ディスク拡散法によるバンコマイシン耐性型の推定 Multiplex PCR 法によるバンコマイシン耐性遺伝子の検出薬剤耐性緑膿菌感染症法上の定義多剤耐性緑膿菌の耐性メカニズムとその

Size: px

Start display at page:

Download "ディスク拡散法によるバンコマイシン耐性型の推定 Multiplex PCR 法によるバンコマイシン耐性遺伝子の検出薬剤耐性緑膿菌感染症法上の定義多剤耐性緑膿菌の耐性メカニズムとその"

ゆあのじま
5 years ago
Views:

1 病原体検出マニュアル薬剤耐性菌目次 1. 薬剤耐性菌の検査法の留意点薬剤耐性菌検査を行う菌株の継代 PCR 法に用いるテンプレート DNA の抽出方法薬剤感受性試験薬剤耐性菌別検査方法メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症法上の定義メチシリン耐性機構と検査法ディスク拡散法による MRSA の同定 PCR による meca の検出分子疫学解析ペニシリン耐性肺炎球菌感染症法上の定義耐性メカニズムと検査法バンコマイシン耐性腸球菌感染症法上の定義菌種とバンコマイシン耐性遺伝子菌種の同定

2 ディスク拡散法によるバンコマイシン耐性型の推定 Multiplex PCR 法によるバンコマイシン耐性遺伝子の検出薬剤耐性緑膿菌感染症法上の定義多剤耐性緑膿菌の耐性メカニズムとその検査法薬剤耐性アシネトバクター感染症法上の定義菌種の同定について薬剤耐性アシネトバクターの耐性メカニズムとその検査法パルスフィールド電気泳動法によるタイピング解析

3 1. 薬剤耐性菌の検査法の留意点 1.1. 薬剤耐性菌検査を行う菌株の継代薬剤耐性遺伝子の中にはプラスミドにより媒介されているものがあり抗菌薬の含まれていない培地で長期間放置したり何代にもわたり継代したりするとプラスミドが脱落し薬剤耐性を喪失 ( 感性菌化 ) する事がある一方で抗菌薬を含む培地で継代を繰り返すと変異などにより薬剤に対する耐性を獲得する事もあるこれらを防ぐため薬剤耐性菌の検査を行う菌株を何代にもわたり継代することは避けるまた保存菌株を起こす場合には薬剤耐性遺伝子を媒介するプラスミドの脱落を避けるため必要に応じて抗菌薬を含む培地を使用するか抗菌薬含有ディスクを置きディスクの周囲に発育した菌を検査に用いる 1.2. PCR 法に用いるテンプレート DNA の抽出方法 1. 滅菌水を入れたエッペンドルフチューブに McFarland 0.5 になるように被検菌を懸濁する薬剤耐性遺伝子を媒介するプラスミドの脱落を避けるために抗菌薬含有ディスクを置いた場合はディスクの周囲に発育した菌を使用するで 10 分間加熱する 3. 13,000rpm,4 で 5 分間遠心する. 4. 遠心後の上清を鋳型 DNA とし PCR を行う 2. 薬剤感受性試験日常細菌検査における薬剤感受性測定にはディスク拡散法 Etest 微量液体希釈法が広く用いられている本マニュアルではディスク拡散法と Etest を用いた測定法を例にあげる薬剤感受性測定に使用する培地や培養条件などは菌種によって異なるので注意する必要がある 3

5 になるように懸濁する接種 : 滅菌綿棒を上記にて調整した菌液に浸す試験管の管壁に圧し余分な水分を取り除くその後平板培地に均一に塗布する薬剤の配置 : 抗菌薬含有ディスクや Etest

4 接種用菌液の調整増菌する場合 : 液体培地に被検菌を接種し McFarland 0.5 以上の濁度になるまで増菌するこれを希釈して McFarland 0.5 に調整する直接接種の場合 : 寒天培地に発育した菌を滅菌綿棒等でかきとり Mueller-Hinton broth もしくは生理食塩水に McFarland 0.5 になるように懸濁する接種 : 滅菌綿棒を上記にて調整した菌液に浸す試験管の管壁に圧し余分な水分を取り除くその後平板培地に均一に塗布する薬剤の配置 : 抗菌薬含有ディスクや Etest ストリップを平板培地に配置する培養 : 表を参照判定 : 抗菌薬含有ディスクについては阻止円径を測定する Etest については阻止帯が生じはじめた目盛りの部分を MIC 値として読み取る ( 下図 ) 抗菌薬含有ディスクを用いた測定例 Etest を用いた測定例 4

5 表. 抗菌薬含有ディスクおよび Etest を用いた薬剤感受性測定法菌種菌液の調整推奨培地培養条件 Acinetobacter spp. 増菌または直接菌液調整 MHA 1) 増菌または Pseudomonas aeruginosa 直接菌液調整 MHA 増菌または Enterococcus spp. 直接菌液調整 MHA Staphylococcus aureus 直接菌液調整 MHA 好気性 35±2 20~24 時間好気性 35±2 16~18 時間好気性 35±2 16~18 時間バンコマイシンは 24 時間好気性 35±2 16~18 時間オキサシリンメチシリンバンコマイシンは 24 時間 Streptoccous pneumoniae 直接菌液調整 5% 羊血液 MHA 5%CO 2 35±2 20~24 時間 1) MHA, Mueller-Hinton agar 参考文献 Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standards - Tenth Edition, M02-A10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M100-S21. 小栗豊子. 臨床微生物検査ハンドブック第 2 版検査依頼先国立感染症研究所細菌第二部第一室メールアドレス :taiseikin@nih.go.jp 執筆者国立感染症研究所細菌第二部第一室 ( 現名古屋大学大学院医学系研究科分子病原細菌学耐性菌制御学 ) 和知野純一 5

