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1 テーマ : 腎臓の病理細胞診検査 PAM Masson trichrome 染色 1) 染色の原理と染色のポイント 2) 試薬 染色液成分の役割 調製のポイント 3) MT 染色 /1% 酢酸水洗浄の意義 色素の溶解性と分別 Elastica-Masson( ゴールドナー変法 ) の原理 愛知県臨床衛生検査技師会病理細胞検査研究班基礎講座 平成 23 年 12 月 18 日 渡辺明朗

2 PAM 染色 (Periodic Acid-Methenamine Silver Stain) 1946 Gomori クロム酸 + メセナミン銀 糖関連物質の染色 1953 Jones 過よう素酸 + メセナミン銀 腎糸球体の染色 Periodic acid + Methenamin Silver Gomori は Bauer 反応 ( クロム酸酸化 シッフ試薬 ) を基に 銀アンモニア液を使用して糖関連物質の染色を試みたが 安定した染色結果が得られないので 種々アミン ( 窒素 N を含む ) を検討し メセナミンが最も適していることを見出し メセナミン銀液を使用 Jones は Gomori のメセナミン銀法を応用して 腎糸球体鍍銀染色の PAM 染色へと発展させた メセナミン銀液では 銀イオンに対してメセナミンが過剰に存在する (Jones 原法では銀 / メセナミン =1/ 約 14( モル比 ) メセナミン + メセナミン銀液中では 銀イオン ( + ) がメセナミンの窒素 N に親和し さらにその周りに多くのメセナミンが存在していると考察される

3 グリコール組織多糖類 -C- -C- アルデヒド ( 還元性 ) 過よう素酸 5I6 酸化 蒸留水洗浄水道水由来の不純物を除去 PAM 染色の原理 組織多糖類アルデヒド -C= -C= TSC 増感剤チオセミカルバジド + - M + - M メセナミン銀 色調は銀粒子サイズに依存 + - M 加組加組 織 温織 織 多-C= -C- 糖M 類-C= -C- 過よう素酸で多糖類等のグリコールを酸化してアルデヒド (C) を生成させる このアルデヒドにより メセナミン銀の銀イオン ( + ) が還元され 金属銀 () の微粒子 ( 銀核 ) として多糖類の存在部位へ沈着する さらに 周りの銀イオン ( + ) が還元されて生じる金属銀が その銀微粒子 ( 銀核 ) の上に沈着し 大きな銀粒子になり 発色する 組+ - M 多M -C- 多 糖糖 + - M 類 類-C- + - M + - M 銀微粒子 ( 銀核 ) 銀粒子へ成長温メセナミン銀

4 組織多糖類組織多糖類塩化金酸で調色 -C- -C- -C- -C- Au Au シュウ酸ホルマリン液 ( ジョーンズ補強液 ) Au Cl + [AuCl4] - ( 残留分 ) Cl Au Au + 実習では本操作省略 イオン化傾向 >Au 塩化金酸の金イオンが金属金として銀粒子の上へ沈着 銀イオンは塩化銀 Cl として沈着 3 + [AuCl4] - Au +3Cl +Cl - 塩化金酸 ( テトラクロロ金酸 ) Tetrachloroauric(III) acid [AuCl4]) ( 塩化金酸液は長期安定 ) AuCl AuCl3 残留する塩化金酸をシュウ酸で金属金にして金を沈着させる また還元性のホルマリンにより未反応の銀イオン + が還元され 銀粒子の上に沈着すると考えられる ただし本操作はきわだった効果がないので 本操作の省略は可 2[AuCl4] C24 2Au +6C Cl - 塩化金 Gold(I) chlrodie Gold(III) trichloride

5 織多水溶性組糖類組織多糖類定着 (2% チオ硫酸ナトリウム ) ( 未反応 + を洗浄除去 ) -C- -C- -C- -C- S23 2- Au Au Au 十分に水洗 ( 約 5 分 ) S23 2- ( 残留する S23 2- を洗浄除去 ) Au Au Au 未還元の銀イオンや塩化銀を チオ硫酸ナトリウムで処理し 溶出除去する + + 2Na2S23 Na + +Na3[(S23)2] ( 水溶性 ) Cl + 2Na2S23 Na3[(S23)2] + NaCl チオ硫酸ナトリウムによる定着処理をしないと 残留する銀イオンが光により還元され金属銀が生じ 部分的な過染や共染のリスクあり 参考 : ハイポは弱アルカリのため 切片剥離のリスクがあり そのリスクのほぼない写真酸性硬膜定着液が有用 定着に使用したチオ硫酸ナトリウムを 十分な水洗で洗い流す チオ硫酸ナトリウムが残留すると 経時的に硫化銀 2S が生じ 標本が変色する

