2 Characterized protein /ORF of interest Transformation / Transfection Prokaryotic cells Eukaryotic cells Bacterial culture Cell culture Cell Lysis an

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2 2 Characterized protein /ORF of interest Transformation / Transfection Prokaryotic cells Eukaryotic cells Bacterial culture Cell culture Cell Lysis and Protein extraction CelLytic タンパク質抽出試薬 : 8 ページ RIPA バッファー : 9 ページ プロテアーゼインヒビターカクテル : 10 ページ ホスファターゼインヒビターカクテル : 11 ページ Purification Detection FLAG アフィニティゲル ペプチド キット : 12 ページ FLAG 抗体 2 次抗体 キット : 18 ページ HIS-Select (poly-his タグ精製 ): 15 ページ poly-his 抗体 関連製品 : 20 ページ その他タグ精製 (HA, c-myc, GST など ): 17 ページ HA c-myc GST 抗体 : 21 ページ A n a l y s i s

3 Technical Support Recombinant Protein Expression Cloning 宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるために 目的の遺伝子を組み込んだベクターが用いられています その際 目的タンパク質の検出や精製用にタグと呼ばれるペプチドやタンパク質がよく利用されます それぞれのタグによって特徴があり 目的や用途に応じたタグの選択が重要になります よく使用されているタグの 1 つである FLAG タグは 親水性の 8 アミノ酸残基からなる短いペプチドタグ (3xFLAG は 22 アミノ酸残基 ) のため 発現されたタンパク質の高次構造や機能が変化してしまう可能性を抑制できます シグマでは様々な FLAG タグ発現ベクターをご用意しています ベクターおよび各種プロトコールは Web ページをご覧下さい Transfection /Transformation 上記で作製した発現ベクターを細胞に導入します ( 哺乳動物細胞 大腸菌 昆虫細胞 酵母等 ) シグマのトランスフェクション試薬は Web ページをご覧下さい Expression 各種発現系で発現したタンパク質は 宿主の生物特性によってそれぞれ異なった修飾を受けます ( 翻訳後修飾 ) また タンパク質の発現 は目的タンパク質の構造や大きさなどの条件により発現系別に異なる制約を受けます Lysis 細胞を溶解し タンパク質を抽出します シグマの CelLytic シリーズはマイルドな界面活性剤を混合しているため タンパクを変性させる ことなく抽出することが可能です 細胞や組織 生物種など各サンプルに最適な界面活性剤を配合した CelLytic をご用意しています また 細胞の溶解において タンパク質の分解を防ぐことが重要になります 生体サンプル中には様々なプロテアーゼが存在しているため 一種類のプロテアーゼ阻害剤 ( プロテアーゼインヒビター, protease inhibitor) のみではタンパク質分解の抑制が不十分です そのため複数の阻害剤を組み合わせて使用されています シグマでは各種サンプルに適したインヒビターカクテルをご用意しています 詳しくは 10 ページをご覧下さい Purification 発現させた目的の組換えタンパク質を精製します 精製方法はタグによって異なりますが 抗原抗体反応を利用した精製 (FLAG HA タグなど ) や 金属キレートによる精製 (poly-his タグ ) などが挙げられます シグマの FLAG による精製プロトコールは Web ページをご覧下さい Detection 目的タンパク質の発現確認や 細胞 組織内の局在解析などを目的として様々な検出法があります 具体的にはウェスタンブロットや ELISA 免疫細胞化学 免疫組織染色 免疫蛍光染色などが行われています sigma.com/flag-jp

4 4 FLAG 組換え融合タンパク質の発現 精製 検出用に開発された FLAG 発現システムは 非常に優秀なタグ システムといえます ウェスタンブロット 免疫組織化学 免疫沈降 フローサイトメトリー タンパク質精製やタンパク質間相互作用 細胞の微細構造 タンパク質同定等 数多くのアプリケーションで応用が可能となっています FLAG 発現システムでは FLAG ベクターにより目的タンパク質に融合して発現される短い 8 残基の親水性ペプチド (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) を用いています FLAG ペプチドは親水性なので融合タンパク質の表面付近に存在しやすくなっているため FLAG ペプチド特異的抗体の結合やエンテロキナーゼによる切断が可能です また FLAG ペプチドは短鎖であり分子量が小さいため 融合タンパク質内のその他のエピトープやドメインを覆う可能性が低く 機能の変化や分泌 移動を阻害する可能性も抑えられます FLAG ペプチドは化学合成による作製をおこなうことができるため 様々な応用が可能となっています 化学合成を行う際には 一般的には Fmoc 固相合成法によるペプチド合成が採用され アプリケーションに応じて必要な修飾を FLAG ペプチドに施すことが可能となっています Fmoc 固相合成法によるペプチド合成の利点は 任意の配列に希望の修飾を比較的容易に行えることです また近年注目を集めているクリックケミストリーを利用したアプリケーションに対応できる点も ペプチド合成によるメリットといえます クリックケミストリー (click chemistry) は K.Barry Sharpless らによって提唱された 簡単かつ安定な結合を作る新しい手法です A + B A B DBCO-containing molecule A Azide-containing molecule B Conjugate of A and B, cross-linked via Triazole moiety クリックケミストリーにはいくつかの手法があります 2 分子間でトリアゾール環を形成させるクリックケミストリーでは一般的に銅 (Ⅰ) イオンを触媒として使用しますが 生体分子同士の結合には毒性が高いために使用できません しかしアジド基に対して高い選択性と反応性を持った三重結合化合物シクロオクチン (cyclooctyne) を用いることで 触媒 ( 銅イオン ) の無い条件下でも容易にアジドと反応し より温和な条件で任意の分子間の結合をおこなうことが可能となります ( 上図 ) この方法は毒性が懸念される銅イオンを使用しないことで組織 細胞内での利用も可能で 創薬における新しい分子の設計 リガンドとしての役割も期待されている手法です

5 Technical Support そこでこの方法を利用して ペプチド合成により作製した FLAG ペプチドの末端にアジド基を修飾し 一方 標的となるタンパク質にシクロオクチンを導入することで 標的タンパク質に FLAG ペプチドを特異的に結合させることが可能となります また FLAG ペプチドに特異性の高い ANTI-FLAG モノクローナル抗体 (M1 M2 M5) およびポリクローナル抗体を利用することで FLAG ペプチドを結合させた標的タンパク質の検出 精製が可能となります 精製には ANTI-FLAG M2 アフィニティゲル (CAT.NO. A2220) を利用することによって 非常に簡便な作業で 非変性条件下において FLAG ペプチドあるいは 3xFLAG ペプチドによる拮抗的な溶出が可能になります クリックケミストリーを利用した分子間の結合は ペプチドを抗原とした抗体作製にも応用が可能です ペプチドを抗原とする抗体作製を行う場合 まず初めに標的となるタンパク質のどの部分をエピトープにするか いわゆる抗原部位解析を行います エピトープとなる部分の親水性 / 疎水性のバランス 二次構造 立体構造の予測 抗原性の評価 検証を行い 抗体を利用するアプリケーションに応じて抗原配列を設計します 抗原部位として決定した配列のペプチドを化学合成し 免疫用抗原ペプチドが得られます ペプチドのままだと非常に小さな分子であり抗原性に乏しいため キャリアとなるタンパク質のコンジュゲートが必要となります 通常は抗原ペプチドの末端にシステイン (C Cys) を付加して その側鎖にある SH 基を介してキャリアタンパク質にコンジュゲートさせます しかしながら 抗原部位として設計した配列の中にシステインが含まれていると ペプチド末端にシステインを付加しても 選択的に末端のシステイン側鎖 SH 基を介してのコンジュゲートが困難となり 良質な抗原が得られにくくなります この場合 抗原ペプチドの末端にアジド基を修飾し コンジュゲート対象となるキャリアタンパク質にシクロオクチンを導入することで 配列中のシステインの存在を問題とすることなく抗原ペプチド - キャリアタンパク質のコンジュゲートを行うことが可能となります このようにクリックケミストリーを利用したペプチド - タンパク質のコンジュゲートは色々な用途で使用できます ペプチド - タンパク質のコ ンジュゲートのプロトコールは次のページでご紹介いたします プロトコール紹介 技術協力 : 株式会社細胞工学研究所 以上ご紹介した方法は弊社の既存の FLAG システムによる精製関連製品 (P12~) などで利用できますが FLAG ペプチド アジド基を含 むペプチド合成は シグマアルドリッチ受託合成サービスでも利用が可能です また 抗 FLAG ペプチド抗体を含む抗ペプチド抗体 ( モノクロー ナル ポリクローナル ) の受託作製サービスもご利用いただけます その他特殊修飾 受託作業等 お気軽にお問い合わせください