6 3. 薬剤耐性菌別検査方法 3.1. メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症法上の定義メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症は五類感染症に分類され指定届出機関の管理者は患者発生時に届け出る必要がある感染法上の定義及び届出基準は以下のとおりである (1) 定義メチシリンなどのペニシリン剤をはじめとして β-ラクタム剤アミノ配糖体剤マクロライド剤などの多くの薬剤に対し多剤耐性を示す黄色ブドウ球菌による感染症である (2) 臨床的特徴外科手術後の患者や免疫不全者長期抗菌薬投与患者などに日和見感染し腸炎敗血症肺炎などを来し突然の高熱血圧低下腹部膨満下痢意識障害白血球減少血小板減少腎機能障害肝機能障害などの症状を示す (3) 届出基準ア患者 ( 確定例 ) 指定届出機関の管理者は当該指定届出機関の医師が (2) の臨床的特徴を有する者を診察した結果症状や所見からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症が疑われかつ (4) の表の左欄に掲げる検査方法によりメチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症患者と診断した場合には法第 14 条第 2 項の規定による届出を月単位で翌月の初日に届け出なければならないこの場合において検査材料は同欄に掲げる検査方法の区分ごとにそれぞれ同表の右欄に定めるもののいずれかを用いること 6

7 イ感染症死亡者の死体指定届出機関の管理者は当該指定届出機関の医師が (2) の臨床的特徴を有する死体を検案した結果症状や所見からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症が疑われかつ (4) の表の左欄に掲げる検査方法によりメチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症により死亡したと判断した場合には法第 14 条第 2 項の規定による届出を月単位で翌月の初日に届け出なければならないこの場合において検査材料は同欄に掲げる検査方法の区分ごとにそれぞれ同表の右欄に定めるもののいずれかを用いること (4) 届出のために必要な検査所見検査方法検査材料菌の分離による病原体の検出 ( 敗血症心内膜炎腹膜炎胸膜炎髄膜炎骨髄炎 ) 及び以下の検査室での判断基準を満たすもの ( 検査室での判断基準はオキサシリンのMIC 4μ g/ml 又はオキサシリンの感受性ディスク(KB) の阻止円の直径血液腹水胸水髄液通常は無菌的であるべき臨床検体が 10mm 以下 ) 菌の分離による病原体の検出かつ感染症の起因菌と判定された場合 ( 呼吸器感染症肝胆道系感染症創傷感染症腎喀痰膿尿便無菌的では盂腎炎複雑性尿路感染症扁桃炎細菌性中耳炎副鼻腔炎ない検体皮膚軟部組織感染症 ) 及び以下の検査室での判断基準を満たすもの ( 検査室での判断基準はオキサシリンのMIC 4μ g/ml 又はオキサシリンの感受性ディスク(KB) の阻止円の直径が10mm 以下 ) 7

8 メチシリン耐性機構と検査法黄色ブドウ球菌ゲノムに meca 遺伝子が組み込まれることで penicillin binding protein 2 (PBP2 または PBP2a) が産生される PBP2 はβ-ラクタム薬との親和性が低いためほぼ全てのβ-ラクタム薬に対する耐性を獲得する meca 遺伝子は meca の発現調節遺伝子や recombinase を含む staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) と呼ばれるカセットクロモゾームとして染色体に組み込まれる SCCmec はいくつかのタイプに分けられ発見とともに種類が増えるため詳細は SCCmec の web サイト ( を参照されたい医療関連感染に多く見られる MRSA は SCCmec type II を保有し市中感染では SCCmec type IV または V を保有する株が多い MRSA の分離には MRSA 選択培地を使う Community associated MRSA (CA-MRSA) の中にはオキサシリンに低感受性を示す株が多くオキサシリンを選択剤として用いた培地では発育しないことがあるオキサシリン低感受性株の発育に配慮した培地としてセフォキシチンを選択剤に用いたものが用いられることが多いセフォキシチンを選択剤に用いた選択培地としては MS-CFX 寒天培地 ( 日水製薬 ) ChromID MRSA ( シスメックスビオメリュー ) BD MRSA 選択培地 ( ベクトンディッキンソン ) OPAII Staphylococcus Agar( ベクトンディッキンソン ) MDRS-K 寒天培地 ( 極東製薬 ) などがあるまたクロモアガー MRSA( 関東化学 ) もセファロスポリン系の選択剤を用いている MRSA 選択培地の多くは生培地として販売されている培地上の性状は黄色ブドウ球菌に準ずるディスク拡散法による MRSA の同定オキサシリンディスクまたはセフォキシチンディスクを用いるオキサシリンディスクによる感受性試験においては 24 時間培養し透過光でディスク周辺のわずかな発育を観察する CA-MRSA の中にはオキサシリン低感受性を示す株があるためオキサシリンディスクを用いた感受性判定には慎重を要する CLSI(M02-A10) ではセフォキシチンディスクを使う方が望ましいとしている 8

オキサシリンディスクによる感受性試験 Healthcare associated MRSA Community associated MRSA 3.1.

