使いこなそう！CLC Genomics Workbench パート１ QCからトリミング

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ゆうりゅうみつだ
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1 解析の詳細宮本真理 Ph.D. シニアフィールドバイオインフォマティクスサイエンティスト CLCバイオジャパン 1

2 はじめに今日のセミナーでお話しすることデータ解析の流れ内部でのデータ処理の流れとその原理今日のセミナーでお話ししないこと詳細な使い方はお話ししませんがデモにてどのように実行可能かお話ししますパラメータについては必要な個所はスライドに含めています 2

3 データフォーマットとクオリティクオリティトリミング Duplicate Removal マッピングローカルリアライメント変異検出変異検出解析例 De Novoアセンブリ 3

4 解析の流れデータ準備インポートクオリティチェックマッピング PCR Duplicate 除去マッピング関連ローカルリアライメント変異検出変異検出とアノテーションアノテーション付けフィルタリング 4

5 5 データインポート

6 データインポート次世代シーケンサー解析には主につの情報を使うためインポートが必要ですリード配列参照配列 ( ゲノムやコンティグ ) アノテーションファイル 6

7 データフォーマット : リード配列 AATTACATGACTCCAGTACCCAACCTCCACTTACCATTTATTGTCTCTGTCTACCCTGCCCAATGTCTCCCAGAAA + TAGACAGAGACAATAAATGGTAAGTGGAGGTTGGGTACTGGAGTCATGTAATTGAATCTGAAGGGAGAAGCTGCTA + ACAGAGACAATAAATGGTAAGGGGAGGTTGGGCACTGGCGTCATGTAATTGAATCTGAAGGGAGAAGCTGCTACAG + ;;)95;5;2;;60;;;8+;02-;;3;;68;76&)614,)4'4)2411,0/4112$40/&/&4/0+/,&/1))++'- 7

データフォーマット : リード配列 @S1_89:1:1:672:654/1 AATTACATGACTCCAGTACCCAACCTCCACTTACCATTTATTGTCTCTGTCTACCCTGCCCAATGTCTCCCAGAAA + BBBBBCCBBCBBBBBB@CBBBCBBB<BBBBBBBABBABBBAAB@BABA>>AB@??=<>?<AA@@A>@@@@?

8 データフォーマット : AATTACATGACTCCAGTACCCAACCTCCACTTACCATTTATTGTCTCTGTCTACCCTGCCCAATGTCTCCCAGAAA + TAGACAGAGACAATAAATGGTAAGTGGAGGTTGGGTACTGGAGTCATGTAATTGAATCTGAAGGGAGAAGCTGCTA + ACAGAGACAATAAATGGTAAGGGGAGGTTGGGCACTGGCGTCATGTAATTGAATCTGAAGGGAGAAGCTGCTACAG + ;;)95;5;2;;60;;;8+;02-;;3;;68;76&)614,)4'4)2411,0/4112$40/&/&4/0+/,&/1))++'- 8 行目 : リードの行目 : 配列行目 :+ 行目 : クオリティスコア

9 データフォーマット : リード配列クオリティスコアシーケンサーにて読まれたリードの塩基ごとのクオリティを示す値ファイルでは記号にて表記されているへインポートされたデータはすべてフォーマットのクオリティスコアへ変換されるリードの各塩基がエラーである確率をとするとのクオリティスコアは以下 9 Q Sanger = 10 log 10 p Phred Quality Score エラー確率 Base Call の精度 10 1/10 90% 20 1/100 99% 30 1/ % 40 1/ % 50 1/ %

10 データフォーマット : リード配列その他各社シーケンサーメーカーにより提供するフォーマットが異なる場合があります例 : ライフテクノロジーズ社ファイル ( ) 10

11 データフォーマット : 参照配列 11

12 データフォーマット : アノテーション遺伝子名やその場所などを示している列からなるファイル列目 : 染色体名やコンティグ名列目 : ファイルを作成したプログラム名列目 : やなどアノテーションのタイプ列目 : アノテーションの開始ポジション列目 : アノテーションの終了ポジション列目 :0 からまでのスコアただし最後の列でを指定している場合のみそれ以外はではブラウザでのグレーの濃さを表す列目 : センス鎖かアンチセンス鎖か列目 : コーディングエクソン上にあるかどうか列目 : グループ情報はの番目の列にさらに制約を設けたもの 12

