と呼ぶ ) が蛋白質相互作用の特異性親和性を支配している場合も多い 24~26) 抗原抗体相互作用の特異性親和性においても塩橋形成の重要性が考えられる HyHEL 10Fv HEL 複合体間には HEL の Lys97 と HyHEL 10 の Asp32 Asp96 の間に 2 本の塩橋形成が観察されているそこで塩結合を欠損させる変異を導入し相互作用を熱力学的に解析したところ負のエンタルピー変化量負のエントロピー変化量が大幅に上昇した (Table 2) これらの結果は塩橋がエントロピー的な寄与すなわち塩橋形成によるエンタルピー得エントロピー損よりも脱水和によるエンタルピー損エントロピー得の寄与が大きく結果として相互作用にはエントロピー的寄与を果たすことを示している 27) この結果の構造的根拠を明らかにするため変異体 - 抗原複合体の結晶構造を解析した全体構造にはほとんど変化はなく可変領域間相互作用の変化があったことそして置換を導入した箇所に水分子が配位し新たな水素結合が複数形成されていた ( 図 3) 28) 中西らが明らかにした抗原が結合し Table 2 Thermodynamic parameters of the interactions between hen lysozyme and HyHEL-10 wild-type and mutated Fvs at 303K (salt-bridge deleted mutants) 1) Mutants stoichiometry ΔG [kj mol -1 ] ΔH [kj mol -1 ] ΔS [kj mol -1 K -1 ] Wild-type HD32A HD96A HD32AD96A ( 二重変異体 ) 1)OMEGA を用いて決定した Drug Delivery System 28 5,

7 ていない ( 抗原フリーの )HyHEL 10Fv の結晶構造においてはこの Asp96 に温度因子 ( 構造安定性の尺度を示す ) の低い水和水が存在している ( 未発表 ) 抗原との結合によりこの水和水が解放されることになるすなわち塩橋形成における水和水の解放によるエンタルピー損 ( 吸熱 ) とエントロピー得が塩橋形成によるエンタルピー得 ( 発熱 ) とエントロピー損を上まわっているわけである以上はこの相互作用における塩橋の寄与がエントロピー損の減少であること換言すれば親水的環境下にある静電相互作用の寄与がエントロピー的であることを実験的に示したということになる溶媒露出した塩結合の相互作用への寄与という観点からも溶媒に露出したアミノ酸残基によって形成される塩結合がエントロピー的寄与を果たしているという知見には一般性がありそうである 29) 事実リガンド設計においても水素結合や塩結合を形成しうる官能基の導入が結果として脱水和によるエンタルピー損を伴い親和性向上を難しくしている例が多く報告されつつある 30) 最近の我々の IL 15 受容体の相互作用解析をみても塩結合形成が相互作用に大きく貢献できるのは塩橋形成に関与するアミノ酸残基が疎水環境下にあるものに限られている 31) 蛋白質の水和構造の本質的理解が重要であるといえる 6) 水素結合 (Asn Ser の場合 ) 抗原抗体相互作用において形成される水素結合は特異性を決定する要因の 1 つと考えられている先に述べたように Tyr の中に水酸基による水素結合がきわめて重要な貢献をしている部位が存在することがわかった前述したように Asn Ser が Tyr に続いて CDR 中に存在する数の多いアミノ酸でありその側鎖の官能基は相互作用界面においてしばしば水素結合を形成しているそこで HyHEL 10Fv HEL 相互作用において Asn Ser が形成するアミノ酸残基同士の直接的な水素結合の役割を調べるためその側鎖が抗原と直接的な水素結合を形成する抗体残基の中で Asn については軽鎖中の L Asn31 L Asn32 L Asn92 について Ser については重鎖中の H Ser31 H Ser54 H Ser56 について部位特異的変異導入を施した前者はそれぞれ Asp および Ala に後者は Ala に置換した変異型抗体を作製し水素結合欠損時の抗原との相互作用を熱力学的測定および複合体の結晶構造により考察した 32) HyHEL 10Fv HEL 相互作用におけるすべての直接的な水素結合はいずれも好ましいエンタルピー的な寄与を行うことそしてその寄与の大きさには強弱が存在していた L Asn31/Nδ2 および L Asn92/Nδ2 が抗原と形成する直接的水素結合はその欠損による結合定数の低下は小さくまた構造変化あるいは他の相互作用の獲得により相補可能なエネルギー的に付加的な水素結合である一方 L Asn32/Nδ2 の形成する水素結合は抗原抗体界面の構造を堅くするすなわちエントロピー的な不利性が非常に大きいもののそれ以上の著しいエンタルピー的な有利性によって抗原に対する親和性創出において決定的な役割を果たすことそしてその欠損は構造変化あるいは他の相互作用の獲得によっては相補できないことが明らかになったまた LN31A LN32A LN32D 変異体の解析結果より L Asn31 および L Asn32 が HEL HyHEL 10Fv 