9 オキサシリンディスクによる感受性試験 Healthcare associated MRSA Community associated MRSA PCR による meca の検出 PCR 法に用いるテンプレートの調整方法蒸留水に菌を懸濁して加熱したテンプレートの場合 DNA の溶出量が少なく PCR による増幅産物が少ないことがある Lysostaphyn を 1µg/100µl 濃度に溶かした TE バッファーに菌を懸濁し 37 で 10 分間インキュベートした後 100 で 10 分間加熱すると十分量の DNA が溶出する meca を検出するためのプライマーの例を以下に示す meca Primers 5 3 TGCTATCCACCCTCAAACAGG AACGTTGTAACCACCCCAAGA PCR 産物サイズ 286bp PCR 条件 94 1min 94 1min 50 30sec 30cycles 72 2min 9

10 3.1.5 分子疫学解析 MRSA の集団感染が疑われる場合は PFGE 解析を行う MRSA は Lysozyme ではほとんど消化されないので菌をアガロースに包埋する際に Lysostaphyn を 5µg/100µl 濃度に混合するアガロースブロックは Lysostaphyn を 1µg/100µl 濃度に加えた 0.5M EDTA ph8.0 中で 37 4 時間インキュベートした後 proteinase K 処理する制限酵素は SmaI を用いる約 500kbp までのバンドおよそ 20 本程度からなる電気泳動パターンが得られる電気泳動プログラムとしては例えば CHEF Mapper (BioRAD) の組み込みプログラムは 6 V/cm パルス角度 120 度 5.3~34.9sec 20h である MRSA の PFGE パターンは比較的安定な傾向にあり集団感染の場合バンドパターンは完全一致することが多い PFGE のかわりに Cica Geneus Staph POT kit( 関東化学 ) を用いても PFGE とほぼ同等の結果が得られる参考文献 Okuma K, Iwakawa K, Turnidge JD, Grubb WB, Bell JM, O'Brien FG et al: Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. J. Clin. Microbiol. 40: (2002) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard. 10th ed. CLSI document M02-A10. Wayne (PA): 検査依頼先国立感染症研究所細菌第二部第一室メールアドレス :taiseikin@nih.go.jp 執筆者愛知県衛生研究所生物学部細菌研究室鈴木匡弘 10

11 3.2. ペニシリン耐性肺炎球菌感染症法上の定義ペニシリン耐性肺炎球菌 (PRSP: penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae) とはペニシリンGに対して耐性を示す肺炎球菌を指し届出に必要な検査所見は下表の通りである検査方法検査材料菌の分離による病原体の検出 ( 敗血症心内膜炎腹膜炎胸膜炎血液腹水胸水髄膜炎骨髄炎 ) 及び以下の検査室での判断基準を満たすもの ( 検髄液その他の通査室での判断基準はペニシリンの MIC 0.125μg/ml 又はオキ常は無菌的であサシリンの感受性ディスク (KB) の阻止円の直径が 19 mm 以下 ) るべき臨床検体菌の分離による病原体の検出かつ感染症の起因菌と判定された喀痰膿尿便場合 ( 呼吸器感染症肝胆道系感染症創傷感染症腎盂腎炎無菌的ではない複雑性尿路感染症扁桃炎細菌性中耳炎副鼻腔炎皮膚軟部検体組織感染症 ) 及び以下の検査室での判断基準を満たすもの ( 検査室での判断基準はペニシリンの MIC 0.125μg/ml 又はオキサシリンの感受性ディスク (KB) の阻止円の直径が 19 mm 以下 ) 耐性メカニズムと検査法ペニシリン耐性機序 PRSP は肺炎球菌の細胞壁を構成するペプチドグリカンの生合成に関与するペニシリン結合蛋白 (PBP1A, PBP2B) の変異や PBP2X と命名された変種の PBP の獲得によるものである 1) 耐性度の高い菌株では複数のペニシリン結合蛋白の変異に集積性が認められ MIC 値が 1μg/ml 以上の PRSP ではペニシリンの標的である 3 種類の PBP (PBP1A, PBP2B, PBP2X) の全てに何らかの変異が同時に見られる事が多い 2) 検査法薬剤感受性測定 11

12 平板法微量液体希釈法ディスク法 Etest automated 法がある製品を用いる測定法に関する QC は製造者によってなされている製造者の示す手順を守ることが重要である 1) 平板法ミュラーヒントン寒天培地にウマ溶血血液を 5% 混合し規定の薬剤を含む培地を作成する平板培地作成の手順は煩雑であるこの方法は CLSI では認められていない 2) 微量液体希釈法フローズンプレートまたはドライプレート ( 栄研化学 ) を用い測定を行うミュラーヒントン培地に溶血ウマ血液を添加し調製液体培地として使用する McFarland 0.5 濁度の菌液を調製し指定菌量を液体培地に接種する 35±2 で時間培養する判定基準は髄膜炎由来肺炎球菌は MIC が 0.12μg/mL の場合 PRSP と判定される非髄膜炎由来肺炎球菌は MIC が 8μg/mL の場合 PRSP と判定され MIC が 2-4μg/mL の場合 PISP ( ペニシリン低感受性 ) と判定されるただし感染症法に基づく報告においては由来に関わらず MIC が 0.125μg/mL の場合 PRSP として報告することになる 3) KB ディスク 5% ヒツジ血液添加 MH 寒天培地を用い 1 µg のオキサシリンを含む KB ディスクを使用する 5% CO 2 35±2 環境下で時間培養した後 KB ディスクの周囲に出現する発育阻止円の直径によりペニシリンGの耐性と低感受性または感受性の判別を行う発育阻止円の直径が 20 mm の場合はペニシリン感受性肺炎球菌 (PSSP) と判定される直径が <20 mm の場合 PRSP もしくは PISP である PRSP や PISP を判定するにはあらためて微量液体希釈法により MIC を測定し判定することが望ましい 4) Etest 製造者の指示に従い感受性測定および判定を行うあらかじめ薬剤ごとに微量液体希釈法との相関を見ておく必要がある 12

