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もえりかわらい
5 years ago
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1 かえるの試験法は現在 3 種類 ( 生殖腺分化 ) ( 変態完了 ) ( 性成熟 ) 発生段階 st.62 st.66 st.8-10 st.45 X. tropicalis ADGDA X. laevis LAGDA 40w ばく露開始 (st.45) ばく露開始 (st.8-10) サブサンプリング (st.62) 幼生期エンドポイント測定サブサンプリング (st.66) 3d 6-7w 14w 幼生期エンドポイント測定 (st.66) 間引き試験終了 (st.62 から 10 週後 ) 0d 5-6w 10w 16w 間引き幼若期エンドポイント測定試験終了成熟期エンドポイント測定 AMA(TG231) X. laevis ばく露開始 (st.51) 試験終了 (st.56-60) ばくろ期間 Day0 Day7 Day21 20 今カエルの試験法は 3 種類あります私のここでの任務は皆さんに細かい試験法のレクチャーをすることではないと思っていますというのはこの中でカエルの試験をやる方は 1 人か 2 人かひょっとしたらゼロじゃないかと思うので私とか環境省が何かカエルの試験法と言ったときにイメージがぱっと浮けばいいぐらいと思っているのですがそうしたときにたぶんキーワードとしては ADGDA とか LAGDA とか AMA という言葉が時々出てくるのでそれぐらい覚えておいて大体どんなことをやっているかなと思っていただければいいと思いますここで一番重要なのは一番下に書いた AMA なんです AMA とは何かといいますとこういう試験です 20

2 Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) TG231 Xenopus laevis 発生段階 (N.F. Stage) ばく露ばく露日数試験動物アフリカツメガエル試験期間発生段階 51 から 21 日間 * 試験物質及びばく露濃度エンドポイント計測日 Iopanoic acid (IOP) Thyroxine(T 4 ) Perchrolate (PER) *(7 日目に各水槽から 5 匹ずつサンプリング ) 0.75, 1.5, 3.0, 6.0 mg/l 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 µg/l 65, 125, 250, 500 µg/l 発生段階頭胴長体長完全長後肢長湿重量死亡率甲状腺 ( 組織 ) 0 日目 7 日目 * 21 日目 7 日目 * 21 日目 7 日目 * 21 日目 7 日目 * 21 日目 7 日目 * 21 日目毎日 7 日目 * 21 日目 21 Amphibian Metamorphosis Assay を略して AMA というのですこれは先ほどお見せした OECD のテストガイドラインの 231 に相当しますつまり国際的なバリデーションが終わって試験法として確立している試験ですこの試験法を環境省の EXTEND2010 でも甲状腺ホルモンの検出系として用いることになっていますここに細かいエンドポイントというか観察点とかいつ何を見るか出ていますが甲状腺ホルモンとか甲状腺ホルモン阻害剤または促進剤を与えるとどうなるかといいますと甲状腺という臓器の組織が変化するということが 1 つの観察眼として知られます 21

3 試験結果 ( 甲状腺 ) Control IOP (6.0 mg/l) T 4 (2.0μg/L) PER (500 g/l) スケール : 100μm 22 これは解剖して切片を切って標本を作って観察しなきゃいけないのですがコントロールではこういう形をしていたのが阻害剤または促進剤を与えるとこういうふうに異常なものを示す T4 だと多量に与えてしまうとこういうふうな形になります 22

4 甲状腺ホルモンかく乱による変態異常 Morphological changes with disruption to the thyroid system Control T4 C 15 H 11 I 4 NO 4 Acceleration of metamorphosis (Growth of head and limb) PTU C 7 H 10 N 2 OS Inhibition of metamorphosis (Underdevelopment of limb) IOP C 11 H 12 I 3 NO 2 Acceleration of metamorphosis(growth of head and limb) Inhibition of metamorphosis (Underdevelopment of limb) 23 あとは甲状腺ホルモン以外に何を見るかというと後肢が出てくるタイミングとか前肢が出てくるタイミングが変わるそれはいろんなこういう化学物質によってこれがノーマルだとするとノーマルはまだ前肢が出ていないのですが前肢が出てきたりしますね逆にノーマルは後肢が出てくるのにここでは出てないとかこちらは両方とも頭の形が変になっているということが起きています大体奇形が起きることですね 23

