166 日本金属学会誌 (016) 第 80 巻 増殖する過程において,H S の産生が顕著なことが挙げられる. サルモネラ菌から産生された H S は菌の培養培地に鉄 (Fe) 源が含まれていると, それと反応して黒色の硫化鉄 (FeS) を形成する. したがって, クエン酸鉄などの鉄 (Fe)

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1 日本金属学会誌第 80 巻第 3 号 (016) サルモネラ菌の硫化水素産生能を用いた銅の抗菌性評価 翠川裕 1 仲井正昭 翠川薫 3 新家光雄 1 鈴鹿医療科学大学保健衛生学部 東北大学金属材料研究所 3 三重大学大学院医学系研究科 J. Japan Inst. Met. Mater. Vol. 80, No. 3 (016), pp The Japan Institute of Metals and Materials Evaluation of Antibacterial Activity of Copper by Hydrogen Sulfide Producing Salmonella Yutaka Midorikawa 1, Masaaki Nakai, Kaoru Midorikawa 3 and Mitsuo Niinomi 1 Faculty of Health, Suzuka University of Medical Science, Suzuka Institute for Materials Research, Tohoku University, Sendai Graduate School of Medicine, Mie University, Tsu A novel method for detecting antimicrobial activity using an innate property of the Salmonella bacteria, namely, the ability of Salmonella to produce hydrogen sulfide (H S) was developed in this study. The effectiveness of the method was evaluated by comparing the antibacterial activityofcoppertothatofaluminum.salmonella was inoculated over the entire surface of deoxycholate hydrogen sulfide lactose (DHL) agar plates that included Ammonium ferric citrate (C 6 H 8 FeN). Approximately5mL of cupric chloride (CuCl,1 weight ratio) solution or aluminum chloride (AlCl 3,1 weight ratio) solution was added to the center of the medium. The surface of the medium was covered with plastic PET (polyethylene terephthalate) material to induce an anaerobic state. Salmonella was cultured under anaerobic conditions at 310 K (37 C) for 86.4 ks (4 h). The antibacterial activity of copper was determined by observing the medium surface color change due to iron sulfide (FeS) formation, which was caused by the production of H SbySalmonella; blackness indicated presence of newly formed FeS. A quantitative evaluation of copper's antimicrobial activity was performed using a gradient of CuCl concentrations; results were compared with those of the present standard method, Kirby Bauer disk diffusion method on the Mueller Hinton medium. Finally, in order to evaluate the antibacterial activity of metals, Salmonella was inoculated on DHL agar plates. Subsequently, Japanese coins (1 yen, 5 yen, 10 yen, 50 yen, 100 yen and 500 yen coins) were placed on