6 6 使用する試薬 BSA KLH (Keyhole limpet hemocyanin) 架橋剤 Dibenzylcyclooctyne-NHS Ester( 略称 :DBCO-NHS) 1 DMSO PBS(pH7-9) 1M Tris-HCl(pH8.0) アジド化ペプチド PD-10 カラム ( 脱塩用カラム ) 手順 1. キャリアータンパク質 10mg を PBS 1mL に溶かす (10mg/mL) 2. PBS で平衡化した PD-10 カラムにかける (5mg/mL) ( サンプルを 1mL アプライ後 さらに 2mL の PBS を流し その後 PBS 2mL で溶出する ) ( 本操作は タンパク質試料の夾雑物や不溶性のタンパク質を除くために行う ) 3. DBCO-NHS 1mg を DMSO 200µL に溶かす (DBCO-NHS 5mg/mL) 4. 3 の DBCO-NHS 溶液を 2. の溶出液に加え 室温 30min 反応 5. 反応後 1M Tris-HCl(pH8.0) を 100µL 加え 室温 5min 反応 6. 反応後 PBS で平衡化した PD-10 カラムにかける (5mg/mL) ( サンプルを全量アプライ後 さらに 1mL の PBS を流し その後 PBS 2mL で溶出する ) の溶出液を 8 本に分注する (250µL/ 本 ) 8. アジド化ペプチド 1mg を PBS 250µL に溶かし ( ペプチド 4mg/mL) 7. の 1 本に加える 2 9. 室温 3hr 反応 (BSA- ペプチドは SDS-PAGE によるチェックが可能 3 ) 10. 反応後は -20 にて保管する (2.5mg/mL 0.5mL) * キャリアー -DBCO 溶液 (7. の溶出液 ) が余った場合には -80 で保存可能 使用時に融解し 手順 8 より試験を再開することができる

7 Technical Support ( 1)DBCO-NHS 取り扱い時の注意点 乾燥剤とともに密封し -20 で乾燥剤とともに保存 使 用時には十分室温に戻す 使用直前に溶媒に溶かす 有機溶媒に溶解したものであ れば 冷凍で数日間保管できる (NHS エステルは容易に加水分解にされ 失活するので 取り扱い 保存には十分注意する ) 反応時は ph7-9 アミン及びアジ化合物を含まないバッ ファーを使用する DBCO-NHS は水系バッファーには不要であるため まず は DMSO に溶かし それを反応バッファーで希釈して 使用する 開封後も使用可能であるが 開封時に 1mg ずつ分注して おくとよい ( 3)SDS-PAGE によるチェック (kda) ( 2) ペプチドの溶解 難水溶性のペプチドに関しては まずは少量の DMSO に溶 かした後 PBS で 250µL とする Lane サンプル アプライ量 (µl/lane) サンプリングする工程 1 BSA 2 2. PD-10 カラム後 2 BSA-DBCO 1 6. PD-10 カラム後 3 BSA-DBCO- ペプチド 1 9. 反応終了後 Hybrid Molecule for DDS DDS Drugs Peptides - Drug Delivery System - Cell penetrating Glyco-chain Glyco-lipid S-S Bond Click Chemistry etc Monoclonal Antibody DNA/RNA Oligos Liposome Functional Molecule Carbon nanotube Fullerene Nanoparticle! Scientific Support TEL : genosysjp@sial.com

8 8 セルリティックシリーズ : タンパク質を効率的にかつ失活させずに抽出できる界面活性剤 CelLytic は各発現系に合わせて細胞を溶解し タンパク質を抽出するために調製された試薬です プロトコールに従って操作するだけで簡単に細胞を溶解できます CelLytic は数々のプロテアーゼインヒビター キレート剤 カオトロピック塩などと共に用いることが可能です CelLytic を除去せずにアフィニティ精製やウェスタンブロット ゲルシフトアッセイ リポーター検出などを行えます 従来の凍結融解法や超音波破砕よりも簡単 高収率で抽出できる試薬です バクテリア ( 大腸菌 ) サンプル用 サンプルタイプバクテリア ( 大腸菌 ) サンプル形態 バクテリア細胞ペレット :CelLytic B シリーズ 製品名 CelLytic B CelLytic B 2X CelLytic B 10X CAT.NO./ 価格 ( ) B ML B ML 7,700 42,300 製品特徴独自の両性イオン界面活性剤を配合した 40 mm Trizma HCl 溶液 B ML B ML 14,900 51,400 CelLytic B の 2 倍濃縮タイプ 全体の液量を減らしたい場合やタンパク濃度を高くしたい場合に適しています C ML C ML C ML 12,400 41,200 71,300 CelLytic B の 10 倍濃縮タイプ バッファー成分不含のため 抽出試薬のカスタマイズが可能です 用法 小スケール :1.5 ml 培養からのべレットあたり 0.4 ml 大スケール : ペレット湿重量 1g あたり 10 ~ 20mL 小スケール :1.5 ml 培養からのべレットあたり 0.2 ml 大スケール : ペレット湿重量 1g あたり 5mL ご希望のバッファーで 倍希釈でご使用下さい 小スケール :1.5 ml 培養からのべレットあたり希釈した CelLytic 0.4 ml 大スケール : ペレット湿重量 1g あたり希釈した CelLytic 10 ~ 20mL 菌株 / 細胞株 BL21 DH5α JM109 等 BL21 DH5α JM109 等 BL21 DH5α JM109 等 界面活性剤のタイプ両性イオン両性イオン両性イオン サンプルタイプバクテリア ( 大腸菌 ) サンプル形態培地に直接 :CelLytic B Express シリーズ抽出キット 製品名 CelLytic B Express CelLytic B Express Tablet CelLytic B plus kit CAT.NO./ 価格 ( ) 製品特徴 C ML C X25ML C1990-6X500ML 4,000 21, ,300 培養液を遠心せずにワンステップでタンパク質を抽出できます CelLytic Express は 界面活性剤や酵素などを独自配合した粉末です CelLytic Express により得られた細胞ライセートもそのままアフィニティー精製することが可能です C EA C EA 11,600 35,500 CelLytic B Express の錠剤タイプです 25 個入り 100 個サイズがあります CB0050-1KT CB0500-1KT 29,000 96,800 本キットにはグラム陰性菌および溶解が難しいグラム陽性菌の溶解に必要な試薬が揃っています (CelLytic B Lysozyme Benzonase Protease inhibitor Cocktail) FLAG ポリヒスチジン GST などのタグ融合タンパク質精製に適用可能 CB0050 は少量サイズ (5g のサンプル ) CB0500 は 50g サンプルサイズです 適用サンプル培養液中のバクテリア ( 大腸菌 ) ( 遠心不要 ) 培養液中のバクテリア ( 大腸菌 ) ( 遠心不要 ) グラム陰性 陽性菌 用法 小スケール :25mL 培地に対し 1 パック (25mL サイズ ) 大スケール :500mL 培地に対し 1 パック (500mL サイズ ) 培地 1mL に対し 1 錠使用 ペレット湿重量 1g あたり 10mL(CB0050 は 50mL CB0500 は 500mL の CelLytic B が付属 ) 菌株 BL21 DH5α JM109 等 BL21 DH5α JM109 等 BL21 DH5α JM109 等

