環境によって発光波長が変化する環境対応型蛍光色素特許情報 1 発明の名称ケイ光ソルバトクロミック色素及びその使用法 2 出願出願番号特願出願日出願人国立大学法人北海道大学審査請求有無 3 公開登録情報公開番号特開登録番号

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ふじよしかみいしづ
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1 平成 21 年度第 2 回特許ビジネス市 in 横浜環境によって発光波長が変化する環境対応型蛍光色素特許番号 : 特開 Dioxane Ethyl acetate CH 2 Cl 2 Acetone DMF DMS Acetonitrile MeH 2009 年 10 月 9 日北海道大学大学院地球環境科学研究院准教授 : 山田幸司

2 環境によって発光波長が変化する環境対応型蛍光色素特許情報 1 発明の名称ケイ光ソルバトクロミック色素及びその使用法 2 出願出願番号特願出願日出願人国立大学法人北海道大学審査請求有無 3 公開登録情報公開番号特開登録番号 4 権利者国立大学法人北海道大学 5 関連特許特願 ( ) 特願 ( )

3 蛍光ソルバトクロミック色素開発の意義環境によって発光波長が変化するインテリジェントなプローブが求められている特定の生体反応とシグナル変化の相関が抽出しやすい ( 強度応答は機器的な理由を含めさまざまな要因で起こりうる ) レシオメトリー測定により高い定量性が補償できる ( フォトブリーチングなどの影響を低減させることができる ) 蛍光ソルバトクロミック色素は生体プローブとして有用な特性を数多く有している分子周囲の極性変化により蛍光波長応答する ( 抗原抗体反応 DA へのインターカレートなど極性変化を伴う対象は数多い ) 極性が変化しても吸収波長はほとんど変化しない ( 単一光源で励起できるため装置が簡略化できる ) 分子サイズが小さい ( 蛍光タンパクなどに比べ測定対象の生体反応を阻害しにくい ) 従来色素は紫外線励起が必要 (= 観測対象にダメージを与える ) 可視光励起できるよう改良

4 鈴木 - 宮浦クロスカップリング法を用いた蛍光ソルバトクロミック色素の網羅的合成法電子供与性部位芳香環部位電子吸引性部位を別々に合成し鈴木 - 宮浦クロスカップリング法で直結するので光物性の調整やラベル化部位の導入が容易吸収蛍光波長を微調整するための置換基の導入が容易特定の生体分子をラベル化するための置換基の導入が容易合成済みの色素群 + 芳香環部位 + 電子供与性部位鈴木 - 宮浦クロスカップリング電子吸引性部位 PLARIS Fluorophore 全てが蛍光ソルバトクロミズム特性を示したこれらのプローブ群を PLARIS (PLARity Indicator Series) Fluorophore と命名する

5 既存の色素との性能の比較化合物吸収極大波長 / nm モル吸光係数 / cm -1 mol -1 発光極大波長 / nm in toluene in toluene in toluene , , , , , 青色ダイオードレーザーで励起できるほど吸収の長波長化に成功した

6 PLARIS Fluorophore の分子構造と光物性の相関分子構造 λabs / nm ε / cm - 1 mol -1 in toluene in toluene λ em / nm in toluene in CH 2 Cl , , , , , , , 光源や検出器に合わせて吸収発光波長が調整できるほど知見が得られた

7 カチオン型 PLARIS Fluorophore の創製 R 1 S 1) R X 2) アニオン交換 R 1 S X R R 2 R 2 疎水性部位親水性部位これまでの中性型 PLARIS Fluorophore に比べて数多くの利点がある (1) Ar レーザー (488nm) で効率的な励起が可能 (2) 一段階で容易に認識部位ラベル化部位を R に導入することができる (3) アニオン (X - ) を交換することで溶解性の調整ができる (4) 生体膜中での配向が揃い表面電荷の情報を敏感に検出できると考えられる (5) 水溶性の向上が容易

8 カチオン型 PLARIS Fluorophore の水中でのスペクトル吸収スペクトル蛍光スペクトル大過剰に包摂もしくは界面活性機能を持つ分子を加えると水に溶解しシャープなスペクトル形状を示すようになった電荷を持つ界面活性剤の系で蛍光の大幅な長波長シフトが見られた均一な溶媒中よりも不均一な界面の方が PLARIS Fluorophore の性能が十分に生かせる