13 5) Automated very major error, major error, minor error の出現頻度は文献 3 と 4 を参照 PCR 法による変異 pbp 遺伝子の検出肺炎球菌の感受性を測定するではなくペニシリン耐性をもたらしている pbp 遺伝子を増幅しその変異を見ることにより耐性度を推定するキットが販売されている ( ペニシリン耐性肺炎球菌 (PRSP) 遺伝子検出試薬 [ 湧永製薬 ]) 参考文献 1. Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance. Zapun A, Contreras-Martel C, Vernet T. FEMS Microbiol Rev 2008, 32: Antibiotic susceptibility in relation to penicillin-binding protein genes and serotype distribution of Streptococcus pneumoniae strains responsible for meningitis in Japan, 1999 to Ubukata K, Chiba N, Hasegawa K, Kobayashi R, Iwata S, Sunakawa K. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the vitek 2 system. de Cueto M, Ceballos E, Martinez-Martinez L, Perea E.J, Pascual A. J Clin Microbiol 2004, 42: Rapid identification and antimicrobial susceptibility profiling of Gram-positive cocci in blood cultures with the Vitek 2 system. Lupetti A, Barnini S, Castagna B, Capria AL, Nibbering PH. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2010, 29:89-95 検査依頼先国立感染症研究所細菌第一部第三室執筆者常彬大西真 13

14 3.3. バンコマイシン耐性腸球菌感染症法上の定義バンコマイシン耐性腸球菌 (vancomycin-resistant enterococci;vre) とはバンコマイシン耐性遺伝子 (vana, vanb, vanc など ) を保有する腸球菌である届出に必要な検査所見は下表の通りである検査方法分離同定による腸球菌の検出かつ薬剤耐性の特性の確認 ( 分離菌のバンコマイシンの MIC 値が 16 μg/ml 以上 ) 分離同定による腸球菌の検出かつ分離菌からの vana vanb 又は vanc 遺伝子の検出検査材料血液腹水胸水髄液その他の通常は無菌的であるべき臨床検体菌種とバンコマイシン耐性遺伝子腸球菌 (Enterococcus spp.) には約 22 種含まれているが臨床検体からは E. faecalis, E. faecium のほか E. gallinarum E. casseliflavus E. avium が分離される事が多い感染症法上は (1) の分離菌のバンコマイシンの MIC 値が 16μg/ml 以上を満たせば VRE と判定されるが臨床上および感染対策を実施するための疫学上は菌種の同定とバンコマイシン耐性遺伝子の確認を行うことが望ましいバンコマイシン耐性遺伝子の vana vanbは接合等で異なる菌種間に伝播しうるため全ての菌種が獲得する可能性がある一方 vanc は染色体上に存在しており vanc1 は E. gallinarum vanc2/3 は E. casseliflavus 特異的である ( 表 ) 臨床的疫学的に問題となる VRE は多くの場合 vana vanbを獲得した E. faecalis, E. faecium である一方でバンコマイシン耐性遺伝子のうち vanb を保有していてもバンコマイシンの MIC が 16μg/ml 未満の事もある 14

15 菌種の同定とバンコマイシン耐性遺伝子 ( 表 ) 遺伝子型 VanA VanB VanC MIC VCM 64~>1000 VCM 4~>1000 VCM 2~32 (µg/ml) TEIC 16~512 TEIC <0.5~8 TEIC 0.5~1 耐性遺伝子プラスミド染色体染色体の存在部位 ( 染色体 ) ( プラスミド ) 伝達性あり ( あり ) なし分離菌種 E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecalis E. faecalis E. casseliflavus E. avium E. gallinarum E. casseliflavus 菌種の同定医療機関の検査室などで実施されている生化学性状を用いた同定法で実施可能であるただし自動検査機器による同定では種レベルの同定が不正確となる可能性がある VRE の検出上は臨床的疫学的により重要な E. faecium E. faecalis をその他の菌種から区別することが有用であり簡便な同定方法として EF 培地を用いるものおよび Multiplex PCR による ddl genes 検出によるものがある EF 培地を用いた同定方法 EF 培地に被験菌を接種し時間培養しコロニーの色調で判定する注意 :1 培養時間が長くなると色調が変化し E. faeciumの黄色が褐色化することがある 2 E. faecalis の暗赤褐色の色調は比較的判定しやすいがその他の色調は鑑別に経験が必要となることがあるコントロール株と同時に実施することおよび他の同定方法とあわせて最終判定することが望ましい 15

コロニーの色調暗赤褐色黄色褐色菌種 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium その他の菌種 Enterococcus faecalis

ddl-e. faecalis-f ddl-e. faecalis-r ddl-e. faecium-f ddl-e.