9 Technical Support 哺乳動物細胞用 サンプルタイプ 哺乳動物細胞 製品名 CelLytic M RIPA Buffer Mammalian Cell Lysis Kit CAT.NO./ 価格 ( ) C ML C ML 11,100 38,200 R ML R ML 9,700 56,300 MCL1-1KT 55,100 製品特徴 培養哺乳類細胞から効果的に全細胞タンパク質を抽出するためにデザインされた マイルドな界面活性剤を含む Ready-to-use 試薬です 浮遊細胞 付着細胞のどちらからでも効果的で迅速な細胞溶解とタンパク質可溶化が可能です 一般的な細胞溶解用の Ready-to-use 溶液 50mM Tris-HCl (ph8.0) 150mM NaCl 1% IGEPAL CA % デオキシコール酸ナトリウム 0.1% SDS 含有 免疫沈降やウェスタンブロット用のタンパク質溶解に適しています 哺乳類細胞と組織溶解用に必要な全ての試薬が揃っています (5 バッファー (Tris- EDTA) 5 NaCl 5 SDS 5 デオキシコール酸 5 IGEPAL CA-630 Protease Inhibitor Cocktail) 1 キットでリシスバッファー 250mL 分 (100mm プレート 250 枚の抽出可能 ) 適用サンプル付着細胞と浮遊細胞の両方に有効 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効 細胞株例 HeLa Jurkat HL-60 COS PC-12 A431 CHO Bovine Aorta Endothelial Cells(BAEC) など 哺乳類細胞株 HeLa CHO Jurkat PC-12 COS Bovine Aorta Endothelial Cells(BAEC) など 用法浮遊細胞 :125 µl/10 6 ~ 10 7 個付着細胞 :500 ~ 1,000µL/100mm プレートあるいは 200 ~ 400µL/35mm プレート RIPA バッファー 1mLで100mmプレートの細胞 (0.5 ~ 個 ) 溶解 リシスバッファーは付着細胞または浮遊細胞 10 6 ~ 10 7 個につき 1mL 使用 組織 5 ~ 20mg につき 1mL 使用 界面活性剤のタイプマイルドな海面活性剤 ( 非公開 )/ 透析可能非イオン性および陰イオン性非イオン性および陰イオン性 その他 サンプルタイプ 酵母用 製品名 CelLytic Y CelLytic Y PLUS KIT CAT.NO./ 価格 ( ) C ML C ML 8,200 49,800 CYP1-1KT 100,100 製品特徴 効果的な酵母細胞溶解およびタンパク質可溶化のためのリン酸フリーな溶液です タンパク質を変性させず抽出します 酵母細胞の溶解 タンパク質抽出に必要な試薬が揃っています ( 反応バッファー DTT Lyticase 抽出バッファー Triton X-100 Protease Inhibitor Cocktail) 適用サンプル酵母細胞酵母細胞 用法 酵母細胞 1g あたり 2.5 ~ 5mL 1キットで酵母細胞 10 ~ 40gからスフェロプ ラスト形成とタンパク質抽出可能 細胞株 様々な Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae cerevisiae[y187,y190,w303(a) S288C Pichia pastoris SP1 Σ1278b BJ2168 cdc25] Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces pombe 界面活性剤のタイプマイルドな海面活性剤 ( 非公開 ) その他の溶解試薬は以下をご参照下さい

10 10 SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets For General Use ( 一般用 ) セリン システイン およびメタロプロテアーゼに対して幅広く特異的な阻害を示す水溶 性のプロテアーゼインヒビターです 4-(2- アミノエチル ) ベンゼンスルホン酸フルオリド (AEBSF) E-64 ベスタチン ロイペプチン アプロチニン および EDTA( ナトリウム塩 ) を含有します 1 錠で 100 ml の 1x カクテルを調製できます 1x カクテル溶液 1 ml でパンクレアチン 1 mg に相当するプロテアーゼを阻害することができます 1 錠で最大 100 ml の細胞抽出液 ( 細胞量にして 20 g) に含まれるプロテアーゼを阻害することができます 組成 ( 調製後の濃度 ) AEBSF 2 mm アプロチニン 0.3 µm ベスタチン 130 µm EDTA 1 mm E µm ロイペプチン 1 µm 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets, For General Use S8820-2TAB S TAB 7,700 68,500 SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-Free (poly-his タグ融合タンパク質精製用 ) セリンプロテアーゼ システインプロテアーゼ アスパラギン酸プロテアーゼ メタロプ ロテアーゼに対して広い特異性を有する水溶性プロテアーゼインヒビタータブレットで す 4-(2- アミノエチル ) ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩 (AEBSF) ベスタチン塩 酸塩 ロイペプチン E-64 アプロチニン ペプスタチン A ホスホラミドン二ナトリウ ム塩含有 1 錠で 100 ml の 1x カクテルを調製できます 1 錠で最大 100 ml の細胞抽出液 ( 細胞量にして 20 g) に含まれるプロテアーゼを阻害することができます 組成 ( 調製後の濃度 ) AEBSF 2 mm ホスホラミドン 1 µm ベスタチン 130 µm E µm ロイペプチン 1 µm アプロチニン 0.2 µm ペプスタチン A 10 µm 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA- Free, for use in purification of Histidine-tagged proteins S8830-2TAB S TAB 7,700 65,900 Protease Inhibitor Panel 広スペクトルのプロテアーゼインヒビターカクテルを独自に調製する場合や 目的抽出物のタンパク質分解活性のスクリーニングに使用できます パネルにはセリンプロテイナーゼ システインプロテイナーゼ カルパイン メタロプロテイナーゼに対する阻害剤が含まれます 構成品には NEM EACA やトリプシン阻害剤など効率的な代替品も含まれます まず各阻害剤のストック溶液を調製し それらを混合してカクテルにしてください 阻害剤のストック溶液を混合すると 混ざり合った溶媒と各阻害剤との間で相互作用が生じ 沈殿する可能性があります ほとんどの場合は希釈することにより溶解性が改善されます 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) Protease Inhibitor Panel INHIB1-1KT 74,500 組成 AEBSF 6- アミノカプロン酸 アンチパイン アプロチニン ベンズアミジン ベスタチン キモスタチン E-64 EDTA N- エチルマレイミド ロイペプチン ペプスタチン A ホスホラミドン トリプシンインヒビター

11 Technical Support & サンプルタイプ一般用バクテリア用哺乳類用 CAT.NO./ 価格 ( ) P2714-1BTL 7,700 I3911-1BO 11,000 P8465-5ML P ML 阻害特異性 Serine, Cysteine, Metalloproteases Serine, Cysteine, Metalloproteases Serine, Cysteine, Aspartic, Metalloproteases, Aminopeptidases 10,300 37,400 P8340-1ML P8340-5ML Serine, Cysteine, Acid proteases, Aminopeptidases 8,700 30,100 I3786-1ML I3786-5ML Serine, Cysteine, Acid proteases, Aminopeptidases 15,200 52,000 形状 一般的な使用方法 組成 ( 調製後の濃度 ) 用途 特長 保存と安定性 ( 未開封時 ) 凍結乾燥粉末 (100mL 分 ) 調製方法 : 容器に 10mL のバッファーを入れて粉末を溶かし 別の容器に移して 100mL に希釈 (=1x 濃度 ) 10mL に溶解後 (x10 濃度の状態 ) 分注して -20 で 1 ヶ月保存可能一般的な使用量 : 細胞溶解液 100mL あたり 1 本 (1BTL) AEBSF, 2 mm Aprotinin, 0.3 µm Bestatin, 130 µm EDTA, 1 mm E-64, 14 µm Leupeptin, 1 µm 一般的な幅広い用途に適しています 凍結乾燥粉末 (100mL 分 ) 調製方法 : 容器に 10mL のバッファーを入れて粉末を溶かし 別の容器に移して 100mL に希釈 (=1x 濃度 ) 10mL に溶解後 (x10 濃度の状態 ) 分注して -20 で 1 ヶ月保存可能一般的な使用量 : 細胞溶解液 100mL あたり 1 本 (1BO) AEBSF Aprotinin Bestatin E-64 EDTA Leupeptin 動物由来原料を一切使用していません一般的な幅広い用途に適しています 凍結乾燥粉末 +DMSO( 別バイアル ) 調製方法 :5ML サイズの場合 1mL の DMSO で溶解後 4mL の水で希釈 25ML サイズの場合 5mL の DMSO で溶解後 20mL の水で希釈一般的な使用量 : 細胞溶解液 20mL あたり本溶液 1mL AEBSF, 23 mm Bestatin, 2 mm EDTA, 100 mm E-64, 0.3 mm Pepstatin A, 0.3 mm 大腸菌ライセート用 DMSO 溶液 調製方法 : そのまま使用可能一般的な使用量 : 細胞または組織溶解液 10 ~ 100mL あたり 1mL AEBSF, 104 mm Aprotinin, 80 µm Bestatin, 4 mm E-64, 1.4 mm Leupeptin, 2 mm Pepstatin A, 1.5 mm 哺乳類細胞 組織ライセート用 年 年 DMSO 溶液 調製方法 : そのまま使用可能一般的な使用量 : 細胞または組織溶解液 10 ~ 100mL あたり 1mL AEBSF Aprotinin Bestatin E-64 Leupeptin Pepstatin A 動物由来原料を一切使用していません哺乳類細胞 組織ライセート用 サンプルタイプ酵母用ヒスチジンタグタンパク質植物用ホスファターゼ阻害剤 CAT.NO./ 価格 ( ) P8215-1ML 10,300 P8215-5ML 37,600 P8849-5ML P8849-1ML 9,900 34,000 P9599-5ML P9599-1ML 9,900 34,000 P5726-5ML P5726-1ML 12,800 44,000 P0044-5ML P0044-1ML 阻害特異性 Serine, Cysteine, Aspartic, Metalloproteases Serine, Cysteine, Aspartic, Thermolysinlike Proteases, Aminopeptidases Serine, Cysteine, Aspartic, Metalloproteases, Aminopeptidases Acid and Alkaline Phosphatases, Protein Tyrosine Phosphatases 12,300 41,900 Serine / Threonine Phosphatases および Alkaline Phosphatase の L- アイソザイム 形状 DMSO 溶液 DMSO 溶液 DMSO 溶液水溶液 DMSO 溶液 一般的な使用方法 組成 調製方法 : そのまま使用可能一般的な使用量 : 酵母細胞の溶解液 100mL あたり 1mL AEBSF, 100 mm E-64, 1.4 mm Pepstatin A, 2.2 mm 1,10-Phenanthroline, 500 mm 調製方法 : そのまま使用可能一般的な使用量 : 各種細胞溶解液 100mL あたり 1mL AEBSF Bestatin E-64 Pepstatin A Phosphoramidon 用途 特長 酵母 真菌ライセート用 poly-his タグ融合組換えタンパク質を発現させた大腸菌 ヨウトガなどのライセートに最適 保存と安定性 ( 未開封時 ) 調製方法 : そのまま使用可能一般的な使用量 : 植物組織の溶解液 100mL あたり 1mL AEBSF Bestatin E-64 Leupeptin Pepstatin A 1,10-Phenanthroline エンドウ インゲンマメ 小麦 タバコ シロイヌナズナなどのライセート用 調製方法 : そのまま使用可能一般的な使用量 : 各種の細胞 組織溶解液 100mL あたり 1mL Imidazole Sodium molybdate Sodium orthovanadate Sodium tartrate Cantharidin ( )-p-bromolevamisole oxalate Calyculin A 様々な動物組織 ( ウシ肝臓 ヒト胎盤 ウサギ筋肉 ) および A431 や Jurkat 細胞で試験済み二つのカクテルを両方添加することで幅広くフォスファターゼを阻害することが出来ます 年 年 年 年 年