9 PLARIS Fluorophore の細胞膜観測用プローブへの利用非常に狭い範囲に親水基と疎水基が局在している脂質二分子膜は PLARIS Fluorophore を使った観測対象として魅力的糖鎖 PLARIS Fluorophore ラフト親水場本研究で開発されるプローブは細胞膜の海に浮かぶうきのようになり浮かぶと赤っぽい色に沈むと青っぽい色に光るコレステロール疎水場膜貫通タンパクイオンチャネル細胞膜を介したさまざまな生命現象を蛍光色の変化で高感度リアルタイムに観測する

100 Intensity 200 150 100 50 50 50 0 450

10 中性型色素プローブを導入した T nm nm nm 20 μm 20 μm 20 μm 蛍光波長解析 Intensity Intensity Intensity Emission wavelength (nm) Emission wavelength (nm) Emission wavelength (nm)

11 カチオン型色素プローブを導入した T μm

12 中性型色素プローブを導入した crypt 溶媒 : DMS 溶媒 : DMF nm μm 20 μm 蛍光波長解析 250 Intensity Emission wavelength (nm)

13 PLARIS Chemiluminophore の化学発光スペクトル 0.06% ah 水溶液 0.06% ah 水溶液 0.15% K 3 [Fe(C) 6 ] 水溶液 0.15% H 2 2 水溶液 0.15% H 2 2 水溶液 THF Methanol 有機溶媒 0.17ml 色素 20μg アセトニトリル - 水混合溶媒 0.18ml 色素 10μg 異なる有機溶媒中での化学発光スペクトルアセトニトリル - 水中での化学発光スペクトル溶媒の極性によって化学発光波長もシフトすることを実験的に確認した

14 対象とする市場分子イメージング用環境応答型蛍光色素プローブ生命医療系の研究者技術者に向けて生体機能解明のための機能性蛍光色素プローブを提供する医療診断食品検査環境計測用センサーデバイス病院公的研究機関に向けて農薬重金属水分洗剤溶剤細菌等をオンサイト検出するセンサーデバイスを共同研究開発する有機薄膜光情報記録媒体などへの応用光や化学反応 ( 酸塩基酸化還元ラジカル ) に非常に安定な特性を生かして適切な高分子に導入することで物理的な刺激に波長応答するセンサーデバイスや有機エレクトロニック材料を共同研究開発する

15 ビジネスプランジェネリック蛍光色素プローブの販売現在市販されており特許権の消尽した蛍光色素プローブ ( ボロンジピロメテン色素など ) について鈴木 - 宮浦クロスカップリングによる大幅な合成工程短縮による製造コストの削減で市販品よりも格安で販売する蛍光ソルバトクロミック色素関連商品の販売蛍光ソルバトクロミック色素プローブについて特定の生体分子にラベル化可能な色素分子の販売のほか毒性の低さを生かして染色用溶液や染色済みの細胞などの販売も検討する研究開発用蛍光プローブの受託合成販売合成的に容易に波長の微調整やラベル化部位の導入ができる特性を生かして依頼元の研究者の要望に沿った光特性ラベル化部位を持った蛍光色素プローブの受託合成販売という新しい販売方法も検討している在庫管理のコストが圧縮できるメリットが新会社にもあると想定している

16 ライセンスプラン独占実施権物質特許北海道大学出願山田研究室設立予定の新会社色素に関する研究開発色素の製造販売共同研究契約非独占実施権用途特許出願共同研究先企業色素の実用応用研究共同研究先企業の独占実施が行いやすいよう柔軟なライセンス契約を行う一般ユーザー

17 PLARIS Fluorophore の光学材料としての可能性 PLARIS Fluorophore は光だけでなくさまざまな化学反応 ( 酸塩基酸化還元ラジカル反応 ) に対しても極めて優れた耐久性を示すモノマー溶液に PLARIS Fluorophore とラジカル開始剤を加えて熱重合したときの経時変化重合時間新しい合成法を利用して PLARIS Fluorophore に重合部位を組み込むことも可能なので適切なポリマー材料と組み合わせることで材料の均質性や耐久性の評価法や記録材料としての可能性も考えられる