5 Results of Metamorphosis Assay (Phase 3) Control BP-2 C 13 H 10 O 5 Inhibition of metamorphosis (Underdevelopment of limb) Hypertrophy of thyroid gland 200 m 200 m 24 次にカエルの方です 24

6 LAGDA X. laevis 長期試験 ( 第 2 段階試験? 検討中 ) ばく露開始 (st.8-10) サブサンプリング (st.62) (st.66) 試験終了 (st.62 から 10 週後 ) 0d 5-6w 10w 16w 幼生期間引きエンドポイント測定 - ステージ 62 到達に要した日数 - 頭胴長体重 - 血漿中ビテロジェニン濃度 - 甲状腺の組織学的観察幼若期エンドポイント測定 - 頭胴長体重 - 血漿中ビテロジェニン濃度 - 生殖腺の外部形態観察 - 生殖腺の組織学的観察 - 肝臓重量 (LSI) - 二次性徴 (Nuptial Pad) 25 もう 1 つ試験法として Tier1 と Tier2 に分かれていて今お見せしたのは今の段階では Tier2 の方で使う予定なんですがひょっとしたら今日の午前中の会議でもこっちの方を Tier2 にした方がいいのではないかという意見が出てまだ決まっていないのですが LAGDA という試験があります ADGDA はたぶん忘れていいのかもしれませんが LAGDA と AMA の 2 つは今後環境省の報告とかに出てくる可能性がありますので覚えておいてくださいこれはアフリカツメガエルを使って 16 週間見て生殖腺の異常とかも見るし肝臓の重量とかを見るしもちろん甲状腺ホルモンの影響を見るというちょっと長期の試験ですさっきの AMA が 3 週間なのでこちらの方はちょっと長期の試験でもっと詳しく調べると試験になっています 25

7 メダカの試験のキーワードは 26 メダカの試験のキーワードは性なんですこれがメダカのエンドポイントで守備範囲は赤で囲まれたところです 26

8 ばく露前 2 3 週間繁殖に関する項目の観察産卵数受精率ふ化率試験魚 : 雌雄成魚 Fathead minnow 魚類短期繁殖試験 (TG229) Medaka 3 ばく露 (3 週間 ) 測定項目 : 二次性徴血中 VTG 濃度血中ステロイドホルモン濃度 ( ミノー ) 観察項目外観行動死亡産卵数及び受精率( 毎日観察 ) 試験の目的繁殖( 産卵数 ) への影響を調べる試験の概要流水式で3 週間の試験 (+ 事前観察 2~3 週間 ) Estrone スクリーニング試験ビテロゲニンに加え産卵数 ( 生物群存続に関する有害影響 ) がエンドポイント米国により提案され 2009 年に OECD の TG229 として採択され 2012 年に改訂された 27 メダカの試験法で今環境省で取り上げられているのはテストガイドラインの 229 番または 230 番でもいいのですが 229 番がメインで取り上げられていますこれはどういう試験か簡単に言いますと雄と雌の成熟したメダカを 1 つのメダカに入れておくと卵を産みますその産んだ卵の数を毎日数えて化学物質によって卵の生まれる数が減るか増えるかということをひたすら数える他にもエンドポイントはあるのですがこれは非常に手間のかかる試験なんですが毎日数えることをやるのですこれはアメリカで開発してそれをメダカに移植した感じの試験法ですファットヘッドミノーのデータがたくさんですが今メダカの試験のデータが少ないので環境省が今メダカを使った試験をたくさんとろうとしています 27