抗原抗体相互作用におけるパラトープ側の energetic hot spot であることも確認した一方 Ser についてはエンタルピー -エントロピー補償により見かけ上その親和性への寄与が少ないことがわかったこれらの結果は強い疎水的環境にあるようなアミド基カルボニル基による静電的水素結合が非常に大きな寄与を果たすことを示唆しているすなわち強い疎水的環境下にある静電的相互作用を Asn 側鎖が形成できることから Tyr と並んでより頻繁に抗原認識に用いられていることが推察される 7) 単変異導入解析が明らかにした特徴さまざまな変異体を用いた解析から蛋白質相互作用において特異性を支配するとされる部位である Hot Spot はそのアミノ酸残基が形成する非共有結合が親和性に大きく影響する部位 (energetic hot spot) と構造形成に重要なアミノ酸残基 (structural hot spot) に分かれることが明らかとなった 15) 変異体を用いた相互作用の熱力学的ならびに構造的解 418 Drug Delivery System 28 5, 2013

8 析は水和構造の変化をはじめ有益な知見を多く与えている例えば energetic hot spot への変異導入は微小な変異導入であっても界面の広範囲にわたる大幅な構造変化がおき場合によってはエンタルピー変化量を大幅に減少させてしまうこれは energetic hot spot において形成される非共有結合は界面の他の部位で形成される相互作用を誘導する役割を果たすことを意味する一方相互作用界面に存在する hot spot でないアミノ酸残基への変異導入解析からこれらは親和性向上にある程度貢献するものの置換には寛容であることがわかったこれは熱力学的にはエンタルピーエントロピー補償則によるものであり構造的には水和水の界面への導入による場合が多かった相互作用界面に存在する水和水のふるまいを如何に考慮できる 32) か蛋白質相互作用の本質的理解に不可欠であることはいうまでもない誘導結合 (induced fitting) の貢献そのものがエンタルピー的であったこと 33) も構造の柔らかさそのものが高親和性には直接的には貢献できないことを意味しており特異性創出機構の解明の関連で重要であろう先に述べたように糖鎖特異的抗体が糖鎖の化学構造だけを識別することが容易でないのも糖鎖の水和構造と柔らかさ抗体が構築可能な相互作用界面の高次構造を鑑みれば納得できるであろう 4. 抗体の高親和性創出には抗原との相互作用界面だけでなく抗体可変領域間 (VH-VL) 相互作用も重要である変異抗体の選択を行い TEL に対して高い親和性を持つクローンを選択した 34) 2 つのリゾチーム間で構造の異なる領域の 1 つを認識している重鎖の相補性決定領域 2(CDR H2) に着目し 4 部位 ( 位 ) について変異を導入した選択により得られた変異体はいずれも 58 位に Phe を有していたまたそれ以外の 3 カ所についてはコンセンサス配列はなかった次にこれらの変異体を用いてリゾチームとの相互作用を等温滴定型熱量測定により解析した野生型に比べ選択された変異体の TEL に対する結合定数は 3~4 倍上昇し HEL に対しては 1/30~1/7 に減少していた ( 図 4) K a /10 7 M -1 at 308K WT Tyr Ser Ser Tyr SFSF Ser Phe Ser Phe AEAF Ala Glu Ala Phe ETKF Glu Thr Lys Phe Y58F Tyr Ser Ser Phe 生体がインフルエンザなどのある特定の抗原に対する抗体を準備していてもその抗原への変異導入により抗体の結合活性が失われるという例が多く知られている抗原への変異導入に対して抗体がどのようにして自身の抗原認識領域 ( パラトープ ) を変化させ野生型と同じ領域 ( エピトープ ) を認識できるかについて理解することは抗体の抗原認識機構の記述においてもきわめて興味深いそこで HyHEL 10 について親和性が低下する変異抗原のモデルとしてシチメンチョウリゾチーム (TEL) を用いファージディスプレイ法を用いて変異導入個所に対して特異的分子認識能を創出する図 4 ファージディスプレイにより選択された各変異体の HEL TEL に対する親和性灰色 : 元の抗原 ( ニワトリリゾチーム,HEL) に対する親和性黒 : 変異抗原 ( シチメンチョウリゾチーム,TEL) に対する親和性図の下のアミノ酸は位のアミノ酸残基を示すまたすべての変異体で選択された Phe への変異のみで TEL に対する親和性の上昇は達成されていたものの HEL への親和性も低下しなかった 58 位以外の 3 カ所におけるアミノ酸残基により特異性変換が実現したことまた興味深いことに親和性向上はいずれも負のエンタルピー変化量の上昇によることが明らかとなった 34) 親和性成熟前と後 Drug Delivery System 28 5,