12 12 FLAG FLAG タンパク質の検出 精製に定評のある発現システム FLAG 発現システムは組換え融合タンパク質の発現 精製 検出用に確立されたシステムです FLAG と 3xFLAG は ウェスタンブロットや免疫細胞化学 ( 免疫染色 ) 免疫沈降 フローサイトメトリー タンパク質精製等の幅広い用途や タンパク質間相互作用 細胞の超微細構造 タンパク質の局在化等の研究に利用されて定評を得ています この小さな親水性タグは 特異性と感度の高い弊社の ANTI-FLAG 抗体を使うことで組換え融合タンパク質の検出と精製がさらに向上します 実績 :2,000 以上の論文発表 超高感度 : 抗体はタンパク質 100 fmol を検出します 汎用的 : マルチフォーマットでの完全システム 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG アフィニティゲル ANTI-FLAG M1 Agarose Affinity Gel 特異性 : N 末端 FLAG 融合タンパク質用 (Ca 2+ 依存性 ) Ca 2+ イオンの欠如で抗原 - 抗体複合体は解離します 細胞質内で発現した Met-FLAG 融合タンパク質とは反応しません プロセッシングされていない細胞質発現したタンパク質を認識しません 結合能力 : タンパク質 >0.6mg/1mL gel 結合には Ca 2+ が必要 溶形 出 : FLAG ペプチド グリシン緩衝液 (ph3.5) EDTA 状 : アガロースビーズの 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール, 0.02%(w/v) アジ化ナトリウム含有 ) N 末端 FLAG 融合タンパク質の精製 A4596-1ML A4596-5ML A ML A ML 55, , , ,800 ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel よく使われています 特異性 : すべての位置の FLAG および 3xFLAG 融合タンパク質結合能力 : タンパク質 > 0.6mg/1mL gel FLAG 3xFLAG 融合タンパク 溶 出 : FLAG ペプチド 3xFLAG ペプチド グリシン (ph 3.5) 質の精製 形 状 : アガロースビーズの 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール, 0.02%(w/v) アジ化ナトリウム含有 ) A2220-1ML A2220-5ML A ML A ML 32,450 94, , ,000 EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel 特異性 : すべての位置の FLAG および 3xFLAG 融合タンパク質結合能力 : 0.6mg/1mL gel 溶出 : FLAG ペプチド グリシン (ph 3.5) 3xFLAG ペプチド 形 状 : 赤色アガロースビーズの PBS 懸濁液 (50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) FLAG 3xFLAG 融合タンパク質の精製 F2426-1ML F2426-5X1ML 78, ,600 FLAG ペプチド FLAG Peptide よく使われています アミノ酸配列 : Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 分子量 : 形状 : 凍結乾燥粉末 FLAG 融合タンパク質の ANTI-FLAG M1 及び M2 アフィニティゲルからの溶出 標準使用濃度 : 100µg/mL F3290-4MG F MG 19, ,000 3xFLAG Peptide よく使われています アミノ酸配列 : Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr- Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys 解 説 : Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp 配列が 3 回繰り返されています C 末端の 8 アミノ酸は標準的な FLAG 配列 (Asp- Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 分子量 : 形状 : 凍結乾燥粉末 3xFLAG 融合タンパク質の ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルからの溶出 標準使用濃度 : 100µg/mL F4799-4MG F MG 56, ,800

13 Technical Support FLAG RFU StarBright Green 基質を用いた FLAG 融合タンパク質の検出 Nanogram of FLAG-BAP/well 1%BSA 含有 Tris 緩衝液で希釈した N 末端 FLAG-BAP コントロールタンパク質 ( 製品番号 :P7582)10µL を ANTI-FLAG HS M2 コーティングプレート ( 製品番号 :P2983) に分注して室温で 2 時間インキュベートした プレート洗浄器にて 0.05%TWEEN -20 含有 TBS でプレートを 4 回洗浄した StarBright Green 基質 100µL を加えて 37ºC で 10 分間インキュベートした Wallac VICTOR2 プレートリーダーで蛍光を測定した その結果 ANTI-FLAG HS M2 コーティングプレートはわずか 1ng の融合タンパク質を精製可能であることが証明された ANTI-FLAG 高感度 (HS)M2 コートプレート ANTI-FLAG HS M2 Coated Plates ANTI-FLAG High Sensitivity(HS)M2 Coated plate は FLAG 融合タンパク質の捕捉と検出にそのまま使える便利で高感度な 96 ウェルプレートです わずか 1ng/well から 300ng/well までの FLAG 融合タンパク質を検出できます 発現スクリーニングや タンパク質間相互作用分析 ELISA 等に適しています ANTI-FLAG HS M2 コーティン グプレートによって N 末端 Met-N 末端 内部 C 末端の FLAG および 3xFLAG 融 合タンパク質を検出できます ご注文情報 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) ANTI-FLAG High Sensitivity Clear P2983-1EA 11,000 M2 Coated 96-Well Plate FLAG M 精製キット FLAG M Purification Kit FLAG M Purification Kit では CelLytic M を用いて哺乳動物細胞の迅速かつ効果的な溶解 タンパク質抽出を行い ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルを用いて FLAG タグ 融合タンパク質のアフィニティ精製を行います 特異性の高いモノクローナル抗体をア ガロースに共有結合した ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルにより精製や免疫沈降を行 います アフィニティゲルを用いることにより 前処理やキャリブレーションしなくても 効率的に FLAG 融合タンパク質を結合させることができます 結合した融合タンパク質 は酸性条件や 3xFLAG ペプチドによる競合で効果的に溶出できます 溶出されたタン パク質は活性 サイズ 翻訳後修飾 相互作用などの分析に用いることができます キット構成 CelLytic M 10x Wash Buffer Elution Buffer 3xFLAG Peptide ANTI-FLAG M2-Agarose Affinity Gel Amino-terminal FLAG-BAP Fusion Protein Polypropylene chromatography column 1mL アフィニティ精製カラムで 3 ~ 5 回分の試薬が入っています ご注文情報 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG M Purification Kit CELLMM2-1KT 125,100