6 メセナミンとメセナミン銀液調製及びその液の非安定性 メセナミン ( 正式名 :emamethylenetetramine ヘキサメチレンテトラミン ) 分子式 :C612N4 メセナミンはホルムアルデヒトとアンモニアから製造される メセナミン銀液調製時の現象硝酸銀水溶液をメセナミン水溶液へ少量添加すると 最初液が白濁し注 ) さらに添加すると無色透明になる 注 ) 硝酸銀とメセナミン 1:1 の非水溶性錯体 [C612N4 N3] が生成するか または白色の非水溶性水酸化銀 () が生じるため 最初白濁する 銀を含む試薬水溶液の調製には 蒸留水 ( できれば再蒸留水 ) の使用を厳守する 塩素等が微量でも含まれると 塩化銀 Cl などの沈殿が生じるので メセナミン銀液は不安定 ( 特に 高温ほど ) 使用時調製がベター経時的にメセナミンが分解して生じるホルムアルデヒドにより メセナミン銀液中の銀イオン ( + ) が還元されて 灰白色の金属銀 () が沈殿する メセナミン銀液の保存液が白濁してきたら新調する C612N C + 4N3 メセナミンホルムアルデヒドアンモニア ( 還元性のホルマリン )

7 メセナミン銀液 / ホウ砂とゼラチンの役割 1. ホウ砂 ( 正式名 : 四ホウ酸ナトリウム Sodium tetraborate) 通称 Borax( ボラックス ) 通常安定な四ホウ酸ナトリウム 10 水和物 (Na2B47 102) を使用役割 : 銀イオン還元促進用アルカリ化剤メセナミン銀の還元反応は通常遅いが 弱アルカリ領域ではこの還元反応が促進され アルカリ化剤としてホウ砂が添加される 重要!! ホウ砂水溶液は使用直前メセナミン銀液へ添加する ホウ砂液を添加すると メセナミン銀は 常温でも経時的に灰白色の銀の沈殿が生じる ホウ砂液を添加後加温する方法 またメセナミン銀液加温後ホウ砂液を加える方法あり 2. ゼラチン : 共染防止の効果 ゼラチン黒白フィルム Br Br Br Br 酢酸セルロース膜黒白フィルムは 酢酸セルロース膜へ硝酸銀とゼラチンの混合物が塗布されて製造される ゼラチンは銀の連鎖反応によるカブリを抑制するために混合されている 銀イオン同士の間にゼラチン蛋白が入り込むことにより 一度に多くの銀イオン (+) が連鎖反応的に還元されて起こる非特異的染色を抑制する効果 またスライドガラス上への銀粒子の沈着を抑制する効果がゼラチンにある

8 銀イオン還元速度のファクターと共染のリスク / 切片の厚さ 弱い PAM 染色の染色強度 強い 低い 染色温度 高い 短い 染色時間 長い 小 共染のリスク 大 メセナミンは高温ではホルマリン (C) とアンモニアへ分解する その分解により生成したホルマリンにより 銀イオン ( + ) が激しく還元され 金属銀 () がバックに共染すると考察される 加温 C612N C + 4N3 メセナミンホルマリンアンモニア PAM 染色のポイント 染色温度と染色時間の調節 管理 温度管理の正確さ 再現性 恒温槽 < 湯浴恒温槽 切片の厚さ 1~1.5um が望ましい 厚い切片では 糸球体や毛細血管の基底膜が真っ黒に過染し 観察が困難になる 薄い 切片の厚さ 厚い低い 染色に関与する組織成分濃度 高い薄い 染色の濃さ 濃い小 共染のリスク 大超薄切切片のE 染色 通常より時間を延長

9 TSC は 高感度発色 また共染のリスクを少なくする効果あり 組織多糖類グリコール 過よう素酸酸化 S RC + 2NNCN2 アルデヒド S 2 + RC=NNCN2 チオセミカルバジド Thiosemicarbazide(TSC) チオセミカルバゾン メセナミン銀錯体 ( + -M) S + -M 加温加 + -M + -M TSCは毒物に該当 硫化銀 + -M RC=NNCN2 + -M RC=NNCN 2S 医薬用外毒物 要取扱 保管注意 温チオセミカルバジド (TSC) とその増感作用の考察 RC=NNCN 2S 硫化銀 2S の上に銀がさらに沈着し 銀粒子が大きくなり強く発色