the agar and cultured at 310 K for 86 ks. Salmonella cultured in the presence of AlCl 3 produces black color, while no blackening is observed with CuCl, suggesting that copper possesses an antibacterial property against Salmonella. CuCl suppresses H S production by Salmonella, as Cu + forms a transparent circle or ellipse (new halo) around the point at which CuCl had has been plated. The size of the new halo increases in direct proportion to the concentration of CuCl. The halo is no longer visible at mg of CuCl in our method, while the halo disappears with 4.34 mg of CuCl in the Kirby Bauer method. Therefore, the present method is 19 times more sensitive than the standard method, suggesting increased usefulness and effectiveness in testing antibacterial activity. No FeS dependent black circle is formed under any of the coins, with the exception of the 1 yen coin, which contains aluminum and no copper. Therefore, the copper containing coins have an antibacterial effect. [doi:10.30/jinstmet.j015049] (Received August 5, 015; Accepted November 5, 015; Published January 15, 016) Keywords: salmonella, copper, antimicrobial, hydrogen sulfide, iron sulfide 1. 緒言抗菌性を示す金属があるが, そのような金属の中でも, 微生物には有害であるが, 人体には比較的害の少ない金属として銀および銅などが古くから知られている. インプラントなどに用いられる医療材料として注目されているチタンや最も身近な鉄やアルミニウムなど自体には抗菌性が認められていない 1 3). なお, 一般的には, 金属材料の抗菌性は, 金属単体ではなく, それから溶出される金属イオンの対菌毒性により発現する. 現在, 食品衛生対策としての台所用品, 肌着や靴下等の衣料品およびバス トイレ用品など, 様々な抗菌加工製品が市場に多く出回っている. 抗菌加工が施されたプラスチック製品, 金属製品やセラミックス製品など ( 中間製品 を含む ) の表面における細菌に対する抗菌性評価法および抗菌効果は,JIS Z ) により規定されている. この方法では, 素材の抗菌性を調べる場合, 試験片をグラム陰性菌である大腸菌または同陽性菌である黄色ブドウ球菌を含む水溶液と接触させ, 通常その水溶液 1mL 中に含まれる生菌数を, 普通寒天培地など市販されている培地等で 310 K (37 C) で 86.4 ks(4 h) 培養後に計測し, 試験片と接触させなかった対照群の菌液中の菌数との有意差を検定し評価する. しかし, この方法では菌液を調整し, コロニーをカウントすることで, 労力がかかるため検査費用も高額となる欠点がある. そこで, 著者らは, この欠点を克服するため, 従来の大腸菌の代わりに, サルモネラ菌の硫化水素 (H S) 産生能を利用する方法を考案した. 食中毒の原因菌の一種であるサルモネラ菌の特徴として, J-STAGE Advance Publication date : January 15, 016

2 166 日本金属学会誌 (016) 第 80 巻 増殖する過程において,H S の産生が顕著なことが挙げられる. サルモネラ菌から産生された H S は菌の培養培地に鉄 (Fe) 源が含まれていると, それと反応して黒色の硫化鉄 (FeS) を形成する. したがって, クエン酸鉄などの鉄 (Fe) 源を含む寒天培地では, サルモネラ菌が産生した H S により FeS が形成されることで培地が黒色に変化するため, 目視による判定が可能となる.FeS は, 弱酸性で形成されるが, 強酸や強アルカリでは解離する 5). この性質を利用すれば, 菌数を数え, 有意差を求めなくても, サルモネラ菌などの H S 産生菌を培養し, 黒色の FeS 形成の有無のみによる抗菌性の判定が可能となるため, 抗菌性判定への費用および労力を低減することが期待される. 