9 魚類繁殖試験 (TG229) の適用エンドポイント女性ホルモン抗女性ホルモン男性ホルモン抗男性ホルモン生殖腺軸オスメスオスメスオスメスオスメスオスメス生死ビテロジェニン次性徴産卵数 - 受精率 - 詳細オスのメス化女性ホルモンが働かないメスのオス化乳頭状小突起男性ホルモンが働かない? 化学物質によって作用が異なる 28 これは先ほどパズルでお見せしたいろんなホルモンに対して TG229 を使うとどのようになるかこれを説明するとたぶん時間がなくなるので省略しますただ女性ホルモン様物質を与えたときにどうなるかというとビテロジェニンという雌化すると増えるタンパクがあるのですがビテロジェニンが雄も雌も上がります女性ホルモンで雄も雌化されるし雌はさらに雌になるので上がりますビテロジェニンという雌化が上がるのに産卵数とか受精率が減るのはなぜかというとそれは雄が雄らしくなくなってしまうからです雄が精子を出したり雌を追いかけたりということをしなくなるのでここは下がる例えば抗女性ホルモンを与えたらどうなるかというと実は雄のビテロジェニンが上がるのです抗女性ホルモンというのは女性ホルモンの反対の作用をするそういう働きをするはずなんですが反対の作用の仕方にはいろんなパターンがあってこの場合大体多いのが競争阻害なんですそうすると弱いエストロゲンが実は女性ホルモンに対してはレセプターに蓋をして全体の女性ホルモンの活性を下げることになるのですが雄にとっては女性ホルモンは女性ホルモンなので弱いながらも上がるときがあります雌の方は本来の女性ホルモンが働かないようにブロックされてしまうので下がるのです産卵数とか受精率も下がりますそれは女性の方がやる気をなくすのでたぶん産まなくなってしまうと考えられますここで問題は後半の 2 つ抗男性ホルモンと生殖腺軸なんですが生殖軸というのはいろんなことが複雑に絡み合うので難しいのですがこれは今までの化学物質を見てみると合成経路とか見てつまりホルモンの合成系とか作用メカニズムみたいなものはまだ納得できるところがあるのですが抗男性ホルモンについては TG229 ではわからないということがわかっていて今緊急的に抗男性ホルモンの TG229 に代わる試験法がないかと思って新しい試験を開発中でありますつまりここの部分が 229 番が欠けちゃうのです 28

10 メダカ多世代試験 :Medaka Multi-generation Test 週 F0 F1 F Reproduction Growth and development Reproduction Growth and development 8 次世代への移行影響を調べることを目的として生物群が存続できるかを判断するための長期 (25 週間 ) の確定試験フルライフサイクル試験をベースに既存試験 (TG229 と TG234) の組合せで構成 29 もう 1 つ試験法を開発しているのはメダカの多世代試験というのをやっていますこれはおばあちゃんの影響が孫に出るかまで見る試験法ですこれは確定試験で環境中で検出される低濃度付近で試験をやることになっています手順としては親にばく露して親が産んだ卵を育てて卵が大人になるまで見て大人になった娘がたくさん卵を産むか娘が産んだ卵がちゃんと孵化するかというところまで見る試験なんです全体で 25 週間かかります 26 週になるかもしれませんがかかりますこれを人間でやると 70 年から 80 年かかる試験を 25 週でやるので大変な試験なんですがこれは魚を使った確定試験ということになっております 29

11 Eggs: 72 pool and redistribute Number of replicates: 6 Fish/replicate: 12 アメリカ環境庁 F0 世代 (1-4 週 ) F1 世代 ( 成長 ) (1-9 週 ) 外見と遺伝的な性判別日本側 Eggs: Number of replicates: 4 Fish/replicate: 15 DMY: 4x6x7=168 2 pairs x 6 (12) Next generation Number of replicates: 12 Fish/replicate: 2 Sampling: 8x6x7=336 Eggs: 72 Sampling:2x12x7=168 pool and redistribute F1 世代 ( 繁殖 ) (9-14 週 ) 産卵数 : days F2 世代 (1-9 weeks) 外見と遺伝的な性判別 DMY: 6x4x7=168 3 pairs x 4 (12) Next generation Sampling: 9x4x7=252 Number of replicates: 4 Fish/replicate: 6 Sampling: Eggs: 60 9x4x7= Sampling: 12x6x7=504 Sampling: 15x4x7= 今アメリカ側と日本側でこの試験をめぐって闘争中というかお互いの意見をぶつけ合っているのですが何が一番違うかというと統計的な力がどっちが強いかとか信頼性をやっているのですがアメリカ側の主張だとこれだけの水槽の数が必要なんですが日本側は若干少ないようにデザインしていてこれも日米の会議でどちらの試験法がいいかということを討論している最中です 30 30

12 ミジンコの試験のキーワードは 31 次にミジンコの試験のキーワードは変態と性なんですが変態といっても transformation ではないかと私は思っているのですがそれと sex です守備範囲はここになります 31

13 地球上に存在する動物の種 arthropods ミジンコはエビとカニの仲間 32 地球上に存在する生き物のほとんどは無脊椎動物なんです我々脊椎動物は種類でいくと 5% しかいなくて無脊椎動物の軟体動物が 10% ぐらいいますので節足動物は 85% ぐらい節足動物というとエビとかカニ昆虫などもここに入りますミジンコはここのところに入っていますエビとカニの仲間なんですだからミジンコを使えば大体ここら辺のグループの代表とまではいかないですが内分泌かく乱の様子がわかるだろうということでミジンコを採用しています 32