13 データフォーマット : アノテーションターゲットリシーケンスなどを行った際のターゲット情報を保存したりするために使われる変異情報を保存するために使われる 13

14 データフォーマット : その他マッピング後のデータについてマッピングの状態を含めたファイルはのバイナリ形式のファイル 14

15 データフォーマットまとめバイオインフォマティクスデータ解析では様々なフォーマットが利用されている拡張子で見たことのないものがあればとりあえずで検索フォーマットなどでおおよそ検索可能フォーマットの変換が必要になることは比較的多く発生するその時もで検索することで様々な方法を調べることが出来るので自分が出来そうなものからトライしていく 15

16 16 クオリティチェック

17 各社メーカーのクオリティとデータに見られる特性について末端へ向かってみられるクオリティの低下ホモポリマー領域でのミスコールエラーの可能性リッチな領域でのバイアスホモポリマー領域でのミスコール 17 Quail, M. a et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC genomics 13, 341 (2012).

18 各社メーカーのクオリティとデータに見られる特性について 18 Quail, M. a et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC genomics 13, 341 (2012).

19 目的別クオリティトリミングの考え方アッセンブリクオリティの低いリードは間違った作成の原因に加えグラフが多く作成されるためメモリの消費処理時間増加につながる変異検出明らかに低いを取り除く変異検出では変異の検出の際に再度フィルターを個別にかけられるため一部悪いデータが残っていてもあとでフィルタリングできることを覚えておくも間違った変異検出の原因となるための可能性がある場合は取り除いておく 19

20 クオリティチェック流れ作成インポートしたリードのクオリティがどのぐらいかその後のトリミングやの状況などを確認するためにレポートを作成の除去 ( オプション ) フラグメント作成の過程でが異常にかかってしまったものを補正トリミング ( オプション ) アダプターの除去クオリティスコアによる除去長さを指定した除去などを選択組み合わせてトリミング上記処理の後に再度を作成すると処理前と処理後でのリードのクオリティを比較でき便利です 20

21 レポート GC-content 長さの分布リードごとに含まれる GC 含有量を全体の塩基で割ったものの分布 21

22 レポート Quality distribution あいまいな塩基としてコールされたものがどのぐらいあるか Quality Score の分布 22

23 レポート Nucleotide contributions 塩基ごとのカバレッジ分布各塩基の分布 23

24 レポート Ambiguous base-content 塩基ごとに GC 含有量がどのくらいあるか塩基ごとにあいまいな塩基の分布位置 24

25 レポート塩基ごとの Quality Score の分布 25

26 レポート 26 QC レポートは数字で見ることも可能これにより具体的なリードの数や塩基数が把握できるこれらのレポートはエクスポートする際に Excel フォーマットでもエクスポート可能

27 対策プラグインにより2つのタイプのリードファイルからを除去参照配列がない場合にも利用可能おもにの前に利用される除去が可能マッピング後のファイルからを除去参照配列があることでリードの向きを考慮してを取り除くことができる 27

28 PCR が異常にかかてってしまった影響を除去するためのプラグインリードの先頭 20 塩基または 20 塩基が均一に 4 箇所一致する箇所があり残りの塩基が完全一致のアライメントスコアの 80% 以上あれば PCR Duplicate と判断しそのリードを除去プラグインのインストールが必要ですプラグインのインストールは管理者権限で行う必要があります 28 Genomics Workbench の再起動を促されるので再起動してください

29 リードの先頭塩基以上または塩基以上が均等に箇所において一致する箇所があるかつ残りの塩基がコンセンサス配列のアライメントスコアの % 以上あればと判断しそのリードを除去コンセンサス配列 29 コンセンサス配列と残りの配列においてアライメントスコアの一致が 80% 以上

30 注意点! リードのスタート地点やアライメントスコアの高い一致をもっての可能性としているためトリミング前に実施してください 30

31 31 トリミング

32 トリミングアダプター除去あらかじめ登録されているアダプターの除去新規で独自の配列を登録することも可能クオリティトリミング Quality Score を使い Quality の低い配列が連続するようになる箇所からカット正確に読めていない塩基をいくつ許容するか長さによる除去塩基数を指定して 5 末端 3 末端をカット Quality Score でカット後短くなりすぎた配列をカット 32