以上より, 本研究では, サルモネラ菌の H S 産生能を利用して銅イオンの抗菌性を評価し, 新たな抗菌性評価法の可能性について検討した. 本法の有効性を評価するため, 薬剤感受性試験の現行法である Kirby Bauer 法 6) を対照として用いることにした.JIS の抗菌性評価法 (JIS Z ) ) は, 大腸菌または黄色ブドウ球菌のみを用いることと規定されている. そのため使用菌株の規定のない Kirby Bauer 法を対照として使用することで, サルモネラ菌を被検菌として用いることができ, 同じ被検菌による直接的な比較が可能となるからである.. 実験方法.1 使用菌株および培地使用菌株として, 多量の H S を産生する非チフス性サルモネラ菌株 (Salmonella enterica subsp.) 血清型 Virchow 7) を用いた. 培地には,Desoxycholate hydrogen sulfide lactose (DHL) 培地 ( 栄研化学 ) を使用した. 本培地は, 滅菌不要なので精製水 00 ml に対して 1.7 g を溶解した. 本培地の特徴は, 鉄源としてクエン酸鉄 (C 6 H 5 FeO 7 ), 硫黄源としてチオ硫酸ナトリウム (Na O 3 S ) が含まれていることである. すなわち, この培地中では, サルモネラ菌の代謝により, 硫黄源から取り込まれた硫黄が H S となって産生され, それが培地中の鉄源に含まれる鉄と反応することにより黒色の FeS が形成される. 本法では, この現象を利用し, 培地の色の変化で菌を検出する. 同培地粉末 63 g を 373 K に保持した 1000 ml の蒸留水に溶解後,0 ml ずつを直径 80 mm のペトリ皿に分注し, 室温で固化させた. さらに, 比較として, 現行の薬剤感受性試験である Kirby Bauer 法に用いられているミュラーヒントン培地粉末 ( 栄研化学 )38 g を 373 K に保持した 500 ml の蒸留水に溶解後,394 K で 1. ks 間高温高圧滅菌し, 直径 80 mm のペトリ皿に 0 ml ずつ分注し室温で固化させた.. 抗菌性評価の対象とする金属本研究では, 抗菌性の有無を定性的および定量的に検査する対象物質として, 銅イオンおよびアルミニウムイオン水溶液を採用した. それらの詳細は, 次のようである. 定性試験 抗菌性を示す銅イオンの化合物である塩化第 銅 水和物 (copper ( ) chloride dehydrate: CuCl H O) 1gを100 ml の蒸留水に溶解し 1 溶液とした. 一方, 抗菌性を示さないアルミニウムイオンの化合物である塩化アルミニウム (AlCl 3 )1gを100 ml の蒸留水に溶解し 1 溶液とし, 対照とした. 定量試験 銅イオンの抗菌性を定量するために,10 ml の蒸留水に 7gのCuCl H O を溶解した水容液 ( ほぼ飽和溶液 ) を原液とし, 順次 倍希釈していき , 1.367,.734, 5.469, 10.94, 1.88, 43.75, 87.50, 175.0, 350.0, mg/ml の水溶液を用意した..3 嫌気条件での培養方法嫌気状態の確立は,394 K で 1. ks 間高温高圧滅菌したポリエチレンテレフタレート (PET) 製 OHP シート ( 透明プラスチック ) を用いた. この透明プラスチックを面積 0 mm 0 mm で厚さ 0. mm および面積 50 mm 50 mm で厚さ 0. mm の サイズの正方形に切断後, その切片を培地表面に密着させて, 空気を遮断することにより, 嫌気状態を確立した..4 抗菌性の定性および定量実験手順抗菌性の定性および定量実験手順を次の から へと順を追って示す. 嫌気条件下におけるサルモネラ菌培養 サルモネラ菌をニクロム耳にて DHL 培地に接種し,310 K で 86.4 ks 間培養しサルモネラ菌の単独コロニーを形成させた. 得られたサルモネラ菌の単独コロニーを綿棒の先に付着させ,DHL 培地上に全面塗布し,0 mm 0 mm 0. mm の正方形透明プラスチック片で覆い, 同培地表面を嫌気状態にして, 310 K で 86.4 ks 間培養したものをコントロールとした. 定性実験 銅イオンとアルミニウムイオンとの抗菌性の差を確認するため,1 CuCl 水溶液および 1 AlCl 3 水溶液に 0 mm 0 mm 0. mm の正方形透明プラスチック片を浸潤し, 乾燥させた. 乾燥後, サルモネラ菌を全面接種した DHL 培地表面に透明プラスチック片を密着させ嫌気状態にし,310 K で 86.4 ks 間培養した. 定量実験 サルモネラ菌を全面塗布した DHL 培地の中心に, mg/ml から mg/ml までの各濃度まで希釈した CuCl 水溶液を 5 ml ずつ滴下し, 滴下場所を 50 mm 50 mm 0. mm の正方形の透明プラスチック片で覆い嫌気状態にして,310 K で 86.4 ks 間培養した. 比較 対照として以下の要領で Kirby Bauer 法を用いた 8). 上記の各濃度まで希釈した CuCl 水溶液を 5 ml ずつディスク ( 東洋ろ紙, 枝肉の抗菌物質検査用 10 mm) に滴下し, 浸潤後, 同ディスクをサルモネラ菌が全面接種されたミュラーヒントン培地の上に置いて 310 K で 86.4 ks 間培養した.Kirby Bauer 法では培地表面における嫌気条件は不要でプラスチック片は用いない. 抗菌性の判定および評価 サルモネラ菌を培養した DHL 培地は, 嫌気状態にした部分が FeS の形成により黒色変化するが, 抗菌性の金属イオンを含む水溶液を滴下した場所は,H S が産生されないため黒色変化しない. この黒色