14 14 FLAG FLAG 免疫沈降キット FLAG Immunoprecipitation Kit シグマの FLAG Immunoprecipitation Kit を用いて迅速かつ効率的に活性のある FLAG 融合タンパク質の免疫沈降 溶出をすることができます 結合した FLAG 融合タンパク質のうち通常 70 ~ 90% が生物学的活性を保持したま ま溶出されます 免疫沈降はタンパク質やタンパク質複合体の単離に非常に有効な 方法です 免疫沈降は図のようなステップで行われます キット構成 ANTI-FLAG M2 affinity gel Elution Buffer FLAG-BAP Control Protein 3xFLAG Peptide Lysis Buffer 2x Sample Buffer 10x Wash Buffer アフィニティ法による沈澱 精製 1. 細胞の溶解後 アフィニティゲル 添加 特異性の高い抗体を用いてエピトープタグ融合タンパク質のアフィニティ精製や免疫 沈降を行うため その後の生化学的 免疫学的分析が容易になります 特長 特異性の高い ANTI-FLAG M2 アフィニティゲルを用いています 前処理やキャリブレーションは不要です 3xFLAG ペプチドを用いることによって穏和な条件で簡単に溶出できます ご注文情報 製品名 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG Immunoprecipitation Kit FLAGIPT1-1KT 120, 複合体形成のための インキュベーション 3. 遠心 4. 洗浄 5. 溶出 的タン ク の の成分アフィニティゲル PAGE スタン ロット MALDI Mass Spec.

15 Technical Support poly-his HIS-Select HIS-Select 製品は ヒスチジンタグ融合タンパク質を迅速かつ高純度に精製することが可能です これは 非電化リンカーによってキレートをアガロースビーズマトリックスに付着させているためです 従来の固定金属アフィニティクロマトグラフィー (IMAC) 製品は荷電したキレー トリンカーが使用されていました しかし レジンの余計な電荷は負に帯電しているタンパク質のアミノ酸を引き寄せてしまい その結果とし て非特異的結合を増大させてしまいます 更に HIS-Select リンカーは殆どのタンパク質の表面と同様に親水性なので レジンの両極性に 起因したレジン - 非特異的タンパク質の相互作用が起こりません レジンの高純度 4 座配位キレートは非特異的結合を削減し 結合能を増大させます IDA タイプのキレートが 3 座位で金属イオンを保持し ているのに対して 4 座配位キレートは 4 つの座位で金属イオンを保持します そのため金属イオンがよりしっかりと保持されアフィニティゲ ルからの金属イオンの脱離を防ぎます 非電化 親水性リンカーそして高純度の 4 座配位キレーターという技術の融合がヒスチジンタグ融 合タンパク質に対する優れた選択性と結合能力を HIS-Select にもたらします このように HIS-Select は二次精製の手間を省き 真のワン ステップ精製を可能とします 特長と利点 特異性の高さによる 高純度精製 非電荷 親水性リンカーが非特異的結合を低減 高純度 4 座キレートで結合能力が向上 ワンステップ精製 製品名説明 CAT.NO. 価格 ( ) HIS-Select Nickel Affinity Gel よく使われています HIS-Select HF Nickel Affinity Gel HIS-Select Cobalt Affinity Gel HIS-Select Nickel Spin Columns 小から中スケールのヒスチジンタグ融合タンパク質精製用レジンです キレート基とアガロースが独自の非電荷親水性結合しているため ヒスチジンタグ融合タンパク質に対する選択性を高め 他のタンパク質との非特異的結合を低減させます 選択性が高いため 単一工程で精製できます アフィニティーゲルは 変性条件と非変性条件のいずれにおいても使用できます 独自の非電荷親水性結合により非特異的な結合が低減します ヒスチジンタグ融合タンパク質との結合能は 15mg/mL 以上です 変性条件下でも非変性条件下でも使用可能です ワンステップで精製できます マトリックス :6% アガロースビーズ結合能 :>15 mg/ml ゲル ( 約 30 kda のタンパク質の場合 ) 形状 :30% のエタノール溶液に 50% のアガロースビーズを懸濁 大規模での精製および FPLC 用途に使用できるよう設計されたヒスチジンタグ融合タンパク質精製用の Nickel Affinity Gel です HIS-Select High Flow (HF) は HIS-Select 技術の優れた選択性を高度に架橋したアガロースに付与することで 加圧下での高流速および機械的安定性を実現しました 他の HIS-Select 製品と同様に キレート基とアガロースビーズとの非電荷親水性結合により 単一工程での精製を実現しています マトリックス : 高架橋 6% アガロースビーズ結合能 :>15 mg/ml ゲル ( 約 30 kda のタンパク質の場合 ) 形状 :30% のエタノール溶液に 50% のアガロースビーズを懸濁 ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製に アフィニティ金属としてコバルトをお使いになりたい方にお勧めです HIS-Select Cobalt Affinity Gel は高純度 低非特異的結合 高結合容量のレジンです ヒスチジンタグ融合タンパク質を変性条件と非変性条件のいずれにおいても精製できます マトリックス :6% アガロースビーズ結合能 : >15 mg/mlゲル ( 約 30 kdaのタンパク質の場合 ) 形状 :30% のエタノール溶液に50% のアガロースビーズを懸濁 HIS-Select Spin Column はスモールスケールの細胞抽出液からヒスチジンタグ融合タンパク質を高速かつ安定的に精製できる ready-to-use のスピンカラムです 低非特異的吸着 高純度タンパク質精製を達成する HIS-Select テクノロジーを用いたシリカ粒子マトリクスが充填されています 15 分以内で精製できます 結合能 : 1 カラムあたり 500 µg 以上 P6611-5ML P ML P ML P ML H0537-1ML H ML H ML H ML H ML H8162-5ML H ML H ML H EA H EA 14,900 45, , ,800 7,700 31,500 62, , ,700 17,500 63, ,400 22,100 79,200

16 16 poly-his HIS-Select 製品名説明 CAT.NO. 価格 ( ) EZview Red HIS-Select HC Nickel Affinity Gel HIS-Select ilap 5 ml Column プルダウン法のような小量スケールの精製を行う際 マイクロチューブ内のレジンは無色なため識別しにくいことがあります レジンの誤った吸引は回収率の低下につながります EZview Red Affinity Gel は レジンが赤色に着色しているため 沈殿と上清を容易に識別できます そのため 沈殿を吸引するリスクを劇的に減少させます EZview レジンは通常の無着色レジンと同様の性質を持ちます 目的タンパク質のロスを少なくすることで より正確なデータを得ることができます アガロースビーズ ( 赤色 ) の 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) 結合能 :>15 mg/ml ゲル HIS-Select ilap(integrated Lysis and Affinity Purification: 溶解およびアフィニティ一体型精製 ) カラムは 細胞溶解およびタンパク質精製ステップを一度に行えます カラムは ヒスチジンタグ付きタンパク質を 5 ml の細菌培養から直接 1 ステップで精製できるようにデザインされています この 1 ステップ法は Sigma の特許取得済み ilap テクノロジーを使用しており これにより 組換えクローン株からのヒスチジンタグ付きタンパク質精製を迅速かつ簡便に行えます E3528-1ML E3528-5X1ML H9913-1EA H EA 7,500 25,700 7,700 69,900 HIS-Select Wash Buffer HIS-Select Elution Buffer カラム 1 本で 大腸菌培養液 5 ml から 1 mg 以上のヒスチジンタグ付きタンパク質を 1 時間未満で精製 ヒスチジンタグ付きタンパク質の発現確認 タンパク質間相互作用測定 または迅速なコロニースクリーニングに最適 精製タンパク質は プロテインアッセイ SDS-PAGE ウェスタンブロッティング および MALDI に使用できます HIS-Select 洗浄バッファーは 10 mm イミダゾール溶液です 非変性条件において HIS- Select 製品を用いてヒスチジンタグ融合タンパク質を精製する際 洗浄ステップで非特異的タンパク質結合の低減に最適です 組成 : 10 mm イミダゾール, 0.3 M 塩化ナトリウム, 50 mm リン酸ナトリウム含有 (ph 8.0) HIS-Select 溶出バッファーは 250 mm イミダゾール溶液です HIS-Select 製品やその他の固定化金属アフィニティクロマトグラフィー製品からヒスチジンタグ融合タンパク質の溶出に最適です 組成 :250 mm イミダゾール, 0.3 M 塩化ナトリウム, 50 mm リン酸ナトリウム含有 (ph 8.0) H ML 24,400 H ML 24,400