33 クオリティトリミング原理ではを使い累積のがある一定の値より大きいものが続いた場合にその箇所を取り除くという処理を行います具体的には以下 : を値へ変換中に設定するパラメータ ( ) と値の差を計算差の累積和を計算このとき以下の値はとする後のリード開始点は累積和がはじめて以上になった点了点は累積和が最大の点後のリード終 33

34 クオリティトリミング原理リード配列 G C C C A T G T T C G A T G C Phred score p 値 Limit - p 値 (D) (D) の累積和スタート点 : 累積和が 0 より大きくなった塩基終了点 : 累積和が最大を示す塩基 Phred score の棒グラフグラフよりある程度クオリティが高くなった場所からリードを使いクオリティが連続して悪くなっている箇所からリードをトリムしていることがわかる途中 1 塩基のみクオリティが低いような場合は必ずしもトリムされないこれはできるだけリードを長く保とうとするため

35 35 マッピング

36 マッピングマッピングとはマッピングとはシーケンサーから算出されたリード配列を参照配列 ( ゲノム ) へマッピングする手法を指します 36

37 Mapping 特徴 Suffix Array を使い参照配列をインデックス化し高速なマッピングを可能にしていますローカルアライメントグローバルアライメントによるスコア計算が可能異なるシーケンステクノロジーペアエンドシングルエンドをあわせてマッピング可能カラースペースによる配列のエラー補正も可能 37

38 マッピングの詳細インデックスファイル作成スコア計算フィルタリング 38

39 マッピングの詳細インデックスファイルの作成? インデックス Genome Read どこが似てるかな? Genome の端から端まで順番に調べていては膨大な時間がかかる 39

40 マッピングの詳細にインデックスと言う辞書の索引のようなものを作成し検索効率を上げる Genome Index Read どこが似てるかな? 40

i 1 2 3 4 5 6 7 S[i] A G T T C G $ Suffix i AGTTCG$

41 i S[i] A G T T C G $ Suffix i AGTTCG$ 1 GTTCG$ 2 TTCG$ 3 TCG$ 4 CG$ 5 G$ 6 $ 7 Sort Suffix i $ 7 AGTTCG$ 1 CG$ 5 G$ 6 GTTCG$ 2 TCG$ 4 TTCG$ 3 Suffix Array, A i A[i]

i 1 2 3 4 5 6 7 S[i] A G T T C G $ i 1 2 3 4 5 6 7 A[i] 7 1 5 6 2 4 3 1 $ A C G G T T 2

42 i S[i] A G T T C G $ i A[i] $ A C G G T T 2 G G $ T C T 3 T $ T G C 4 T C $ G 5 C G $ 6 G $ 7 $ もとの配列 S と Suffix Array, A を使って高速に検索できる

43 マッピングの詳細スコアリング最適なマップ場所をで探索リード配列 ( ) が全て一致した場合 CGTATCAATCGATTACGCTATGAATG ATCAATCGATTACGCTATGA 20 43

44 マッピングの詳細 CGTATCAATCGATTACGCTATGAATG TTCAATCGATTACGCTATGA 19 CGTATCAATCGATTACGCTATGAATG TTCAATCAATTACGCTATGA 16 CGTATCAATCGATTACGCTATGAATG TTCAATCAATTGCGCTATGC 12 44

45 マッピングの詳細フィルタリング 45 リード配列と参照配列がどの程度一致しているものを残すかを決める

46 46 ローカルリアライメント

47 マッピングのプロセスでは各リードがもっとも高いアライメントスコア ( 参照配列との一致度を示すスコア ) を示す場所にマッピングをしていますしかしながら時には近傍のリードのマッピングの状況から最も高いアライメントスコアではなくとももっともらしいマッピング結果が考えられる場合がありますたとえば上記例ではは左横にずれることで他のリードのマッピングとも一致しもっともらしいマッピングになると考えられますマッピングの段階では各々のリードのアライメントスコアのみを考えているためこのような状況が発生しますさらにこの状況で変異やの検出を行うと正しく検出できないものも発生します特にやが影響をうけると考えられています 47

48 ではこのような状況を修正するためマッピングを部分的にやり直しますこの際通常のマッピングの段階とは異なり他のリードのマッピング状況を考慮するため先ほどのマッピングは以下のように変化します先ほどのマッピングよりもこちらの方がもっともらしい結果であることが直感的に分かります 48

49 原理上図のようなリードと参照配列の組み合わせは右図のように書き下せる 49 Homer, N. & Nelson, S. F. Improved variant discovery through local re-alignment of shortread next-generation sequencing data using SRMA. Genome biology 11, R99 (2010).

