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1 シッフ (Schiff) 試薬の検討 ( 社 ) 愛知県臨床衛生検査技師会病理細胞検査研究班 名古屋大学大学院医学系研究科医療技術学専攻病態解析学講座 ( 名古屋大学医学部保健学科検査技術科学専攻 ) 橋本克訓

2 PAS (Periodide acid Schiff) 反応とは 過よう素酸によって隣接した水酸基 ( ヒドロシル基 ) をもつ 炭素間の結合が切断されることによって生じたアルデヒド基に シッフ (Schiff) 試薬が結合しシッフ塩基を形成し 赤 ~ 赤紫に呈色する反応のこと 分析化学ではアルデヒド基の証明 病理学的には多糖類の証明をはじめ 粘液 真菌の検出 基底膜の染色のために用いられる 病理検査で Hematoxylin Eosin 染色以外で最も多用される染色法の 1 つである

3 シッフ (Schiff) 試薬 H. Schiff ( ドイツ人 ) によって考案された 成分は塩基性フクシンと亜硫酸からなる 製法によりボイルド (boiled) シッフと コールド (cold) シッフの 2 種類がある ボイルドシッフの作製法 (200ml) 200ml の蒸留水を沸騰させる 火を消した後 塩基性フクシン 1g を加え よく撹拌しながら再度沸騰させてフクシンを溶解する 50 に冷えた後 濾過し 1N 塩酸を 20ml 加える 流水で 25 に冷却後 無水重亜硫酸ナトリウムを 1g 加えて撹拌する コールドシッフの作製法 (200ml) 蒸留水 192ml に亜硫酸ナトリウム 5g 溶解し 濃塩酸 8ml を加える 塩基性フクシンを 2g 加え 1 晩撹拌する その後 活性炭を 1g 加え 10 分間撹拌後 濾過する (Mowry の処方 )

4 塩基性フクシン (basic fuchsin) 参考文献 :Medical Technology 別冊最新染色法のすべて パラローズアニリン (pararosanilin) の同族体が混合した色素の総称である シッフ試薬として重要なのはパラローズアニリンである pararosanilin (magenda 0) rosanilin (magenda I ) rosanilin (magenda II) neufuchsin (magenda III)

5 シッフ試薬の調製と aldehyde との発色反応 参考文献 :Medical Technology 別冊最新染色法のすべて SO 3 2- H + SO 3 2-

6 シッフ試薬の調製と aldehyde との発色反応 - OSO 2 発色反応 ( 赤紫 )

7 愛知県内で用いられているシッフ試薬の調査 Muto (cold): 21 自家調製 (cold): 6 Muto (boiled): 16 Merck (boiled) : 8 Sigma-Aldrich (boiled) : 1 不明/ 未解答 (boiled): 4 合計 56 施設 (cold: 27 vs. boiled: 29) ( 愛臨技の PAS 反応推奨法は cold シッフを推奨 )

8 検討事項 1. シッフ試薬の種類による反応性の違い 既製品シッフ 3 種 ( ボイルドシッフ 2 つとコールドシッフ 1 つ ) 自家製コールドシッフの使用色素による反応性の違い ( パラローズアニリン HCl パラローズアニリン base 塩基性フクシン ) 2. シッフ試薬の温度による反応性の違い ( 室温 冷蔵庫中 37 温浴中 ) 3. 組織による反応性の違い ( 胃粘膜被覆上皮細胞 腎生検 真菌 ) 4. その他

9 方法 腎生検 胃粘膜被覆上皮細胞 真菌をそれぞれ 室温 4 ( 冷蔵庫内 ) 37 ( 温浴中 ) の 3 種の温度のシッフ試薬で反応させて 染色性の違いを観察した PAS 反応の各工程は愛臨技の推奨法に準じた

10 検討に用いたシッフ試薬 入手先 種類 含有色素 色素色素含有量入手先 (100ml 中 ) 1 A 社 (boiled) pararosanilin (HCl) 0.46g 2 A 社 (cold) pararosanilin (HCl) 1.36g 3 B 社 (boiled) pararosanilin (HCl) 0.091g 4 自家製 (cold) pararosanilin (HCl) C 社 1g 5 自家製 (cold) pararosanilin (base) C 社 1g 6 自家製 (cold) basic fuchsin D 社 1g 自家製 (cold) シッフ試薬は Mowry の処方で調製した

11 PAS 反応愛臨技推奨法 1. 脱パラ 脱キシ 水洗 2.1.0% 過よう素酸 10 分 3. 水洗 5 分 4. コールドシッフ 15 分 5. 亜硫酸水 3 層 各 3 分 6. 水洗 5 分 7. 核染色 ( マイヤーのヘマトキシリン ) 8. 色出し ( 温湯 ) 5 分 9. 脱水 透徹 封入

12 腎生検組織 (2μ m 切片 ) での比較

13 シッフ試薬の種類 ( メーカー 製法 ) による染色態度の差異 A 社ボイルド A 社コールド B 社ボイルド 室温室温室温

14 自家製シッフ試薬 ( コールド ) の使用色素の種類による染色態度の差異 C 社パラローズアニリン (HCl) C 社パラローズアニリン (base) D 社塩基性フクシン 室温室温室温

15 結果 腎生検組織では B 社のボイルドシッフの基底膜の染色性が他のシッフ試薬より悪かった パラローズアニリン (base) を用いたコールドシッフ試薬も 他のシッフ試薬に比べ染色性が悪かった 塩基性フクシンはメーカーによってパラローズアニリンの含有率にばらつきがあり シッフ試薬として使用に耐えない製品もあるようであるが C 社の製品は良好であった