17 Technical Support HA タグ精製 Anti-HA Agarose Affinity Gel よく使われています EZview Anti-HA Agarose Affinity Gel 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) HA Peptide 分子量 : よく使われています Anti-HA Immunoprecipitation Kit その他タグ精製 Anti-c-Myc Agarose Affinity Gel EZview Red Anti-c-Myc Affinity Gel 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : 0.01M PBS (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) との 1:1 懸濁液, 抗体 / レジン固定率 :2.0 ~ 2.4mg/mL 結合能力 : HA 融合タンパク質 30 ~ 50 nmol/ml ゲル標識 : アガロースビーズ特異性 : N 末端または C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質結合能力 :HA タグ融合タンパク質約 0.4 mg/ml ゲル (27 kdaタンパク質の場合 ) 形状 : アガロースビーズ ( 赤色 ) の50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) 形状 : 凍結乾燥粉末解説 : human influenza virus hemagglutinin (HA) の アミノ酸に相当する合成ペプチドアミノ酸配列 :Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala Anti-HA Immunoprecipitation Kitは 免疫沈降において HAタグ融合タンパク質を最大限に回収します マイクロ遠心チューブの代わりにミニスピンカラムで全ての処理を行うため 抗原 - 抗体結合ビーズの洗浄が簡単で 実験ごとのばらつきは最小限に抑えられます 哺乳動物細胞を迅速 効果的に溶解する細胞溶解試薬 CelLytic M Cell Lysis Reagentもキットに含まれています 免疫アフィニティ精製 HA 融合タンパク質の競合的溶出標準使用濃度 5 ~ 10µg/mL 免疫アフィニティ精製 A2095-1ML A2095-5X1ML E6779-1ML E6779-5X1ML I MG I2149-1MG 81, ,900 54, ,300 11,700 20,400 IP0010-1KT 109,500 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク 質 免疫アフィニティ精製形状 : 0.01M PBS(pH7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) との 1:1 懸濁液結合能力 : c-myc 融合タンパク質約 2 nmol/ml ゲル標識 : アガロースビーズ 特異性 : c-myc タグ融合タンパク質 形状 : 赤色アガロースビーズの PBS 懸濁液 (50% グリセロール 抗菌 防腐剤として %Kathon CG/IPCII 含有 ) c-myc Peptide 分子量 : 形状 : 凍結乾燥粉末解説 : ヒト c-myc の C 末端の アミノ酸に相当する合成ペプチドアミノ酸配列 : Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu Anti-c-Myc Immunoprecipitation Kit Anti-V5, Agarose Affinity Gel 免疫沈降において c-myc タグタンパク質を最大限に回収できるよう 特別にデザインされたキットです 工程はマイクロチューブではなくミニスピンカラム中で行われるので 抗原 抗体結合ビーズを簡便に洗浄でき 実験ごとの結果のばらつきも最小限に抑えられます 哺乳動物細胞を迅速 効果的に溶解する細胞溶解試薬 CelLytic M Cell Lysis Reagent もキットに含まれています 1 キット 50 回分 c-myc 融合タンパク質の競合的溶出標準使用濃度 5 ~ 10 µg/ml 免疫アフィニティ精製 特異性 : V5 タグ (GKPIPNPLLGLDST) 融合タンパク質を認識します 形状 : 0.01M PBS(pH 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) との 1:1 免疫アフィニティ精製懸濁液結合能力 : V5 タグ融合タンパク質約 2.5 nmol/ml ゲル標識 : アガロースビーズ V5 Peptide 分子量 : 解説 : パラミクソウイルス SV5 の非構造タンパク質 V および RNA V5 融合タンパク質の競合的溶出 ポリメラーゼαサブユニット (P タンパク質 ) の アミ標準使用濃度 ノ酸に相当する配列の N 末端にシステインを付加した合成ペ 5 ~ 10 µg/ml プチド 形状 : 凍結乾燥粉末 アミノ酸配列 : Cys-Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu- Asp-Ser-Thr Glutathione Agarose lyophilized powder 特異性 : GST( グルタチオン -S- トランスフェラーゼ ) 結合能力 : 5 ~ 10 mg(gst)/ml レジン形状 : 凍結乾燥粉末 ( 安定化のためラクトース含有 ) 粉末 1 g を 10.5 ~ 16.0 ml に膨潤させて使用標識 : 架橋 4% アガロースビーズ アフィニティ精製 EZview Red Glutathione Affinity Gel 特異性 : GST( グルタチオン -S- トランスフェラーゼ ) 結合能 : 5 ~ 10 mg(gst)/ml レジン形状 : アガロースビーズ ( 赤色 ) の 50% 懸濁液 (PBS, 50% グリセロール 抗菌 防腐剤として % Kathon CG/IPCII 含有 ) 標識 : 架橋 4% アガロースビーズ アフィニティ精製 A7470-1ML 87,400 E6654-1ML E6654-5X1ML M2435-1MG M2435-4MG M MG 82, ,700 13,000 32, ,900 IP0020-1KT 109,700 A7345-1ML 85,000 V7754-4MG 45,000 G4510-1ML G4510-5ML G ML G ML E6406-1ML E6406-5X1ML 7,700 24,400 35, ,900 19,000 71,300

18 18 FLAG 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) FLAG 抗体 ANTI-FLAG M1 Monoclonal Antibody, Purified IgG 特異性 : N 末端融合タンパク質 (Ca 2+ 依存性 ) Ca 2+ イオンの欠如で抗原 - 抗体複合体は解離します 細胞質内で発現した Met-FLAG 融合タンパク質とは反応しません 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph % アジ化ナトリウム含有 ) (10µg/mL, 化学発光法 ) F MG F3040-1MG F3040-5MG 68, , ,100 ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody, Affinity Purified よく使われています 特異性 : すべての位置の FLAG 融合タンパク質 アフィニティ精製済み抗体のため より高い特異性 形状 : 溶液 (50% グリセロール 10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph7.4 保存剤非含有) タンパク質濃度は約 1mg/mL 免疫細胞化学 (1µg/mL, 化学発光法 ) EIA F UG F1804-1MG F1804-5MG 39,700 70, ,900 ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody, Purified IgG よく使われています 特異性 : すべての位置の FLAG 融合タンパク質 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph7.4 免疫細胞化学 0.02% アジ化ナトリウム含有 ) タンパク質濃度は約 4 mg/ml (0.5 ~ 10µg/mL, 化学発光法 ) F MG F3165-1MG F3165-5MG 38,100 75, ,700 ANTI-FLAG M5 Monoclonal Antibody 特異性 : Met-N 末端 FLAG 融合タンパク質 哺乳動物細胞粗精製物中の Met-FLAG 組換えタンパク質の検出に適 大腸菌発現系には不適 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph % アジ化ナトリウム含有 ) (10µg/mL, 化学発光法 ) F MG F4042-1MG F4042-5MG 39,100 82, ,600 Rabbit Monoclonal ANTI-FLAG, ascites fluid 特異性 :N 末端と C 末端 FLAG 融合タンパク質形状 :15 mm アジ化ナトリウムを含む腹水 免疫細胞化学 (1:125 ~ 1:250) EIA ウエスタンブロット (1:1,000 ~ 1:2,000, 化学発光法 ) F UL 75,500 Rabbit ANTI-FLAG Polyclonal Antibody よく使われています 特異性 : N 末端 C 末端 Met-N 末端 FLAG 融合タンパク質 形状 : 溶液 (10mM PBS ph7.4 1% BSA および 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 免疫細胞化学 (2.5µg/mL, 化学発光法 ) 免疫蛍光染色 (5µg/mL) F MG 58,800 標識 FLAG 抗体 ANTI-FLAG BioM2 Antibody, Biotin Conjugate 特異性 : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質用 免疫細胞化学 形 状 : 50% グリセロール溶液 (10mM リン酸ナトリウム ph mM NaCl 0.02% アジ化ナトリウム含有 ) (1 ~ 10µg/mL, 化学発光法 ) 標 識 : ビオチン F MG F9291-1MG F9291-5X1MG 40,400 83, ,700 ANTI-FLAG BioM5 Monoclonal Antibody, Biotin Conjugate ANTI-FLAG M2 Alkaline Phosphatase ANTI-FLAG M2 Peroxidase よく使われています 特異性 : Met-N 末端 FLAG 融合タンパク質 大腸菌発現系には不適 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl ph % アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : ビオチン 特異性 : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質用 特に抗マウス 2 次抗体が交差を起こしやすいマウスなどのサンプルを用いる際に有用 形 標 状 : 溶液 (TBS 50% グリセロール 1mM MgCl 2 15mM アジ化ナトリウム含有 ) 識 : アルカリホスファターゼ 特異性 : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質 特に抗マウス 2 次抗体が交差を起こしやすいマウスなどのサンプルを用いる際に有用 形状 : 溶液 (PBS 50% グリセロール 安定剤 防腐剤 ) 標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) 免疫細胞化学 (2µg/mL, 化学発光法 ) (1:1,000) ELISA (1:20,000) 免疫細胞化学 (1:100 ~ 1:1,000) (1:100 ~ 1:1,000) ELISA (1:20,000) F2922-1MG 96,400 A MG A9469-1MG A MG A8592-1MG A8592-5X1MG 47,100 97,400 45,600 85, ,600