10 マッソン トリクローム染色 ( 原法と変法 ) 1929 年 Masson trichrome staining (Tri: 3 chrom: 色素 ) Mallory 染色 ( 酸性フクシン / オレンジ G アニリンブルー ) などを基にして考案された染色法 1 原法細胞質 : 赤色 (Acid Fuchsin) 核 : 青 ~ 黒色 (ematoxylin) 結合組織 : 青色 (Aniline blue) Methyl blue もMT AZAN 染色に利用可能 Aniline blueはmethyl blueと Water blueの混合物 ) 2 変法細胞質 : 赤色 2 変法赤血球 : オレンジ range G ( 野口変法 ) Fuchsia コントラスト改善のため 少し異なる色調の赤色色素を混合使用 赤色色素 吸収極大波長 Acid fuchsin 546nm Ponceau xylidine 503nm Azophloxine 540, 502nm Ponceau xylidineの別名 : Ponceau de xylidine( 仏語 ) Ponceau 2R Biebrich Scarletの混合使用例あり

11 鉄ヘマトキシリンの染色メカニズム ヘマトキシリン ( 無色 ) ヘマトキシロンカンペチアナム ( メキシコユカタン半島に産生する木 ) 核 DNA 細胞核 [ema: 血液の赤色 + Xyl: 木 ] P 4 - 塩化第二鉄 Fe(Cl)3 酸化 レーキ 黒褐色 Al Fe Fe +++ ( 橙 ~ 赤色 ) 塩化第二鉄 (Fe 3+ ) は酸化剤及び媒染剤として機能 Fe 3+ +e- Fe 2+ 核への結合力 ( 分別されにくさ ) 鉄 (Fe) > アルミニウムAl イオン化傾向 Fe < Al 鉄ヘマトキシリンの非耐久性 ( 混合後 1~3 週間安定 ) 1 高濃度のヘマトキシリン 0.5% 2 過剰の酸化剤 ( 塩化第二鉄 ) 媒染剤 ヘマテイン

12 染状態穏やか 分別力 強共分別 (Differentiation)( 鉄ヘマで共染が強い場合 ) e Fe + e Fe + e Fe + e Fe + レーキ - C 蛋白質 Cl + +Cl 低 塩酸濃度 高 + - C 蛋白質 P4 - DNA e Fe + P4 - DNA 核 細胞質 細胞質 P4 - DNA 分別 + ( 塩酸 ) 核 e Fe + P4 - DNA - C 蛋白質 + - C 蛋白質 Al ++ Fe ++ 共染強い 要分別弱い 分別不要染色操作過程で 酢酸酸性溶液 ( 染色液と洗浄液 ) を使い 分別される 但し 鉄ヘマは分別されにくい 結合組織のくすみの原因 カラッチヘマトキシリン 分別されやすいので 共染 過染ぎみに染色し 分別操作を省く ( 核染後 酸溶液にさらされ分別されるため ) 色出しについて 色出し後 染色過程で切片を酸にさらす 色出しの効果は低い

13 マッソン トリクローム染色の原理 異なる酸性色素の染色には 色素分子サイズと組織部位の構築の疎密が染色に関与 酸性色素 分子量 染色部位の構築の疎密 オレンジG ( 小さい色素分子は動きが速く 短時間で染める.) (0.75% オレンジG 染色時間 : 通常 1 分 ) 酸性フクシン ( ポンソーキシリジン 480) ( アゾフロキシン 509.4) アニリンブルー 800 ( 大きい色素は動きが遅く 染色に時間を必要とする 一旦部位へ入り込むと 分別されにくい特徴がある ) リンタングステン酸 2880 ( 染色の選択性に関与 ) (Azan やパパニコロウ染色においても同じ役割 ) 染色の三要素 1 化学的親和性 2 濃度 3 色素の組織部位への入り込み 密 ( 赤血球 ) 中 ( 細胞質 ) ( 線維素 ) 疎 ( 膠原線維 ) 小さい色素から順次染色する 先に大きい色素で染めると染め分け困難

14 酸性フクシン アニリンブルー [P(W310)4] 3- リンタングステン酸 ( 陰イオン性錯体 ) + N2- 蛋白+ N2- +N2- ( 染色において 他の酸性色素と染着部位の席の奪い合いをする ) (MT 染色において 特にアニリンブルーの過染を防止する ) ( 酸性フクシン アニリンブルー リンタングステン酸は負 (-) に荷電し 化学的挙動は同じである リンタングステン酸は 色素同士が重ならないよう 選択的染色に関与する ) 質リンタングステン酸の特性と役割 ( 染色の選択性 )