14 ミジンコのライフサイクル単為生殖有性生殖産仔成長成熟全部雌の世界産仔必ず雌環境変化産仔水温低下短日周期過密発生餌不足成長交尾雄仔虫産卵耐久卵孵化成長 ( 単為生殖に戻る ) 33 ミジンコのライフサイクルの説明は時間がないので飛ばしますがミジンコは単為生殖で雄と雌が交尾しないでどんどんふえていくのですつまり産まれるとこどもを産んで成長してまたすぐ成熟してこどもを産んでということでネズミ算式よりもすごい勢いでふえていきます時々水温が変わったり短日周期になったり過密になったり餌不足になると雄が生まれてきて交尾をして耐久卵をつくって耐久卵から必ず雌が出てくるのです必ず雌が出てくると単為生殖にいくということになります耐久卵というのは冬を越したり砂漠だと乾燥に耐えたりとにかく地球上で何万年か何億年か知らないですが生きてきたときにこれは最も重要なタイムカプセルみたいな感じで存在しているものなんですね 33 33

15 34 これは向かい合って交尾しているように見えますが実はミジンコは後ろから交尾するのでこれは貴重な写真なんですがこっちが雌でこっちが雄なんですが雄は斜め後ろから雌のどこかに何かを入れて交尾している最中の写真を私が撮ったのです立体的に撮るのが結構大変だったのですがこういう写真もあります 34

16 現試験法 TG211 別添 7 1week 2week 3week 仔虫 Cont+6 濃度短期試験法 1week オスメス 10~17 日前後の親 Cont+3 濃度 35 TG221 の別添 7 というのは何をやったかというと幼若ホルモン様の物質を与えると雄が産まれてくるということがわかったのです今までは環境変化日照時間を短くするとか餌がなくなるとか過密になると雄が産まれてくることはわかったのですが化学物質によって雄が出てくることがわかったのですこの試験は 3 週間かかるので大変だということもありまして今短期の 1 週間の試験を開発しています 35

17 ミジンコを用いた 2 世代試験法の開発 2 世代目で 1 世代目のばく露ありなしで世代効果を評価するニセネコゼミジンコを用いて試験条件の検討や内分泌かく乱物質の評価を実施オオミジンコ Daphnia manga を用いた試験法ガイドラインを作成し OECD に提案 F2 (F1-Unexposed) Control 6-8 days Exposed F1 Control 6-8 days F2 (F1-Exposed) 6-8 days Exposed 36 同様にミジンコを用いた 2 世代試験 TG221 よりもっと長い試験も開発中ですこれは説明すると長くなるのですがメダカのおばあちゃんの影響が孫に出るまでと同じような試験をミジンコを使ってもやりましょうということでやっています 36

18 今後の課題カエル試験法の開発めだか多世代試験法の開発めだか抗男性ホルモン作用検出法の開発ミジンコ短期試験法の開発ミジンコ多世代試験の開発 37 今後の課題としてはまだまだ作らなきゃいけない試験法がこれだけ残されています 37

19 My belief; The living being does not tell a lie (except the human). Ask them if you lose your way. 38 最後にこれは私の信念なんですが生き物は嘘をつかない人間を除いてですがですから私の信念はもしもわからないことがあったら生き物に聞け何か試験を間違えたら生き物が悪いのではなくてたぶん人間の方が悪いしヒトは嘘をつくけれども生き物が死ぬ生きるふえるふえないということは何万年も変わってないはずなのでそれをもとに基準値を決めていくのはまず間違いないでしょうと思っています 38

20 ご清聴ありがとうございました Title:The little Cyclops Came from Moon. 39 長くなりましたが以上ですご清聴ありがとうございました 39

Microsoft PowerPoint - 3_環境省_立石様.pptx

Microsoft PowerPoint - 3_環境省_立石様.pptx 皆さんこんにちは環境省環境保健部の立石といいます今日は先生方の講演の間ではございますが簡単に環境省から化学物質の内分泌かく乱作用に対する環境省の対応ということでどんなことを環境省が現在取組んでいるのかという話をさせていただきたいと思っておりますよろしくお願いします 1 まずこちらは昔から示されている図ですが環境庁そして環境省の化学物質の内分泌かく乱作用に関する取組みになります