PCR 条件 95-20 sec. 55-120 sec. 35 cycles 74

16 コロニーの色調暗赤褐色黄色褐色菌種 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium その他の菌種 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus gallinarum Multiplex PCR による ddl genes 検出 Primers 5-3 PCR 産物のサイズ ddl-e. faecalis-f ddl-e. faecalis-r ddl-e. faecium-f ddl-e. faecium-r ATCAAGTACAGTTAGTCT ACGATTCAAAGCTAACTG TAGAGACATTGAATATGCC CATC GTGTAAGCTAACTTC 941 bp 525 bp PCR 条件 sec sec. 35 cycles 74 で 5 min. インキュベーションディスク拡散法によるバンコマイシン耐性型の推定 VanA VanB, および VanC 型はそれぞれバンコマイシンとテイコプラニンに対する耐性パターンが異なるためディスク拡散法により推定する事が可能であるミューラーヒントン培地 1 枚に被験菌を密に接種後バンコマイシン (VCM) とテイコプラニン (TEIC) のディスクを置き時間培養し阻止円径を比較する 16

阻止円判定バンコマイシンテイコプラニンなしなし VanA なしあり VanB ありあり VanC VanA 型 VanB 型 VanC 型 3.3.5.

ATGGGAAGCCGATAGTC vanb-r GATTTCGTTCCTCGACC vanc1 vanc-1-f GGTATCAAGGAAACCTC vanc-1-r CTTCCGCCATCATAGCT vanc2/3

17 阻止円判定バンコマイシンテイコプラニンなしなし VanA なしあり VanB ありあり VanC VanA 型 VanB 型 VanC 型 Multiplex PCR 法によるバンコマイシン耐性遺伝子の検出 Primers 5-3 vana vana-f GGGAAAACGACAATTGC vana-r GTACAATGCGGCCGTTA vanb vanb-f ATGGGAAGCCGATAGTC vanb-r GATTTCGTTCCTCGACC vanc1 vanc-1-f GGTATCAAGGAAACCTC vanc-1-r CTTCCGCCATCATAGCT vanc2/3 vanc-2/c-3-f CTCCTACGATTCTCTTG vanc-2/c-3-r CGAGCAAGACCTTTAAG PCR 産物サイズ 732 bp 635 bp 822 bp 439 bp PCR 条件 sec sec 35 cycles 74-5 min 17

18 注 : 近年 vana を保有している株で表現型 ( ディスク拡散法による耐性パターン ) が VanB 型となる株 (VanB phenotype VanA) が報告されている参考文献 1.Werner G, Coque TM, Hammerum AM, et al. Emergence and spread of vancomycin resistance among enterococci in Europe. Euro Surveill Nov 20;13(47) 2. Kanchana MV, Deneer H, Blondeau Cost-effective algorithm for detection and identification of vancomycin-resistant enterococci in surveillance cultures. J. Eur J Clin Microbiol Infect Dis May;19(5): Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P.Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol Jan;33(1): Park IJ, Lee WG, Shin JH, et al. VanB phenotype-vana genotype Enterococcus faecium with heterogeneous expression of teicoplanin resistance. J Clin Microbiol Sep;46(9): 検査依頼先国立感染症研究所細菌第二部第一室メールアドレス :taiseikin@nih.go.jp 執筆者国立感染症研究所細菌第二部第一室鈴木里和 18

19 3.4. 薬剤耐性緑膿菌感染症法上の定義広域 β-ラクタム剤アミノ配糖体フルオロキノロンの 3 系統の薬剤に対して耐性を示す緑膿菌である届出に必要な検査所見は下記の通りであるア ) イミペネムのMIC 16μg/ml 又はイミペネムの感受性ディスクの阻止円の直径が13mm 以下イ ) アミカシンのMIC 32μg/ml 又はアミカシンの感受性ディスクの阻止円の直径が14mm 以下ウ ) シプロフロキサシンのMIC 4μg/ml 又はシプロフロキサシンの感受性ディスクの阻止円の直径が15mm 以下ただしイミペネム以外のカルバペネム系薬剤により検査を実施した場合はその検査により耐性の結果が得られた場合も判断基準のアを満たすものとするイミペネムによる検査とその他のカルバペネム系薬剤による検査を実施した場合にはいずれかの薬剤の検査で耐性の結果が得られた場合にも基準を満たすものとするまたシプロフロキサシン以外のフルオロキノロン系薬剤により検査を実施した場合はその検査により耐性が得られた場合も判断基準のウを満たすものとするシプロフロキサシンによる検査とその他のフルオロキノロン系薬剤による検査を実施した場合にはいずれかの薬剤の検査で耐性の結果が得られた場合にも基準を満たすものとするなお我が国の臨床現場ではカルバペネムアミノグリコシドフルオロキノロンの 3 系統の抗菌薬に対し耐性を示す緑膿菌を薬剤耐性緑膿菌のほか多剤耐性緑膿菌 (multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRP) と称することもある本項では多剤耐性緑膿菌の語を用いる多剤耐性緑膿菌の耐性メカニズムとその検査法カルバペネム耐性機構 19

メタロ -β- ラクタマーゼ :IMP-1 や VIM-2 といったメタロ -β- ラクタマーゼを産生する場合イミペネムなどのカルバペネム系抗菌薬に耐性を示すメタロ -β- ラクタマーゼ産生株は SMA ディスク ( 栄研化学 ) を用いて識別することができる 3.4.2.1.1. SMA ディスクを用いたメタロ -β- ラクタマーゼ産生のスクリーニング検査 1.