15 構築密赤血球 オレンジ G 酸性フクシンアニリンブルー 構築中間細胞質 構築疎膠原線維 A 酸性フクシン B PTA 過剰処理 PTA 適切処理 処理不足 PTA リンタン処理時間 (2.5% リンタン 分 ) 短 赤と青の重なり また青の過染傾向 長 構築中の部位の赤が弱い リンタングステン酸 (PTA) C アニリンブルー アニリンブルー アニリンブルー かなり長い 構築の疎の部位にリンタンが多く浸透し アニリンブルーの染まりも淡くなる D リンタンに切片を浸すと 非目的部位へ入り込んでいた酸性フクシンに代わり リンタンがその部位に親和ないし浸透し その後アニリンブルーに切片を浸すと 膠原線維等に親和しているリンタンに代わりアニリンブルーが少しずつ入り込む

16 重クロム酸カリウム / トリクロロ酢酸酸化処理の効果 ホルマリン固定標本で赤色で強く染まるよう導入された手法 1) 重クロム酸カリウム ( 固定作用 ) と皮のなめし 2) 媒染剤の可能性は小 ( ツェンカー液成分 ) ( 革の製造 ) 2 Cr 6+ 皮の蛋白質 還元 Cr 3+ 水和 [Cr(2)6] 3+ 皮の蛋白質 -C- - クロムなめし 皮の蛋白質 -C--Cr---C-皮の蛋白質 ( 蛋白質が凝固 ) ) 強酸化剤 重クロム酸カリウム / トリクロロ酢酸の効果 1 ホルマリン固定による蛋白分子内 分子間のメチレンブリッジの開裂 好酸性の増大 酸性色素 ( 酸性フクシン アニリンブルー ) の親和性が大 メチレンブリッジ R-N-C2-N-R R-N2 + N2-R 2 蛋白質の酸化開裂 酸性フクシン アニリンブルー等の色素の入り込み容易 3 蛋白質の酸化分解 ( 処理時間 : 通常 分 ) 構築の疎密への寄与 処理時間短め 構造疎 青色が優勢処理時間長め 分解物が構築疎の間隙を一部埋める (?) 赤色の染まりが強く Aniline blue の青色が淡い染色 蛋白- オレンジ G 質-N3 + Cr27 2-2Na + - 重クロム酸イオン

17 染色液の酢酸酸性条件の理由 /1 組織蛋白の好酸性化 赤色色素混合物 ( ポンソーキシリジン 他 ) in 約 0.2% 酢酸約 0.4% アニリンブルー orメチルブルー in 約 7.4% 酢酸 1) 組織蛋白の好酸性化 酸性色素がより結合しやすい 蛋白質 N C(C2)2C C= 酸 + ( 好酸性化 ) N + C(C2)4N2 C= 蛋白質 N C(C2)2C C= N C(C2)4N2 C= グルタミン酸.. リジン エオジン染色液へ 通常酢酸を少量添加し 染色対象の細胞 組織蛋白質を正 (+) に荷電させ 好酸性を増大させ 負 (-) 荷電のエオジンを親和させやすくする手法と同じ 酸性色素 アニリンブルー -

18 染色液の酢酸酸性条件の理由 /2 酸性色素の染色強度の増大 2) 色素はpによりその染色強度が変化する S3Na 基を有する酸性色素はpが低い方が染色力大 色強度染色強ライトグリーン染度エオシン Y オレンジG 色素 -S3 - N3 + - 蛋白質 3% 酢酸の p Light green SF yellowish 3% 酢酸の p オレンジ G p p オレンジ G in 約 0.15% 酢酸 Light green とAniline blueの化学構造は類似アニリンブルー in 約 7.4% 酢酸

19 何故洗浄に 1% 酢酸を使用?/ 酸性色素の溶解性 range G 参考 : 酸性色素は色素分子同士の静電気的親和性が大 アルコールに難溶 Na+ G 2- Na+ G 2- 水 range G G 2- Na+ δ- Na + イオン化することにより 水分子間にイオン化したオレンジ G が入り込み拡散 溶解 δ+ δ- δ- δ+ - 水素結合 δ+ - Na + 蛋白質 -N S- 酸性フクシン酸性水で洗浄 + - 中性 ~ アルカリ水で洗浄 蛋白質 -N S- 酸性フクシン 蛋白質 -N2 ( 色素が溶出 脱色 )