19 Technical Support FLAG 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) 標識 FLAG 抗体 ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody FITC 特異性 : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl 1% BSA 0.1% アジ化ナトリウム ph7.4) 標識 : FITC 免疫蛍光染色 (10µg/mL, メタノール : アセトン固定 ) フローサイトメトリー F MG F4049-1MG F4049-5X1MG 48, , ,500 ANTI-FLAG M2 Cy3 Conjugate 特異性 : N 末端 Met-N 末端 C 末端 FLAG 融合タンパク質 特に抗マウス 2 次抗体が交差を起こしやすいマウスなどのサンプルを用いる際に有用 形状 : 溶液 (10mM リン酸ナトリウム ph mM NaCl 1% BSA 15 mm アジ化ナトリウム ) 標識 : Cy3 免疫蛍光染色 (10µg/mL, メタノール : アセトン固定 ) A MG A9594-1MG A9594-5X1MG 48, , ,700 二次抗体 Rabbit Anti-Mouse IgG, (whole molecule) Peroxidase Conjugate 特異性 : マウス IgG すべてのマウスイムノグロブリンと結合します 形状 : 0.01M PBS(pH 7.4) 防腐剤として 0.01% チメロサール含有標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) ELISA(1:40,000) 免疫組織化学 (1:200, ホルマリン固定 パラフィン包埋切片 ) (1:80,000 ~ 1:160,000, 化学発光法 ) A9044-2ML 37,000 Goat Anti-Mouse IgG, Fab Fragment Peroxidase Conjugate, Adsorbed with Human IgG Goat Anti-Mouse IgG, Fab Fragment Peroxidase Conjugate, Adsorbed with Human IgG and Rat Serum Proteins 特異性 : マウス IgG Fab Fab フラグメントを認識し Fc とは交差しません すべてのマウスイムノグロブリンと交差します ヒト IgG で吸収済み 形状 : 0.01M PBS(pH 7.4) 防腐剤として 0.01% チメロサール含有標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) 特異性 : マウス IgG Fab Fab フラグメントを認識し Fc とは交差しません すべてのマウスイムノグロブリンと交差します ヒト IgG ラット血清タンパク質で吸収済み 形状 : 0.01M PBS(pH 7.4) 防腐剤として 0.01% チメロサール含有標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) ELISA(1:60,000) 免疫組織化学 (1:150, ホルマリン固定 パラフィン包埋切片 ) (1:80,000 ~ 1:160,000, 化学発光法 ) ELISA(60,000) 免疫組織化学 (1:150, ホルマリン固定 パラフィン包埋切片 ) (1:80,000 ~ 1:160,000, 化学発光法 ) A9917-1ML 31,800 A3682-1ML 44,800

20 20 poly-his 製品名説明 CAT.NO. 価格 ( ) Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse 特異性 :N 末端ポリヒスチジン融合タンパク質を認識し C 末端ポリヒスチジン融合タンパク質とは弱い反応性を示します 形状 : 腹水液 (15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 適用 : ウェスタンブロット 1:3,000( 大腸菌中で発現誘導させたポリヒスチジン融合タンパク質検出の場合, 比色法 ) 免疫蛍光染色 免疫沈降 ELISA H ML H ML 48, ,100 Monoclonal Anti-polyHistidine-Alkaline Phosphatase antibody produced in mouse Monoclonal Anti-polyHistidine-Peroxidase antibody produced in mouse HIS-Select HS Nickel-Coated 96-Well Plates HIS-Select HC Nickel-Coated 96-Well Plates 特異性 : N 末端ポリヒスチジン融合タンパク質を認識し C 末端ポリヒスチ ジン融合タンパク質とは弱い反応性を示します 形 状 : 0.05Mトリス緩衝液 (ph 8.0, 1% BSA, 1.0 mm MgCl 2, 50% グリ セロール, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標 識 : アルカリホスファターゼ 適 用 : ウェスタンブロット 1:2,000( 大腸菌中で発現誘導させたポリヒス チジン融合タンパク質検出の場合, 比色法 ) 特異性 : N 末端ポリヒスチジン融合タンパク質を認識し C 末端ポリヒスチ ジン融合タンパク質とは弱い反応性を示します 形 状 : 凍結乾燥品 0.5mL の脱イオン水で復元 0.01M PBS (1% BSA, 0.01% チメロサール含有 ) 標 識 : ペルオキシダーゼ (HRP) 適 用 : ウェスタンブロット 1:2,000( 大腸菌中で発現誘導させたポリヒス チジン融合タンパク質検出の場合, 比色法 ) HIS-Select ニッケルコーティング高感度マルチウェルプレートは 少量のヒスチジンタグ融合タンパク質の検出を高精度で行えるようデザインされたプレートです 捕捉されたタンパク質は ELISA 法を用いて検出可能です 1well あたり 最低 1ng ヒスチジンタグ融合タンパク質を検出できます HIS-Select High Capacity(HC)Nickel Coated Plate は 独自の高密度ニッケルキレートマトリクスによりコーティングされています 他社のプレートと比べて 高結合容量 低非特異結合を示し 得られたヒスチジンタグ融合タンパク質は様々な用途に使用可能です 96 ウェルプレートで 4µg/well 以上のタンパク質が結合できます A ML 113,900 A7058-1VL 118,600 S5688-1EA 8,600 S5563-1EA 11,100 Nickel Filter Plates96-well HIS-Select Filter Plate は 固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー (IMAC) を利用した精製用フィルタープレートで スモールスケールの細胞抽出物からヒスチジンタグ融合タンパク質を精製するのに適しています ニッケルでチャージした独自の 4 座配位キレートで誘導体化したシリカ粒子 (20µm) の親水性層が 96 ウェルプレートに充填されています HIS-Select Filter Plate は ヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質に選択的であり 他のタンパク質が非特異的に結合することはほとんどありません 簡便でそのまま使用可能 安定した結合性 (2 mg/well 以上 ) CelLytic 細胞溶解試薬と併用可能 H0413-1EA H0413-5X1EA 40, ,800

21 Technical Support HA 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : 腹水液 (15 mm アジ化ナトリウム含有 ) (1:10,000, 比色法 ) 免疫細胞化学 ELISA H ML 57,100 Anti-HA-Tag antibody produced in rabbit Anti-HA tag antibody produced in chicken 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (0.02% アジ化ナトリウム含有, 50% glycerol) 特異性 : HA (YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (0.02% アジ化ナトリウム含有 ) (1:500 ~ 1:1000, 比色法 ) SAB UG 32,600 ELISA GW UG 51,500 Anti-HA antibody produced in rabbit, Affinity Isolated 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) (1:1,000) (1:200) 免疫細胞化学 (1:50) H ML H ML 58, ,900 Monoclonal Anti-HA, Biotin Conjugate antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : ビオチン (0.25 ~ 0.50 µg/ml, 化学発光法 ) B UG 56,200 Monoclonal Anti-HA - Alkaline Phosphatase antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : Tris 緩衝液溶液 ph 8.0(1%BSA 1mM MgCl 2 50% グリセロール 防腐剤として 15mM アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : アルカリホスファターゼ (1:4,000, 比色法 ) A UG 145,400 Monoclonal Anti-HA - Peroxidase antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : 凍結乾燥品 0.5mL の脱イオン水で復元後 PBS 溶液 (1% BSA, 0.01% チメロサール含有 ) 標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) (1:4,000, 化学発光法 ) H6533-1VL 106,700 Monoclonal Anti-HA, FITC conjugate antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 HA(YPYDVPDYA) タグ融合タンパク質形状 : PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 :FITC 免疫蛍光染色 (1 ~ 5 µg/ml) H UG 56,400 Monoclonal Anti-HA - TRITC antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 HA タグ (YPYDVPDYA) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 :TRITC( ローダミン ) 免疫蛍光染色 (10 ~ 15 µg/ml) H UG 95,800