16 シッフ試薬の反応温度による影響 腎生検組織 (2μ m 切片 ) の比較

17 シッフ試薬の温度による染色態度の差異 A 社ボイルド 室温 4 37

18 シッフ試薬の温度による染色態度の差異 A 社コールド 室温 4 37

19 シッフ試薬の温度による染色態度の差異 B 社ボイルド 室温 4 37

20 シッフ試薬の温度による染色態度の差異 自家製コールド色素 : パラローズアニリン (HCl) 室温 4 37

21 シッフ試薬の温度による染色態度の差異 自家製コールド色素 : パラローズアニリン (base) 室温 4 37

22 シッフ試薬の温度による染色態度の差異 自家製コールド色素 : 塩基性フクシン 室温 4 37

23 シッフ試薬の反応温度による影響 胃粘膜被覆上皮細胞の比較

24 A 社ボイルドシッフ 室温 4

25 A 社コールドシッフ 室温 4

26 B 社ボイルドシッフ 室温 4

27 自家製コールドシッフ ( パラローズアニリン HCl) 室温 4

28 自家製コールドシッフ ( パラローズアニリン base) 室温 4

29 自家製コールドシッフ ( 塩基性フクシン ) 室温 4

30 真菌での反応の比較

31 A 社ボイルド A 社コールド B 社ボイルド すべて室温 室温 4

32 自家製コールドシッフ パラローズアニリン (HCl) パラローズアニリン (base) 塩基性フクシン すべて室温

33 結果 1. 腎生検組織における基底膜の染色性に関しては B 社のボイルドシッフは 他社シッフ試薬や自家製コールドシッフに劣る 2. 自家製シッフのうち 色素にパラローズアニリン (base) を用いた場合 パラローズアニリン (HCl) に比べ 染色性が劣る 3. 塩基性フクシン (D 社 ) のものは染色性が良好であった 4. シッフ試薬は低温時の反応性が特に腎生検組織において減弱した しかし 胃粘膜被覆上皮細胞 真菌の反応性は低温時でも室温と同様の良好な反応性を示した

34 追加実験

35 シッフ試薬の経時的温度変化 ( 冷蔵庫から室内に出した時 ) 条件 日時 :4 月 3 日 15 時 天候 : 雨 室温 :22.5 室内水温 ( 蒸留水 ):21.0 方法 シッフ試薬 (B 社 ) を冷蔵庫から出し ガラス製染色壺に 50ml に移して室内に放置し 5 分おきに温度を測定した

36 シッフ試薬 + アルデヒド添加後の呈色反応 B 社シッフ試薬 500μ l+20% ホルマリン 1μ l 添加 左 : 氷温 右 : 室温 0 分 5 分 10 分 15 分 30 分 30 分以降室温

37 考察 教科書には シッフ試薬は室温に戻してから用いる と記されているが 胃粘膜被覆上皮細胞 真菌に対しては 15 分間の反応時間では 4 でも 室温と遜色ない反応性を示した 一方 腎生検組織では 4 での基底膜への反応性が減弱した この現象は市販のボイルドシッフ 2 品が自家製を含む コールドシッフより顕著に現れた PAS 反応物質が少ない場合 もしくは切片が薄い場合 低温時の反応性の減弱が認められるのではないかと推測する 特に色素含有量が少ない ボイルドシッフに顕著に現れるのではないか

38 考察 逆に言えば PAS 反応物質が組織 細胞中に豊富に存在する場合は 低温時でも室温の時と同程度 シッフ試薬の反応が起こるのではないかと推測する 今回の検討で 冷蔵庫から取り出したシッフ試薬の温度変化を経時的に調査した結果 室温になるまでに 90 分間を要した 低温時にシッフ試薬の反応が減弱する対象組織 物質があることを念頭に入れて シッフ試薬は使用する 90 分以上前に冷蔵庫から出しておくことが望ましい 結語 PAS 反応はシッフ試薬を室温に戻してから行うべきである

39 今後の課題 PAS 反応のシッフ試薬の至適温度 時間 冷蔵庫から取り出してすぐ使用する施設も少なくない (14/56 施設 ) 室温になるまで 90 分もかかるが 90 分間 待つ必要があるのか? 反応時間を 15 分に固定した場合 どの程度 シッフ試薬の温度が上昇すれば室温と同等の反応結果が得られるのだろうか? シッフ試薬の劣化について

40 シッフ試薬の回復法第 85 回日本病理組織技術学会 ( 平成 24 年 3 月 4 日 ) の抄録より PAS 反応におけるシッフ試薬の検討 - 劣化したシッフ試薬の回復について - 湯浅瑛介 1), 田口勝二 2), 村石佳重 2), 高橋啓 2) 東邦大学医療センター大橋病院電子顕微鏡室 1), 同病理部 2) 以下の URL で抄録が掲載されている

41 おまけ

42 シッフ試薬の経時的温度変化 ( 室温から 37 の温浴に入れた時 ) 分で 37 に達した

43 青系シッフ試薬 チアジン系に分類される色素は青色系シッフ (blue Schiff) として応用できる なお 従来のシッフ試薬は Red- Schiff とよばれることもある Medical Technology 別冊最新染色法のすべて p139 チアジン系色素のトルイジンブルー O とチオニンで青色系シッフ試薬の作製を試みた

44 青系シッフ試薬 大腸粘膜上皮細胞 A: HE B: PAS C: アルシアン青 D: トルイジン青水溶液 E: トルイジン青 シッフ F: チオニン シッフ A B C D E F

45 青系 Schiff 試薬の染色態度 ( 腎生検組織 ) トルイジン青水溶液トルイジン青シッフチオニンシッフ

46 青系 Schiff 試薬の染色態度 ( 胃粘膜被覆上皮 ) トルイジン青シッフ チオニンシッフ

47 青系 Schiff 試薬の染色態度 ( 真菌 ) トルイジン青シッフ チオニンシッフ

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