20 酸性色素の水とアルコール類への溶解性 / 分別 脱水用アルコール 酸性色素 range G Ponceau 2R (Ponceau de xylidine) Acid fuchsin Aniline blue WS 含有量注 min.80% min.60% 水 10.9% 5% % 7% エタノール 0.2% 0.1% 0.1% 0.4% エタノール脱水操作で Aniline blue が Acid fuchsin より少し多く溶出 分別される 注 : 色素含有量 : 米国 Biological Stain Commissionの規格色素含有量や不純物の種類及び量 メーカーや製造ロットにより異なる ( 特に 非汎用色素 ) 染色強度が異なり また溶解性が異なる ( 文献上の色素溶解性数値は一つの参考値 ) 酸性色素のアルコール類への溶解性 Isopropylalcohol < 変性アルコール < Ethanol < Methanol 水 (C3)2C C25 C3 アニリンブルー染色後の分別 脱水 アニリンブルー過染ぎみの場合 エタノールが適す 繊細な分別 アニリンブルーが溶出しにくいイソプロピルアルコールが適す ドライゾール組成 ( 関東化学 ) エタノール 88 % イソプロピルアルコール 9 % メタノール 3 %

21 Elastica-Masson( ゴールドナー変法 ) 染色 / 弾性線維の特性 エラスチンとコラーゲン蛋白の違い ( アミノ酸の種類 ) 線維 弾性線維膠原線維 エラスチン蛋白質中の主要アミノ酸 ( 約 90%) ロイシン CC-C2CC3 N2 C3 イソロイシン バリン CC-CC2C3 N2 C3 CC-CC3 N2 C3 プロリン C N グリシン 主要蛋白質 エラスチンコラーゲン C2 CC2 C2 C2 92 % 53 % 赤色部分が親油性 N2 エラスチンは親油性アミノ酸を多く含むので 弾性線維の染色にはアルコール溶性の色素が適す 側鎖に親油性官能基を有するアミノ酸の構成比率 BCAA( 分岐鎖アミノ酸 ) (Branched Chain Amino Acid) 筋肉に多く存在し 運動時のエネルギー源 燃焼系スポーツドリンク ( バーム アミノバイタル )

22 レゾルシン フクシンの染色メカニズム / 弾性線維への親和 1 物理的要素 : 弾性線維の分子構造間隙の壁面に色素が浸透 弾性線維の特徴 構造間隙の壁面に富む 伸張性 Indamine 他の部位へ入り込んだレゾルシン フクシンは ( 塩酸 ) アルコールで洗い流される レゾルシンフクシンの推定構造式 (orobin) フクシンの2,3,4 量体混合物 + デスモシンギリシャ語で Bandの意 リコイル状エラスチン + ジンから生成の模式図 ( コイルの内側は親油性 ) 2 疎水結合 + ロイシン CC-C2CC3 疎水結合 R=C3 N2 C3 親油性蛋白質と親油性色素エラスチン蛋白質中主要アミノ酸同士が溶け合うような結合 ( 疎水結合 ) 参考 : レゾルシンフクシン染色液の非安定性レゾルシンフクシン液は経時時に分解ないし変化し 徐々に共染のリスクが大きくなる ( 冷蔵保存すると レゾルシンフクシンの分解ないし変化が遅くなる )

23 レゾルシン フクシンの染色メカニズム / 弾性線維への親和 3 ファンデルワールス力 : 分子間引力 原子 陽子 + + 電子 非対称の分子構造で 分極 (+と-) しやすい色素と弾性線維が親和 + ファンデルワールス力の例包装用ラップ ポリ塩化ビニリデン ラップσ - σ + Cl σ μm + + Indamine 4 塩酸酸性 斥力 斥力による染色の選択性 + R=C3 疎水結合 + 塩酸 ファンデルワールス力 σ + σ - σ + σ - 包装対象物 Cl -C-C- N3- C3- C3- N2- 弾性線維膠原線維

24 酸性色素 分子量 染色部位の構築の疎密 オレンジG 酸性フクシン ゴールドナー変法染色の原理 MT 染色のアニリンブルーに代えて ライトグリーンを使用 密 ( 赤血球 ) ( ポンソーキシリジン 480) ( アゾフロキシン 509.4) ライトグリーン 793 中 ( 細胞質 ) リンタングステン酸 ( 染色の選択性に関与 ) リンタングステン酸の役割は MT 染色と同じ 疎 ( 膠原線維 ) リンモリブデン酸も同じ効果あり

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