22 22 c-myc 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) Monoclonal Anti-c-Myc antibody produced in mouse よく使われています 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) ウエスタンブロット (1:5,000, 化学発光法 ) 免疫組織化学 免疫蛍光染色 M UL 68,700 Monoclonal Anti-c-Myc antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : 腹水液 (15 mm アジ化ナトリウム含有 ) (1:100, 比色法 ) 免疫組織化学 (1:500) ELISA M ML M ML 67, ,900 Anti-c-Myc antibody produced in rabbit, Affinity Isolated 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 抗体濃度 : 約 0.5mg/mL (0.5~1.0µg/mL) 免疫細胞化学 (5 ~ 10 µg/ml, メタノール : アセトン固定細胞 ) C MG 65,000 Monoclonal Anti-c- Myc - Biotin antibody produced in mouse 特異性 : N 末端または C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : ビオチン B UG 63,100 (0.05 ~ 0.1 µg/ml, 化学発光法 ) Monoclonal Anti-c- Myc - Alkaline Phosphatase antibody produced in mouse Anti-c-Myc - Peroxidase antibody produced in rabbit 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : トリス緩衝液 (ph 8.0, 1%BSA, 1mM MgCl 2, 50% グリセロール, 0.1% アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : アルカリホスファターゼ 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 0.01% チメロサール含有 ) 標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) (1:100, 比色法 ) (1:5,000) A ML 129,400 A UG 73,200 Monoclonal Anti-c- Myc - FITC antibody produced in mouse 特異性 : N 末端または C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 ph 7.4(1%BSA 防腐剤として 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 :FITC 免疫蛍光染色 (5.0 µg/ml) F UG 50,200 Monoclonal Anti-c- Myc - Cy3 antibody produced in mouse 特異性 : N 末端および C 末端 c-myc タグ (EQKLISEEDL) 融合タンパク質形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 1%BSA, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : Cy3 免疫蛍光染色 (1:50) C ML 93,400 Monoclonal Anti-MYC, (C-terminal) antibody produced in mouse 特異性 : ヒト c-myc の C 末端領域 (AEEQKLISEEDLL) 形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) フローサイトメトリー (1 ~ 5 µg/ml) SAB UG 30,900 Monoclonal Anti-MYC- FITC, (C-terminal) antibody produced in mouse 特異性 : ヒト c-myc の C 末端領域 (AEEQKLISEEDLL) 形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 :FITC フローサイトメトリー (1:200) SAB UG 46,800

23 Technical Support GST 製品名説明適用 CAT.NO. 価格 ( ) Anti-GST antibody produced in rabbit 特異性 : 大腸菌で発現させた GST( 非変性および変性 ) を認識します 形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 溶液 (1:2,000) ELISA G ML G ML 57, ,100 Anti-GST Alkaline Phosphatase Conjugate antibody produced in rabbit 特異性 : 大腸菌で発現させた GST( 非変性および変性 ) を認識します 形状 : トリス緩衝液 (ph 8.0, 1% BSA, 1mM MgCl 2, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) 標識 : アルカリホスファターゼ (1:20,000, 化学発光法 ) ELISA(1:400) A ML 135,900 Anti-GST Peroxidase Conjugate antibody produced in rabbit 特異性 : 大腸菌で発現させた GST( 非変性および変性 ) を認識します 形状 :PBS 溶液 (ph 7.4, 0.01% チメロサール含有 ) 標識 : ペルオキシダーゼ (HRP) (1:2,000, 比色法 1:20,000, 化学発光法 ) ELISA(1:10,000) A ML 127,300 Monoclonal Anti-GST antibody produced in mouse 特異性 : GST 融合タンパク質を認識します 形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) (0.2 ~ 0.4 µg/ml) SAB UL 76,200 Monoclonal Anti-GST antibody produced in rat 特異性 : GST 融合タンパク質を認識します Schistosoma japonicum 由来 GST と特異的に反応し ラット ウサギ ブタ ウシの肝臓およびヒト胎盤由来の GST は認識しません 形状 : PBS 溶液 (ph 7.4, 15 mm アジ化ナトリウム含有 ) (0.05 ~ 0.1 µg/ml) ELISA SAB UL SAB UL 11,500 70,700 お手ごろ価格になりました トリス (Trizma base) 1 kg 8,000 円 CAT.NO. T1503

24 CelLytic シリーズ 発現システムに合わせて細胞を溶解しタンパク質を抽出するために調製された試薬です タンパク質が変性しない条件で簡単に細胞を溶解できます HIS シリーズ シグマの HIS-Select 製品は ヒスチジンタグ融合タンパク質を迅速かつ高純度に精製することが可能です レジンの高純度 4 座配位キレートは非特異的結合を低減し 結合能を増大させます 金属イオンはより堅固に保持されるため アフィニティゲルからの金属イオンの脱離を防ぎます プロテアーゼインヒビターシリーズ 動物 植物 酵母菌 細菌 あるいは真菌細胞を含む あらゆる組織または細胞の抽出物に適したインヒビターカクテルがあります 簡便なタブレットタイプも小パッケージ (2 錠 ) からご用意しています その他のタグ製品 FLAG poly-his タグ以外にもシグマでは c-myc HA GST など多数のタグ精製製品を扱っています FLAG シリーズ FLAG 発現システムは組換え融合タンパク質の発現 精製 検出用に特に確立されたシステムです ウェスタンブロット 免疫組織化学 免疫沈降 フローサイトメトリー タンパク質精製やタンパク質間相互作用 細胞の微細構造 タンパク質同定等 多くのアプリケーションで実績を残しています 新しい FLAG のアプリケーション FLAG タグによる精製システムは様々な分野で応用されています 今回は注目のクリックケミストリーを利用した FLAG の新しいアプリケーションをご紹介しています C 2012 Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved. SIGMA, SAFC, SIGMA-ALDRICH, ALDRICH, and SUPELCO are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC, registered in the US and other countries. FLUKA is a trademark of Sigma-Aldrich GmbH, registered in the US and other countries. SAFC brand products are sold through Sigma-Aldrich, Inc. Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms and conditions may apply. Please see product information on the Sigma-Aldrich website at sigma-aldrich.com. ANTI-FLAG, FLAG, HIS-Select, ilap and Trizma are registered trademarks of Sigma- Aldrich Biotechnology LP and Sigma-Aldrich Co. 3xFLAG, CelLytic, EZview, FLAG-BAP and SIGMAFAST are trademarks of Sigma-Aldrich Biotechnology LP and Sigma-Aldrich Co. IGEPAL is a registered trademark of Rhodia Operations. Kathon is a registered trademark of Rohm and Haas Co. StarBright is a registered trademark of Chromagen, Inc. TWEEN is a registered trademark of Croda International PLC. DH5 α is a trademark of Invitrogen Corp. Cy3 and FPLC are trademarks of GE Healthcare. 本カタログに掲載の製品及び情報は 2012 年 10 月 1 日現在の内容であり 収載の品目 製品情報 価格等は予告なく変更される場合がございます 最新の情報は 弊社 Web サイト (sigma-aldrich.com/japan) をご覧ください 掲載価格は希望納入価格 ( 税別 ) です 詳細は販売代理店様へご確認ください 弊社の試薬は試験研究用のみを目的として販売しております 医薬品原料並びに工業用原料等としてご購入の際は 弊社ファインケミカル事業部までお問い合わせ願います シグマアルドリッチジャパン 東京都品川区東品川 天王洲セントラルタワー 4 階 製品に関するお問い合わせは 弊社テクニカルサポートへ TEL: FAX: sialjpts@sial.com 在庫照会 ご注文方法に関するお問い合わせは 弊社カスタマーサービスへ TEL: FAX: sialjpcs@sial.com お問合せは下記代理店へ SAJ