20 メタロ -β- ラクタマーゼ :IMP-1 や VIM-2 といったメタロ -β- ラクタマーゼを産生する場合イミペネムなどのカルバペネム系抗菌薬に耐性を示すメタロ -β- ラクタマーゼ産生株は SMA ディスク ( 栄研化学 ) を用いて識別することができる SMA ディスクを用いたメタロ -β- ラクタマーゼ産生のスクリーニング検査 1. 被検菌をミューラーヒントン寒天培地等に塗布する 2. 下図のように濃厚に塗布した部分に CAZ( セフタジジム ) のディスクを置く ( 薬剤耐性遺伝子に関連するプラスミドの脱落を防ぐ為 ) 3. 35,16 18 時間 ( あるいは over night) 培養する. 4. 培養後 CAZ ディスク周囲の菌を滅菌綿棒でかき採り滅菌水を入れたエッペンドルフチューブに McFarland 0.5 になるように懸濁するで調整した菌液に滅菌綿棒を浸した後ミューラーヒントン寒天培地全面に塗布する. 6. SMA ディスク CAZ ディスク IPM ディスクを下図のように配置する. CAZ: セフタジジム IPM: イミペネム SMA ディスクの作用により発育阻止帯の拡張 ( ) が認められた場合メタロ -β- ラクタマーゼ産生株と判定する 20

21 PCR によるメタロ -β- ラクタマーゼ遺伝子の検出以下に PCR プライマーセットと反応条件の例を示す耐性遺伝子増幅サイズプライマー配列の種類 blaimp-1 5 -ACC GCA GCA GAG TCT TTG CC bp 5 -ACA ACC AGT TTT GCC TTA CC-3 blaimp-2 5 -GTT TTA TGT GTA TGC TTC C bp 5 -AGC CTG TTC CCA TGT AC-3 blavim-2 5 -ATG TTC AAA CTT TTG AGT 801 bp AAG-3 5 -CTA CTC AAC GAC TGA GCG-3 blandm-1 5 -TTG CCC AAT ATT ATG CAC CC bp 5 -ATT GGC ATA AGT CGC AAT CC アミカシン耐性機構アミノグリコシドアセチル化酵素 : アミカシン耐性には AAC(6')-Ib といったアミノグリコシドアセチル化酵素が関与しているアミノグリコシドアセチル化酵素には亜型が多数存在するため全てを PCR により検査するのは現実的には難しい 21

22 フルオロキノロン耐性機構 DNA ジャイレーストポイソメラーゼ IV の変異 : フルオロキノロンの標的部位である DNA ジャイレーストポイソメラーゼ IV の QRDR(Quinolone Resistance Determinant Region) 領域に変異が入ることでフルオロキノロン耐性が生じるしたがって QRDR 領域を PCR で増幅しその増幅産物の配列を決定することで耐性に関与する変異を検出することができる詳細は文献を参照いただきたい参考文献 1. PCR typing of genetic determinants for metallo-β-lactamase and integrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron. Shibata N, Doi Y, Yamane K, Yagi T, Kurokawa H, Shibayama K, Kato H, Kai K, Arakawa Y. J Clin Microbiol Dec;41(12): Convenient test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds. Arakawa Y, Shibata N, Shibayama K, Kurokawa H, Yagi T, Fujiwara H, Goto M.J Clin Microbiol Jan;38(1): Type II topoisomerase mutations in fluoroquinolone-resistant clinical strains of Pseudomonas aeruginosa isolated in 1998 and 1999: role of target enzyme in mechanism of fluoroquinolone resistance.akasaka T, Tanaka M, Yamaguchi A, Sato K. Antimicrob Agents Chemother Aug;45(8): 検査依頼先国立感染症研究所細菌第二部第一室メールアドレス :taiseikin@nih.go.jp 執筆者国立感染症研究所細菌第二部第一室 ( 現名古屋大学大学院医学系研究科分子病原細菌学耐性菌制御学 ) 和知野純一 22

23 3.5. 薬剤耐性アシネトバクター感染症法上の定義広域 β-ラクタム剤アミノ配糖体フルオロキノロンの3 系統の薬剤に対して耐性を示すアシネトバクター属菌である届出に必要な検査所見は下記の通りである耐性 (R) の判定基準抗菌薬微量液体希釈法ディスク拡散法イミペネム * 16µg/mL 阻止円直径 13mm アミカシン 32µg/mL 阻止円直径 14mm シプロフロキサシン ** 4µg/mL 阻止円直径 15mm * イミペネム以外のカルバペネム系薬剤により検査を実施した場合耐性の結果が得られた場合も基準を満たすものとするイミペネムによる検査とその他のカルバペネム系薬剤による検査を実施した場合にはいずれかの薬剤の検査で耐性の結果が得られた場合にも基準を満たすものとする ** シプロフロキサシン以外のフルオロキノロン系薬剤により検査を実施した場合その検査により耐性が得られた場合も基準を満たすものとするシプロフロキサシンによる検査とその他のフルオロキノロン系薬剤による検査を実施した場合にはいずれかの薬剤の検査で耐性の結果が得られた場合にも基準を満たすものとする菌種の同定についてアシネトバクター属のうち医療現場では Acinetobacter baumannii Acinetobacter pittii ( 旧名称 ;Acinetobacter genomic species 3) Acinetobacter nosocomialis ( 旧名称 ;Acinetobacter genomic species 13TU) が主に分離される上記 3 菌種に自然環境中から分離される Acinetobacter calcoaceticus を加えた 4 菌種は生化学的性状による分類が困難であり A. calcoaceticus -A. baumannii complex とひとまとめにされることもある生化学的性状をもとに菌種を同定するキットや自動検査機器等で A. baumannii と判定された菌種には上記の 4 菌種が含まれるためタイピングなどの検査結果の解釈には注意が必要である 23