3 第 3 号サルモネラ菌の硫化水素産生能を用いた銅の抗菌性評価 167 変化しない部分は, 滴下された金属イオン水溶液が DHL 培地中を放射上に拡散するため, 円あるいは楕円形状となる. 本法では, この円または楕円の面積を測定し, その大きさで抗菌性の強さを評価した. 一方, ミュラーヒントン培地を用いた現行法の場合は, 培養後, ディスクの周りに菌が発育しない阻止円が形成される. そこで, この阻止円の大きさ, その直径を測定した ( 現行法 )..5 金属素材の抗菌検査への応用アルミニウムからなる 1 円硬貨, 銅とスズとの合金である青銅からなる 10 円硬貨, 銅と亜鉛との合金である真鍮からなる 5 円硬貨, ニッケルと銅との合金からなる 50,100 および 500 円硬貨をサルモネラ菌が全面塗布された DHL 培地上に配置した. 対照として, 無処理の 0 mm 0 mm 0. mm の透明プラスチック片を用いた. その後 310 K で 86.4 ks 間培養し, 培養後に硬貨を取り除き硬貨下の培地色の変化を比較した. 3. 結果および考察 3.1 サルモネラ菌の硫化鉄形成に及ぼす嫌気条件の影響 Fig. 1 に, サルモネラ菌を全面塗布後, 透明プラスチック片で覆い 310 K で 86.4 ks 培養後の DHL 培地を示す. サルモネラ菌は, 透明プラスチック片で覆われた嫌気条件下では, 黒色を呈することで鑑別される. 一般に, 非チフス性サルモネラ菌の特徴は, 培地に含まれるチオ硫酸などの硫黄源を利用して多量の H S を産生することにある 5). サルモネラ菌が産生した H S が DHL 培地等に存在するクエン酸鉄 ( ) と反応して FeS を形成し, 黒色変化を呈することでサルモネラ菌の活発な増殖を判断することができる. したがって, 透明プラスチック片素材自体には抗菌性はなく, サルモネラ菌がその下部で活発に増殖したと判定できる. ただし, 透明プラスチック片で覆わない部分ではサルモネラ菌は増殖しているが, 黒色は認められない. これは, 好気条件下では FeS が形成されても, 大気中からの酸素の供給により再び FeS が酸化されるために, 黒色は消滅するからであると考えられる. 一方, 透明プラスチック片に覆われた嫌気条件下で顕著な FeS の形成を認めたのは, 透明プラスチック片により大気中からの酸素の供給が遮断されるため H S によって形成された FeS が再び酸化されないことが原因であると考えられる. 3. 銅イオンとアルミニウムイオンの抗菌性 Fig. に, サルモネラ菌を接種後, 銅イオンおよびアルミニウムイオンが付着した透明プラスチック片で覆い嫌気状態にし,310 K で 86.4 ks 培養後の DHL 培地を示す. アルミニウムイオンが付着した透明プラスチック片の下では黒色変化が認められるが, 銅イオンが付着した透明プラスチック片の下では, 黒色変化が認められない. これらの色の変化は, アルミニウムイオン存在下では, サルモネラ菌の H S 産生が阻害されないため FeS が形成されるが, 銅イオン存在下では, サルモネラ菌の H S 産生が阻害されるため FeS が形成されないことを示しており, 銅イオンは抗菌性を有するが, アルミニウムイオンは銅イオンのような抗菌性を有していないことが示唆される. したがって, 銅は抗菌性を示し, アルミニウムは抗菌性を示さないことはすでに周知の事実 1 3) であるが, サルモネラ菌の H S 産生で形成される FeS の有無で抗菌性を判定できることが本研究で初めて明らかとなった. 3.3 銅イオンの抗菌性の定量と現行法との比較 Fig. 3 に本法 ( 上段 ) による銅イオンのサルモネラ菌に対する抗菌性試験結果を薬剤感受性試験の現行法である Kirby Bauer 法 ( 下段 ) による試験結果とともに示す. ミュラーヒントン培地を用いた現行法では, 抗菌性を有する銅イオンが 4.37 mg 以上で, 菌の増殖率が 0 となる発育阻止円が認められる. 一方,DHL 培地を用いた本法の場合,FeS が形成されない無色の円または楕円 ( 本法では, これが現行法における発育阻止円に該当 ) が mg 以上で認められる. 以下, 本法において, 透明プラスチック片下で黒色の FeS が Fig. 1 Iron sulfide formation by hydrogen sulfide produced by Salmonella under anaerobic conditions. Fig. Effects of copper chloride and aluminum chloride on FeS formation by Salmonella.