18 本特許の特徴効果本特許は溶媒の極性粘度 ph などの外部因子で発光 ( 色 ) 特性が変化する蛍光化合物 ( 環境応答型蛍光化合物 ) である二波長の蛍光強度比から光退色などの影響を取り除いて精度高く定量することが可能である従来の技術では色素合成の段階数が多く波長の微調整やラベル化部位の導入が非常に困難だった本特許の蛍光色素は新たな反応製法により測定機器や観測対象に最適化された蛍光プローブの創成が容易である本技術は極性変化を伴う生体反応例えば抗原 - 抗体反応 DA のハイブリダイゼーション生体膜ダイナミクスなどに原理的に応用が可能なのでさまざまなバイオセンサーの領域に貢献することができる

本技術の特徴と優位性 1 2 3 4 5 本製品は蛍光ソルバトクロミック色素であり溶媒の極性により発光波長が変わるため時間空間分解能が高いまた色素分子周囲の環境を変える事により発光色が変わり波長変換が可能である

19 本技術の特徴と優位性本製品は蛍光ソルバトクロミック色素であり溶媒の極性により発光波長が変わるため時間空間分解能が高いまた色素分子周囲の環境を変える事により発光色が変わり波長変換が可能である溶媒に対する溶解性が改良されて精製が容易なため純度の高い蛍光色素を多溶媒極性による蛍光色変化量に生産可能になった従来の色素よりも励起波長が長波長であるため細胞や生体分子の光損傷を極力防ぐことが出来る例えば細菌が生きたまま挙動観測が可能になるまた蛍光は励起光の強度を上げることで信号強度を大きく出来るシグナルを蓄積すれば高感度の測定が可能発光を伴うためどんな小さな物体でも観察が可能など吸光測定にはないメリットがある

20 技術内容 (1) 蛍光ソルバトクロミック色素の構造本商品は分子配向を持った色素母骨格をベースに極性反応する部位の電子供与部と電子吸引部を持った機能化学構造を持つ化合物色素この色素は 3 つの構成部位を鈴木 - 宮浦クロスカップリングによって直結する新規合成法を採用しているため一部部位を改変することで波長の微調整やラベル化部位の導入が容易である蛍光ソルバトクロミック色素の構造

ラベル化部位や溶解性調整が容易となり複合体中で色素が単分散して迅速に波長応答できる化学発光特性の付与電子吸引部位として

21 技術内容 (2) 蛍光ソルバトクロミック色素と生体分子の複合体工法蛍光色素は生体分子 ( タンパク質等 ) 内で凝集し自己消光により蛍光シグナルが大幅に減衰することがある本特許は新工法 ( 鈴木ー宮浦クロスカップリング法 ) 採用によりラベル化部位や溶解性調整が容易となり複合体中で色素が単分散して迅速に波長応答できる化学発光特性の付与電子吸引部位として化学発光特性を併せ持つルミノール誘導体を導入することで化学発光ソルバトクロミズムを示す新規色素を創製できた THF Methanol 化学発光ソルバトクロミック色素の分子構造と異なる溶媒中での化学発光色

22 蛍光色素の誘導体の構造例チオフェン誘導体フラン誘導体の色素本特許で合成された蛍光ソルバトクロミック色素本商品は技術検証としてつくられた複素環のチオフェン環又はフラン環を母骨格にジメチルアミノフェニルの電子供与部とベンゼンスルホン酸ジメチルプロピルエステル誘導体の電子吸引部を直結した構造式の一覧を示すエチレンディオキシチオフェン基 (4-(5-(4-(Dimetylamino)phenyl)-3,4-etylenedioxythiophen- 2-yl)benzensulfonic acid 2,2-dimethylpropyl ester チオフェン基チオフェン基 (4-(5-(4-(Dimetylamino)phenyl)-thiophen-2-yl)- benzenesulfonic acid 2,2-dimethlpropyl ester フラン基 ((2-(4-(5-(4-(Dimetylamino)phenyl)-thiophen-3-yl) benzensulfonyl amino)ethyl)carbamic acid tert-butyl ester ビチオフェン基 (4-(5-(4-(Dimetylamino)phenyl)-furan-2-yl)- benzenesulfonic acid 2,2-dimethlpropyl ester (4-(5 -(4-(Dimetylamino)phenyl)-2,2 -Bithiophen -5-yl) benzensulfonic acid 2,2-dimetylpropyl ester