アシネトバクター属の菌種分類方法については数多く提唱されているが一部を参考文献に示した 3.5.3. 薬剤耐性アシネトバクターの耐性メカニズムとその検査法 3.5.3.1.

(1~8µg/mL) も報告されている 3.5.3.1.1. SMA disk を用いたメタロ-β-ラクタマーゼ産生のスクリーニング検査メタロ-β-ラクタマーゼ産生の有無を推定する方法のひとつにメタロ-β-ラクタマーゼ阻害剤であるメルカプト酢酸ナトリウム (SMA) を用いる方法がある 1. 滅菌水あるいは TE buffer にコロニーを懸濁し McFarland 0.

24 アシネトバクター属の菌種分類方法については数多く提唱されているが一部を参考文献に示した薬剤耐性アシネトバクターの耐性メカニズムとその検査法カルバペネム耐性主な耐性機構はメタロ-β-ラクタマーゼ (IMP-1 型 IMP-2 型 VIM-2 型等 ) あるいは OXA 型 β-ラクタマーゼ (OXA-51-like OXA-23-like OXA-40/24-like OXA-58-like) 産生によるただし OXA 型 β-ラクタマーゼ産生株であってもイミペネム等のカルバペネム系薬剤に対する MIC が比較的低い株 (1~8µg/mL) も報告されている SMA disk を用いたメタロ-β-ラクタマーゼ産生のスクリーニング検査メタロ-β-ラクタマーゼ産生の有無を推定する方法のひとつにメタロ-β-ラクタマーゼ阻害剤であるメルカプト酢酸ナトリウム (SMA) を用いる方法がある 1. 滅菌水あるいは TE buffer にコロニーを懸濁し McFarland 0.5 程度の菌液を作製する 2. 調整した菌液を綿棒で MH 平板寒天培地の前面に塗布する (120 度ずつ角度を変えて塗布することを 4 回行う ) 3. KB ディスクを下図のように置き 35 で一晩 (16-18 時間 ) 培養後判定するメタロ-β-ラクタマーゼ産生株メタロ-β-ラクタマーゼ非産生株 CAZ CAZ SMA IPM IPM CAZ; セフタジジム IPM; イミペネムメタロ-β-ラクタマーゼ産生株の場合は SMA の作用によりセフタジジム及びイミペネムの阻止円拡大が観察される ( 上図 ) 一方 OXA 型 β-ラクタマーゼの効果的な阻害剤は見出されておらず OXA 型 β-ラクタマーゼ産生株の推定は PCR 法での検出が必要である 24

25 PCR 法によるメタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子の検出わが国で分離されるアシネトバクター属の産生するメタロ-β-ラクタマーゼとして IMP-1 IMP-2 VIM-2 が報告されている PCR 検出用のプライマーセットを以下に示す遺伝子型プライマー配列 (5 3 ) 増幅サイズ IMP-1 型 IMP-2 型 VIM-2 型 F; 5 -ACC GCA GCA GAG TCT TTG CC-3 R; 5 -ACA ACC AGT TTT GCC TTA CC-3 F; 5 -GTT TTA TGT GTA TGC TTC C-3 R; 5 -AGC CTG TTC CCA TGT AC-3 F; 5 -ATG TTC AAA CTT TTG AGT AAG-3 R; 5 -CTA CTC AAC GAC TGA GCG-3 587bp 678bp 801bp PCR 反応サイクル例 94 2 分 94 1 分 55 1 分 30 サイクル 72 1 分 30 秒 72 5 分 PCR 法による OXA 型 β-ラクタマーゼ遺伝子の検出アシネトバクター属の産生する OXA 型 β-ラクタマーゼとして OXA-51-like OXA-23-like OXA-40/24-like OXA-58-like の 4 種類があるアシネトバクター属のうち A. baumannii は通常染色体上に OXA-51-like をコードする遺伝子を持つが多くの場合は産生されておらずプロモーター配列を含む ISAba1 を上流に獲得した場合のみ OXA-51-like β-ラクタマーゼを産生するそのため OXA-51-like 産生株の推定は ISAba1 F プライマーと OXA-51-like R プライマーを組み合わせ増幅するか否かを確認する 25