4 168 日 本 金 属 学 会 誌(016) 第 80 巻 Fig. 3 Comparison of sensitivity of New method with Kieby Bauer method under CuCl treatment. Upper: New method with DHL medium, Lower: Kirby Bauer method with Mueller Hinton medium. 形成されなかった部分を新ハローとし 現行法で認められる 発育阻止円を旧ハローと記す 新ハローの大きさは 銅イオ ン濃度と比例して増加している 透明プラスチック片で覆わ れた新ハローの外側は FeS 形成を示す黒色を呈し 透明 プラスチック片で覆われなかった部分では黒色変化が認めら れない 新ハローの形成される限界量は 前述のように本法のほう が mg と低く 現行法の 4.37 mg と比較した際に 概 ね 1 / 19 であることがわかる したがって 定量的に本法 と現行法を比較した結果から 本法は HS 産生能を指標 とした菌に対する抗菌性の有無を高感度で判定することが可 能であるといえる 現行法でハローが形成されている場合で は ろ紙の下では菌は死滅している ただし 目視してもろ 紙の下は 菌が増殖しているかいないのか判別不能である しかしながら 新ハローは FeS が形成され黒色を呈する Fig. 4 Comparison of formed inhibition Zone between New method and Kirby Bauer method. : New method, : Kirby Bauer method. 部分と形成されない部分とで白黒の色調対比が顕著なため 現行法で形成される旧ハローよりも目視により明瞭に判定で きる Fig. 4 に Fig. 3 に示した各銅イオン濃度における新 たがって サルモネラの硫化水素産生能が銅イオンの影響で ハローおよび旧ハロー(円または楕円)の面積( mm )を示 低下しただけで菌が死んだわけではないと考えられる した す 本法と現行法の違いは新旧ハローの大きさにも表れてお がって HS 産生による FeS 形成の消滅は サルモネラ菌 り 新ハローの面積は旧ハローと比較すると 3 10 倍程度 の増殖率の低下を反映していると考えられる 大きいことがわかる 3.4 本法の優位性 物質の抗菌性を調べる際に 現行法では 普通寒天培地や ミュラーヒントン培地など 硫黄源や鉄源を含まない培地を 用いる そのため 菌の HS 産生および FeS 形成を確認す 過去に我々は 培地の塩分濃度が上がると サルモネラは ることは不可能である 現行法で菌の増殖阻害の有無を判定 増殖しても硫化水素産生が阻止される事実を解明した9) し するためには 増殖率が 0 となった旧ハローの形成を目視

5 第 3 号サルモネラ菌の硫化水素産生能を用いた銅の抗菌性評価 169 することが必要である. 旧ハローが初めて形成される銅イオンなど抗菌物質の最小濃度は, 最小発育阻止濃度 (MIC) と呼ばれ,H S の産生を阻害する最小濃度よりも高濃度であることが, 本研究より明らかとなった. さらに, 本法では, 培地に硫黄源であるチオ硫酸と鉄源であるクエン酸鉄を含むため, 銅イオンによる発育阻害の影響を FeS 形成能を利用した新ハローの出現により高感度に判定できる. したがって, 本法を用いれば, 現行法における抗菌性の指標とされる MIC よりも高感度であり, 菌に対する増殖阻害効果を明瞭に確認することが可能であるといえる. 3.5 硬貨を用いた金属の抗菌性試験の応用 Fig. 5 に本法による日本円硬貨の抗菌性評価結果を示す. 硬貨は寒天に密着しており, 硬貨のすき間からの空気の侵入は不可能である. コントロールの透明プラスチック片 (PET) と 1 円硬貨の下には FeS の形成による黒色変化が認められるが, それ以外の硬貨では黒色変化が認められない.1 円硬貨以外でも黒くなっているように見える個所は, 金属の錆の色によるものである. この結果は,1 円硬貨を構成するアルミニウムは抗菌性を有さず, それ以外の銅を含む硬貨は抗菌性を有することを示唆している. このように, 本法では, 対象物を培地に載せて一定時間培養し, 培地との接触面下に現れる黒色の FeS 形成で簡単に抗菌性の有無を判定できるため, 費用および労力の軽減が期待される. 本研究では, サルモネラ菌による FeS の形成を目視するために, 既存の DHL 培地を用いたが, さらに検出感度の優れた培地の開発 改良も可能であると考える. 本法では, 大腸菌ではなく, サルモネラ菌を指標菌として用いることによって現行法よりも簡便かつ高感度な抗菌性評価法を提案した. 本研究で用いた銅イオンは, ペニシリンなどの抗生物質やその他有機抗菌材と比較して保存中に品質の劣化 ( 力価の低下 ) が考えられず, 現在では過去に議論された人体への毒性も否定されており 10), 安全性の面からも広く研究に用いるのに適している. 