23 蛍光色素の溶媒影響と蛍光スペクトル色素 ( チオフェンタイプ ) の蛍光スペクトルと各種溶媒 (4-(5-(4-(Dimetylamino)phenyl)-thiophen-2- yl)-benzenesulfonic acid 2,2-dimethlpropyl ester 蛍光発光の波長は溶媒の極性が上がるほど長波長にシフトし目視で識別できる波長 (nm) 380~ ~ ~ ~ ~ ~ ~780 色相紫藍青緑黄橙赤

24 蛍光色素の利用例細胞膜の蛍光標識 : 細胞膜を選択的に蛍光標識し部位特異的に異なるシグナルを発する色素含有ポリマー : ラジカル重合反応の進行度によって蛍光色が見た目で分かるほど変化する

25 製品サービスの概要特徴様々な種類の色素の大量合成および精製が容易光物性の調整やラベル化部位の導入が容易であり目的に応じた様々なタイプの色素を簡単な工程で生産できる高感度ケイ光ソルバトクロミック色素分子サイズが小さい化学発光特性の付与も可能で蛍光と比べ非常に感度が高い従来色素は紫外線励起が必要であったが本技術色素は可視光で励起できるため細胞や生体分子の光損傷を防ぐことができる脂溶性が高く細胞膜を選択的に蛍光標識し分子周囲のわずかな極性の変化に応答してケイ光色が変化する極性が変化しても吸収波長はほとんど変化せず単一波長励起が可能である

26 バイオセンサー技術の構成と市場展望バイオセンサーは酵素微生物抗体などの生体物質が持つ特異な分子認識能を分子機能素子として利用したセンサーであるその構成は物質の受容変換を行う分子認識材料 ( 受容体 ) とこの情報を電気信号への変換を行う各種トランスデューサーから構成される図 -9 発光色素 ( バイオセンサー ) の技術構成内容検出物質分子認識素子トランスデューサ ( 受容体 ) 表示 ( 信号変換 ) 反応信号抗体抗原 < 生体 > 1. 酵素 2. 微生物 3. 免疫物質 ( 抗体抗原 ) 4. 遺伝子 5. 細胞器官 6. 糖鎖 7. 資質膜 8. 人工材料 < 測定対象 >< トランスデューサ > 1. 電流酸素電極過酸化水素電極 2. 電圧 ISFET イオン電極 3. 光量光ファイハー SPR フォトカウンター 4. 質量水晶振動子 SAW 5. 熱量サーミスター 1. 電極間電流 2. イオン表面電位 3. 光の吸収蛍光変化 4. 発信周波数 5. エンタルピー蛍光ソルバトクロミック色素はバイオセンサーの一部として認識されているバイオセンサーの技術構成を他の機能と並べて比較すると用途と応用が見えてくる

27 バイオセンサーとしての応用市場図 -10 バイオセンサーの市場環境と測定検出可能の販売見込み分野医療市場環境食品市場環境他の市場環境免疫物質検出 ( 抗体抗原 ) 酵素検出遺伝子検査血糖値計測尿酸検出測定ウイルス感染検査ピロリ菌検出インターフェロン超微量生体検査醗酵プロセス管理遺伝子組み換え管理残留農薬の検出微生物汚染検出測定管理 (-157) BSE の検出微量有害物質計測水質の BD( 溶存酸素 ) 測定ダイオキシン類の検出土地等の農薬検査健康と環境保全を守る

28 国内の検査試薬市場 ( 医療食品環境 ) 表 -1 '07~'08 年バイオ関連検査試薬市場 ( 国内 ) 環境汚染物質検査試薬食品検査薬億円年医療年その他年医療年その他 BSE 検査キット DAチップ及び関連試薬遺伝子導入装置試薬ペプチドシーケンサー試薬ペプチド合成機試薬 DAシーケンサー試薬 DA 合成装置試薬リアルタイム定量 PCR 装置試薬 PCR 自動化機器試薬出典 : 日経バイオ年鑑 2009