9 の抗体の抗原相互作用に関する熱力学的解析は皿井ら古川らによって抗ニトロフェノール (NP) 抗体で負のエンタルピー変化量の上昇に伴うものであることが明確に示されており 35, 36) 人工変換により達成された親和性向上はこれと一致するものであったこのような特異性変換機構を得られた変異抗体と抗原複合体について結晶構造解析を行うことで原子レベルで記述した 37) この特異性変換は標的部位において相補性を改善するというわけではなくむしろ抗体の抗原認識において貢献する各 CDR の微調整 VH VL 間相互作用の微調整さらには抗原認識領域全体の微調整により創出されることが示された 38) 蛋白質性抗原については構造情報に基づいて相補性そのものを改良しようと試みる戦略も重要であるが本研究結果から明らかになったように特異性親和性の調節が相互作用界面だけではなく可変領域相互作用の微調整 38~40) により行われることを十分考慮する必要がある可変領域相互作用の重要性は後述の抗体のヒト化でも強調されることになる 5. マウス抗体のヒト化 : 抗原認識面を別のフレームワークに移植する際も VH-VL 相互作用を制御することが特異性親和性保持に重要であるマウス抗体はヒトに対しては異物となることからマウス抗体をヒトへと投与した場合異物と認識され投与したマウス抗体に対するヒト抗体が産生されることによる副作用が懸念されるそこでマウス抗体のヒト型化技術が開発されてきたこれはマウス抗体の CDR をヒト抗体に移植 ( これをグラフティングと呼ぶ ) するというものである英国 MRC の Riechmann らはグラフティングによるマウス抗体のヒト型化を試みた 41) ところ単に CDR を移植しただけでは抗原結合活性がなく CDR の立体構造を維持するために必要と考えられるアミノ酸残基をさらに移植したところ抗原結合活性が回復することが明らかとなったこの結果は CDR グラフティングに CDR のループ構造を安定化するフレームワーク上のアミノ酸残基を組み合わせることがヒト型化には重要であることを示している中西らはマウス抗体のヒト型化が標的抗原に対する特異性あるいは親和性に与える影響を明らかにするためにニワトリリゾチーム抗体 HyHEL 10 をヒト型化しその抗原との相互作用を精査した 42) 骨格領域はもっとも相同性の高いヒト抗体由来配列を用い 6 つある CDR 配列をそのままグラフティングしたデザインした抗体可変領域についてその分子認識特性を解析した等温滴定型熱量測定によればヒト型化によって抗体の親和性は 10 倍低下していたしかしながら相互作用により形成される非共有結合の数をおおよそ反映するエンタルピー変化の絶対量が上昇した (Table 3) Table 3 Thermodynamic parameters of the interactions between hen lysozyme and humanized, mutated humanized, and mouse HyHEL-10 Fvs(303 K) 1) Mutants stoichiometry ΔG [kj mol -1 ] ΔH [kj mol -1 ] ΔS [kj mol -1 K -1 ] humanized HW47Y HQ39K W47Y mouse )VP ITC を用いて決定したこれはヒト型化によって相互作用のエネルギー獲得に不利なエントロピー変化量が大きくなり結果として親和性を低下させていることを意味する相互作用界面に存在するアミノ酸残基はマウス抗体とヒト型化抗体ですべて同じなので負のエンタルピー変化量が上昇していることは相互作用時に形成される非共有結合に差があることを示唆する不利なエントロピー変化量が大きくなるということの要因として水和構造の変化ならびに相互作用に伴う蛋白質高次構造の変化が考えられる中西らはこの抗体の可変領域間相互作用に着目した HyHEL 10 には VH VL 界面に特徴的なアミノ酸残基を 2 つ (Gln39,Trp47) 有しているそこでまず Trp47 をマウス型の Tyr に変異させたところエンタルピー変化量がヒト型化抗体とほぼ等しい状態で親和性が回復した次にさらに Gln39 をマウ 420 Drug Delivery System 28 5, 2013

10 6.CDR 領域の構造を支える Vernier 残基の役割図 5 V H ス型の Lys に変異させたところ負のエントロピー変化量が減少し親和性が向上した 42) (Table 3) ヒト型化抗体 - 抗原二重変異導入ヒト型化抗体 - 抗原複合体の結晶構造解析を行ったところ ( 図 5) 相互作用界面に形成される相互作用それらに関与するアミノ酸群はパラトープエピトープともにほとんど変わりがなく唯一変異を導入した VH VL 間相互作用に変化を生じていることが明らかとなった 42) 以上の結果はマウス抗体のヒト型化における特異性あるいは親和性の低下の原因の 1 つが可変領域間の相互作用にあることを示しておりマウス抗体のヒト型化においては単に抗原との相互作用界面を移植するだけでなく抗体の抗原認識様式そのものを正しく移植するために骨格領域における相互作用界面の微調整が重要であることを強く示唆しているヒト型化抗体の親和性あるいは特異性をマウス抗体と同等のものにしていくうえで 6 つある CDR を適切な構造に置くことそして可変領域間相互作用を考慮することが重要であるということになる HEL V L ヒト型化抗体 - 抗原複合体と変異導入ヒト型化抗体 - 抗原複合体の構造比較灰色 : ヒト型化抗 HyHEL-10 黒 :HQ39KW47Y 変異体骨格領域中の CDR ループ構造を支えるアミノ酸残基群は Vernier ゾーンと呼ばれる 43~45) ヒト型化においてもこの Vernier ゾーンのアミノ酸残基が重要であることが指摘されてきた真壁らはこの領域が抗体の抗原に対する高特異性親和性創出に果たす役割を考察するためにヒト上皮成長因子受容体 (EGFR) 特異的マウス抗体 528 の可変領域に着目したまず 528Fv 領域にもっとも相同性の高いヒト抗体可変領域の骨格領域を選び出しマウス抗体 528 の CDR 領域を移植することでヒト型化 528 抗体を構築した 46) このヒト型化 528 抗体が持つ抗原に対する親和性はマウス抗体 528 に比して 40 分の 1 程度に低下した等温滴定型熱量測定によればこの親和性の低下は相互作用に伴う負のエンタルピー変化量の大幅な減少に起因していた抗原認識に関与するすべての領域を移植しているにもかかわらず負のエンタルピー変化量が減少していることから相互作用様式がヒト型化によって変化している可能性が考えられたヒト型化抗体とマウス抗体の結晶構造を解析したところ CDR ループ構造も含め顕著な構造の相違は見いだされなかったそこで両者で異なる Vernier ゾーンのアミノ酸残基に着目した ( 図 6) VL 鎖の Vernier ゾーン残基図 6 V L CDR-loops V H ヒト抗体とマウス抗体で異なる Vernier 残基 2 つの抗体で異なる Vernier 残基を CPK により示した Drug Delivery System 28 5,

11 は全く同じであったことから VH 鎖で異なる残基に着目しヒト型化抗体の Vernier ゾーン残基をマウス抗体のものに変異させたところ以下が明らかとなった 1いくつかの部位あるいはその組み合わせによってエンタルピー変化量はマウス抗体と同等の値に回復していたまたこのような変化の見られない部位組み合わせも存在した 2 親和性はヒト型化抗体に比して 4 倍程度の上昇に留まっていたまた蛋白質水和構造の変化の指標となる定圧モル比熱変化量の絶対値が大幅に上昇していた 3 親和性の上昇を阻んでいるのは他の相互作用と同様にエンタルピー -エントロピー補償に起因していた 4エントロピー変化が不利に働く要因としてコンフォメーショナルエントロピーの減少が示唆されたこれらの結果から Vernier ゾーン残基は抗原抗体相互作用においてエンタルピー的寄与すなわち相互作用形成を促進させる方向には向かわせる貢献を果たしているもののコンフォメーショナルなエントロピー損失を招く例えばその貢献は構造変化あるいは水和水の固定などの効果によって補償されてしまうことになる CDR とその周辺構造を抗原認識のための最適な状態に固定することの難しさを改めて浮き彫りにする結果となっている 7. おわりに本稿では抗体開発における相互作用解析について概説したのち我々の研究結果を中心に構造物性解析から明らかにした標的抗原に対して抗体が特異性親和性を創出する仕組みを述べた蛋白質工学という概念が 1983 年に提唱された際にそのモデルとして最適な分子として抗体が挙げられている 47) 創薬研究や生命科学研究における分子認識素子としての重要性は増すばかりである構造解析と物性解析のクロストークから相互作用の機構解明だけでなく分子デザインの指針が示されつつある抗体の自在な改良改変がいよいよ現実的な課題になってきているといえる文献 1)Colman, P.M. (1988)Adv. Immunol. 43, 99 2)Braden, B.C. & Poljak, R.J. (1995)FASEB J. 9, 9 3)Davies, D.R. & Cohen, G.H. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7 4)Chothia, C. Lesk, A.M., Tramontano, A., Levitt, M., Smith- Gill, S.J., Air, G., Sheriff, S., Padlan, E.A., Davies, D., Tulip, W.R. et al. (1989)Nature 342, 877 5)Shirai, H. Nakajima, N., Higo, J., Kidera, A., & Nakamura, H. (1998)J Mol Biol. 278, 481 6)Padlan, E.A. (1996)Adv. Protein Chem., 49, 57 7)Tsumoto K, Yokota A, Tanaka Y, Ui M, Tsumuraya T, Fujii I, Kumagai I, Nagumo Y, Oguri H, Inoue M, Hirama M (2008). J Biol Chem. 283, )Ui M, Tanaka Y, Tsumuraya T, Fujii I, Inoue M, Hirama M, Tsumoto K. (2008)J Biol Chem. 283, )Schultz, P.G., Yin, J., & Lerner, R.A. (2002)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, )Bhat, T.N., Bentley, G.A., Boulot, G., Greene, M.I., Tello, D., Dall'Acqua, W., Souchon, H., Schwarz, F.P., Mariuzza, R.A., & Poljak, R.J. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, )Ladbury, J. E. (1996)Chem. Biol. 3, )Janin, J. & Chothia, C. (1990)J. Biol. Chem. 265, )Lo Conte, L., Chothia, C., & Janin, J. (1999)J. Mol. Biol. 285, )Bogan, A.A., & Thorn, K.S. (1998)J. Mol. Biol. 280, 1 15) 津本浩平 (2006) 生化学 78,93 16)Mian, I.S., Bradwell, A.R., & Olson, A.J. (1991)J. Mol. Biol. 217, )Tsumoto, K., Ogasahara, K., Ueda, Y., Watanabe, K., Yutani, K., & Kumagai, I. (1995)J. Biol. Chem. 270, )Shiroishi M, Tsumoto K, Tanaka Y, Yokota A, Nakanishi T, Kondo H, Kumagai I (2007)J. Biol. Chem. 282, )Dunitz, J.D. (1995)Chem Biol. 2, )Hunter, C.A., & Tomas, S. (2003)Chem. Biol. 10, )Sharp, K. (2001)Protein Sci. 10, )Fellouse, F.A., Wiesmann, C., & Sidhu, S.S. (2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, )Fellouse, F.A., Li, B., Compaan, D.M., Peden, A.A., Hymowitz, S.G., & Sidhu, S.S. (2005)J. Mol. Biol. 348, )Novotny, J. & Sharp, K. (1992)Prog Biophys Mol Biol. 58, )Kumar, S. & Nussinov, R. (2002)ChemBioChem 3, )Sinha, N., & Smith-Gill S.J. (2002)Curr Protein Pept Sci. 3, )Tsumoto, K., Ogasahara, K., Ueda, Y., Watanabe, K., Yutani, K., & Kumagai, I. (1996)J. Biol. Chem. 271, )Shiroishi, M., Yokota, A., Tsumoto, K., Kondo, H., Nishimiya, Y., Horii, K., Matsushima, M., Ogasahara, K., Yutani, K., & Kumagai, I. (2001)J. Biol. Chem. 276, )Shiroishi, M., Kuroki, K., Tsumoto, K., Yokota, A., Sasaki, T., Amano, K., Shimojima, T., Shirakihara, Y., Rasubala, L., van der Merwe, P.A., Kumagai, I., Kohda, D., & Maenaka, K. (2006)J. Mol. Biol. 355, )Velazquez-Campoy, A., Todd, M.J. and Freire, E. (2000) Biochemistry 39, )Sakamoto S, Caaveiro JM, Sano E, Tanaka Y, Kudou M, Tsumoto K. (2009)J. Mol. Biol. in press. 32)Yokota, A., Tsumoto, K., Shiroishi, M., Kondo, H., & Kumagai, I. (2003)J. Biol. Chem. 278, Drug Delivery System 28 5, 2013

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<4D F736F F D B82C982C282A282C482512E646F63> サンプル条件および固定化分子の選択 Biacoreの実験ではセンサーチップに固定化する分子をリガンドそれに対して結合を測定する分子をアナライトと呼びますいずれの分子をリガンドとしアナライトとするかは実験系を構築する上で重要です以下にサンプルに適したリガンドアナライトの設計方法やサンプルの必要条件などをご紹介しますアナライトリガンドセンサーチップ (1) タンパク質リガンドとしてもアナライトとしても用いることができます