26 遺伝子型プライマー配列 (5 3 ) 増幅サイズ F; 5 -TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG-3 OXA-51-like R; 5 -TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG-3 353bp F; 5 -GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3 OXA-23-like R; 5 - ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT-3 501bp F; 5 -GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA-3 OXA-40/24-like R; 5 -AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT-3 246bp F; 5 -AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG-3 OXA-58-like R; 5 -CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC-3 599bp F; 5 -CAC GAA TGC AGA AGT TG-3 ISAba1 R; 5 -CGA CGA ATA CTA TGA CAC-3 559bp* * ISAba1 F と OXA-51-like R プライマーを組み合わせた場合の増幅サイズ : 1,222bp PCR サイクル例 OXA 型 β-ラクタマーゼ ISAba1 F-OXA-51-like R 94 5 分 95 5 分秒秒秒 30 サイクル秒 35 サイクル秒 72 3 分 72 6 分 72 5 分アミノグリコシド耐性機構アミノグリコシド系薬剤に対する耐性はアミノグリコシド修飾酵素 (aacc1 aada1 aadb apha6 など ) や 16SrRNA メチラーゼ (arma) などが報告されている種類も多く通常の検査で全てを調べるのは困難なためここでは省略するフルオロキノロン耐性機構アシネトバクター属のキノロン耐性にはキノロンの標的部位である DNA ジャイレース (GyrA) およびトポイソメラーゼ IV(ParC) の変異が主に関与する変異によってキノロン耐性を付与する領域は QRDR(Quinolone Resistance Determinant 26

Region) と呼ばれる変異の有無は QRDR 領域を PCR によって増幅し増幅産物のシークエンス解析を行うことで検出可能である PCR およびシークエンス用のプライマー等の詳細は文献を参考にしていただきたい 3.5.4.

27 Region) と呼ばれる変異の有無は QRDR 領域を PCR によって増幅し増幅産物のシークエンス解析を行うことで検出可能である PCR およびシークエンス用のプライマー等の詳細は文献を参考にしていただきたいパルスフィールド電気泳動法によるタイピング解析制限酵素 :SmaI あるいは ApaI 泳動条件 (CHEF Mapper (Bio-Rad) の場合 ) : スイッチングタイム 2.98s~21.79s 電圧 6V / 温度 14 / 泳動時間 27 時間 * プラグの作製は E. coli 等と同様の方法で行う泳動パターンの例を以下に示す ( 菌株はいずれも Acinetobacter baumannii ) SmaI ApaI M M M (kbp) lane 1: A. baumannii isolate_1 lane 2: A. baumannii isolate_ lane 3: A. baumannii isolate_3 lane 4: A. baumannii isolate_4 M: CHEF DNA size standards 48.5 lambda ladder marker (Bio-Rad) 27

28 参考文献菌種の同定 1. Dolzani L, Tonin E, Lagatolla C, Prandin L, Monti-Bragadin C. Identification of Acinetobacter isolates in the A. calcoaceticus- A. baumannii complex by restriction analysis of the 16S-23S rrna intergenic-spacer sequences. J Clin Microbiol. 1995, 33: (16S-23SrRNA intergenic-spacer 領域 PCR 産物の制限酵素切断パターンで判断する方法 ) 2. Scola B, Gundi V, Khamis A, Raoult D. Sequencing of rpob gene flanking spacers for molecular identification of Acinetobacter species. J Clin Microbiol 2006, 44: (rpob 遺伝子シークエンスによって分類する方法 ) 耐性遺伝子の検出 1. Shibata N, Doi Y, Yamane K, Yagi H, Kurokawa H, Shibayama K, Kato H, Kai K, Arakawa Y. PCR typing of genetic determinants for metallo-beta-lactamases and integrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron. J Clin Microbiol. 2003, 41: Woodford N, Ellington MJ, Coelho JM, Turton JF, Ward ME, Brown S, Amyes SG, Livermore DM. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. Int J Antimicrob Agents 2006, 27: Turton JF, Ward ME, Woodford N, Kaufmann ME, Pike R, Livermore DM, Pitt TM. The role of ISAba1 in expression of OXA carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii. FEMS Microbiol Lett. 2006, 258: Vila J, Ruiz J, Goni P, Marcos A, Jimenez de Anta T. Mutation in the gyra gene of quinolone-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents Chemother. 1995, 39: Vila J, Ruiz J, Goni P, Jimenez de Anta T. Quinolone-resistance mutations in the topoisomerase IV parc gene of Acinetobacter baumannii. 1997, 39: 検査依頼先国立感染症研究所細菌第二部第一室メールアドレス :taiseikin@nih.go.jp 執筆者国立感染症研究所細菌第二部第一室松井真理 28

耐性菌届出基準

耐性菌届出基準 37 ペニシリン耐性肺炎球菌感染症 (1) 定義ペニシリン G に対して耐性を示す肺炎球菌による感染症である (2) 臨床的特徴小児及び成人の化膿性髄膜炎や中耳炎で検出されるがその他副鼻腔炎心内膜炎心嚢炎腹膜炎関節炎まれには尿路生殖器感染から菌血症を引き起こすこともある指定届出機関の管理者は当該指定届出機関の医師が (2) の臨床的特徴を有する者を診察した結果症状や所見からペニシリン耐性肺炎球菌感染症が疑われ

ディスク拡散法によるバンコマイシン耐性型の推定 Multiplex PCR 法によるバンコマイシン耐性遺伝子の検出 薬剤耐性緑膿菌 感染症法上の定義 多剤耐性緑膿菌の耐性メカニズムとその

ディスク拡散法によるバンコマイシン耐性型の推定 Multiplex PCR 法によるバンコマイシン耐性遺伝子の検出薬剤耐性緑膿菌感染症法上の定義多剤耐性緑膿菌の耐性メカニズムとその