29 発光素子材料の用途市場 ( 周辺の機能色素 ) 図 -11 発光素子材料の用途市場 ( 周辺の機能色素 ) LCD 偏向フィルム吸収フィルムホログラフィックメモリーフォトクロミック材料太陽電池有機薄膜オリゴチオフェン LCD 230 億円 2008 年プラズマディスプレイポリチオフェンとシリカハイブリッド有機トランジスター発光トランジスタ両極性 PDP 260 億円 2008 年機能色素半導体レサーレザー溶着アゾ染料有機 EL ノンドープ材料ドーパント材料有機顔料電子ペーパーエレクトロクロミズム光学異性体蛍光顔料長残像蛍光体インキ塗料光ディスクフォトクロミックスピロピランアゾベンゼン出典 : 技術情報協会 : 最新の機能色素系大全集より抜粋

30 事業計画蛍光ソルバトクロミック色素の販売事業計画 100,000 10,000 市場規模製品売上高 30,000 30,000 30,000 ( 単位 : 百万円 ) 第 1 期第 2 期第 3 期初年度 2 年度 3 年度市場規模 30,000 30,000 30,000 製品売上高製品シェア 0.10% 0.15% 0.20% 1,000 百万円初年度 2 年度 3 年度百万円製品売上高製品シェア % 0.20% % 0.15% 0.15% % 0.10% 0.05% 0.00% 初年度 2 年度 3 年度

31 添付参考資料 1: 医療用検査試薬金額推移 ( 国内 ) 表 -3 医療用検査試薬の市場金額検査試薬金額億円年 2005 年 2006 年 ( 推定 ) 2007 年 ( 推定 ) 2008 年 2009 年蛍光色素は医療の検査試薬として使われおり蛍光色素試薬は検査試薬全体の中の 1 つとしてとらえ官公庁資料には統計資料存在しないのでマーケット調査会社の富士経済社の資料を利用するが部分欠落あり筆者が一部推定と予測を加えてまとめた 2004 年から順調に伸びてきたが 2009 年はリーマンショックの影響もあり横ばいの予測される出典 : 富士経済調査レポート

32 添付参考資料 2: 07~ 08 検査試薬用途別一覧表 -4 `07~'08 バイオ関連検査試薬市場 ( 国内 ) ( 単位 : 億円 ) 分野項目 2007 年 2007 年 2008 年 2008 年医療その他医療その他医療 PCR 自動化機器試薬医療リアルタイム定量 PCR 装置試薬医療 DA 合成装置試薬医療 DAシーケンサー試薬医療ペプチド合成機試薬医療ペプチドシーケンサー試薬医療遺伝子導入装置試薬医療 DAチップ及び関連試薬その他 BSE 検査キットその他食品検査薬 (PCR EIA) その他環境汚染物質検査試薬計出典 : 日経バイオ年鑑 2009

33 従来の蛍光ソルバトクロミック色素の構造ジメチルアミノ基やアミノ基などの電子供与基とアセチル基やスルホニル基ニトロ基などの電子吸引基を適切な芳香環の適切な位置に直結することで溶媒極性により蛍光発光波長が変化する色素が合成できる H (CH 2) 5 CH S 3 H 2 BD-X Prodan 2,6-AS EDMAB S H Dansyl EDA H 2 Dapoxyl SEDA S H H 2 市販されている主な蛍光ソルバトクロミック色素

34 Dapoxyl SEDA の合成法 H 2 + Cl S 2 F pyridine, DMF H S 2 F H 2 S 4 S 2 F ah H 2 S 3 a PCl 3 S 2 Cl H 2 (CH 2 ) 2 H 2 THF S 2 H(CH 2 ) 2 H 2 Dapoxyl SEDA 電子供与分子の反応性置換基と電子吸引分子の反応性置換基を縮環して芳香環母骨格を形成するため性能向上のための分子改良が難しい

(Microsoft PowerPoint - \201\232\203|\203X\203^\201[)

$(Microsoft PowerPoint - \201\232\203|\203X\203^\201[)$ [ 2Pf012 ] 溶液ラジカル重合における末端変性アクリル系ポリマーの合成 Synthesis of terminal-modified acrylic polymers by the solution polymerization with radical initiators. ( 株 )DNP ファインケミカル西馬千恵清水圭世竹岡知美有富充利顔料分散体インクジェットインクやカラーフィルタ用レジストなどの顔料分散体が優れた性能を発揮するためには