本研究で提案する抗菌性評価法は, 銅だ けでなく, 他の金属や数多く存在する抗菌性を有する素材に応用することが可能であると考えられる. 現行法では見過ごされてきた抗菌物質がより感度の高い本法によって新たに見つかる可能性も示唆される. 具体的には, 食器, 洗浄剤, 抗生物質などの抗菌性を求められている多くの製品や試薬に応用可能であると考えられるが, これらの応用については今後の研究課題としたい. 4. 結言サルモネラ菌の H S 産生による FeS 形成を利用した新しい抗菌性評価法を開発し, 銅の抗菌性を実証した. さらに, 本法と現行の薬剤感受性試験法である Kirby Bauer 法とを比較し, 以下の結論を得た. 硫黄源と鉄源とを含む DHL 培地にサルモネラ菌を全面塗抹接種し, その上に透明プラスチック片を被せることで嫌気状態を形成した後,310 K(37 C) で 86.4 ks(4 h) 培養すると, 嫌気状態の部分においてサルモネラ菌が産生する H S と DHL 培地に含まれる Fe とが反応して FeS が形成され黒色変化を呈する. 銅を抗菌物質, アルミニウムを非抗菌物質のモデルとして用いた結果, アルミニウムイオンが付着した透明プラスチック片を被せた場合は黒色を呈するが, 銅イオンが付着した透明プラスチック片下では黒色を呈さないため, 銅の抗菌性を目視で判定できる. 銅イオンの濃度勾配を付けた条件下でサルモネラ菌を培養すると, 銅を滴下した部分を中心に発育阻止円が形成され, その面積は銅イオン濃度に比例して増加する. 本法と現行の Kirby Bauer 法とを比較したところ, 本法は, 現行法に比べて 19 倍も高い感度の抗菌性評価が可能であることが示唆される. 本法と現行法との違いは形成された発育阻止円の大きさにも表れ, 本法における発育阻止円は現行法におけるそれと比較して 3~10 倍程度大きい. サルモネラを全面塗布した DHL 培地上に日本で流通している硬貨を置いて培養した結果,1 円硬貨の直下のみ FeS 形成による黒色変化が認められ, 他の硬貨では認めら Fig. 5 Effects of coins on Salmonella growth. (\ 1: one yen coin, \ 5: 5 yen coin, \ 10: 10 yen coin, \ 50: 50 yen coin, \ 100: 100 yen coin, \ 500: 500 yen coin, PET: Plastic)

6 170 日本金属学会誌 (016) 第 80 巻 れなかった.1 円以外の硬貨はすべて銅を含んでいることから,1 円以外の硬貨はすべて抗菌性があると判断される. 本研究で提案するサルモネラ菌の FeS 形成能を指標とした高感度で簡便な新しい抗菌評価法の開発により, これを応用したさらに新しい抗菌検査法開発の道が開けると考えられる. 本研究は, 東北大学金属材料研究所における共同研究 ( 課題番号 14K0005, 15K0018) および,JSPS 科研費 15K00894 により実施されており, 感謝の意を表す. 文献 1) H. E. Mäuller: Zentralb lbakteriol Mikrobiol Hyg B. 18(1985) ) R.Shrestha,D.R.Joshi,J.GopaliandSujanPiya:NepalJ. Science and Technology. 10(009) ) C. Dhabuwala: J. Sex Med. 7(010) ) Antimicrobial products Test for antimicrobial activity and efficacy. JIS Z801, (000). 5) L. Stoffels, M. Krehenbrink, B. C. Berks and G. Unden: J. Bac. 194 (01) ) A. W. Bauer, D. M. Perry and W. M. M. Kirby: Arch. Int. Med. 104(1959) ) M. Weinbergera, H. Solnik Isaacb, D. Shacharb, A. Reisfeldc, L.Valinskyc,N.Andornc,V.Agmonc,R.Yishaic,R.Bassald, A. Frasere, S. Yaronb and D. Cohend: Clinical Microbiology and Infection. 1(006) ) W.L.Drew,A.L.Barry,R.O.TooleandJ.C.Sherris:Appl. Microbio. 4(197) ) Y. Midorikawa, S. Nakamura, R. Phetsouvanh and K. Midorikawa:OpenJ.Med.Microbiol.4(014) ) S. S. Percival and E. D. Harris: American J. Physiol. Cell Physiol. 58(1990)

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