50 原理グラフにして書き直しそれぞれのパスを通るリードのカバレッジを記入すると以下のようになるこのグラフを解く事では実行されている 50 Homer, N. & Nelson, S. F. Improved variant discovery through local re-alignment of shortread next-generation sequencing data using SRMA. Genome biology 11, R99 (2010).

51 Toolbox > NGS Core Tools > Local Realignment 2 種類の Local Realignments がありますさらに Guided には No force と Force の 2 種類があります Non guided Guided No force Force 51

52 マッピング後のデュプリケートの除去 52

Guided Local Realignment ガイドとなるような変異 (Insertion や Deletion) の情報をあらかじめ与えておくことでその領域の Insertion Deletion を考慮してリアライメントを行うガイドとなる変異情報がない場合 Local

53 Guided Local Realignment ガイドとなるような変異 (Insertion や Deletion) の情報をあらかじめ与えておくことでその領域の Insertion Deletion を考慮してリアライメントを行うガイドとなる変異情報がない場合 Local Realignment では少なくとも 1 本のリードが Insertion や Deletion を支持している必要があるこのような場合ガイドとなる変異情報を与えることで Insertion や Deletion を効率的に検出できるようになる Guided Local Realignment が有効な例 53

54 マッピングされた後のリードからを取り除きますマッピング後のある領域で Duplicate と考えられる配列がそれぞれ上記の数存在するとする 54 一致している塩基を起点にグラフを作成する

55 末端から見ていきマイナーな枝に属する数が指定した割合より少ない場合マージされる 55 枝をマージできなくなったところで終了 165 本のリードは 2 本になる

56 注意点! リードのスタート地点を起点として考えているためを行いリードの末端がトリムされると正しくが行われない可能性がありますクオリティの高いデータの場合末端がカットされることは非常に稀なためトリミングによる影響が出ることが考えにくくトリミング後のご利用に大きな問題は考えられません ( トリミングの設定のもよりますが ) どうしてもクオリティの低いデータで実施したい場合マッピング後マップしたリードを抜出しトリミングを行う方が安全です 56

57 57 SNV 検出

58 種類の検出方法 : クオリティと変異の見られる頻度から変異のサイトを検出以前の : 確率モデルを使い変異のサイトを検出使い分け : 変異の見られる頻度がその領域において % 以下のような場合はそれよりも多い場合はをご利用ください 58

59 Mapping 後のデータに対しを設定し許容するミスマッチや gap また Quality Score により SNP detection に含めるデータのフィルタリングを行う SNP と Call するために最低必要なカバレッジや SNP の頻度を設定する 59

: 結果 Count: クオリティのフィルターをパスしたリードの数 Coverage:

Forward/reverse: Forward/Total reads または

60 : 結果 Count: クオリティのフィルターをパスしたリードの数 Coverage: クオリティのフィルターをパスしたリードの数 Frequency: 変異が見られた頻度 Forward reads: その領域に見られた Forward リードの数 Reverse reads: その領域に見られた Reverse リードの数 Forward/reverse: Forward/Total reads または Reverse/Total reads のうち小さい方の値 Forward と Reverse が同じなら 0.5 となる Average quality: 該当する領域の平均リードクオリティ Hyper-allelic: 倍数性から考えて想定以上のアレルが観察される場合に Yes となる 60

61 詳細確率モデル ( ) を使った変異検出 Reference A? A A T T C? : Site type (ex) A/A, A/T, A/C...? 61 果与えられるリードからそのポジションのを推定と推定したが異なる場合変異として結

62 詳細 62 A B A B P(A) P(B) P(A B) ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( B P B A P A P A B P B P B A P B A P A P A B P B A P ) ( ) ( ) ( ) ( A P B P B A P A B P ベイズの定理事後確率 Posterior 事前確率 Prior 尤度 Likelihood

63 Reference A? A A T T C? : Site type (ex) A/A, A/T, A/C...? P( S R) P( R S) P( S) P( R) S :Site type R : Reads P( R S) P(S) : Error Model を使って推定 : Genome Model を使って推定 63

64 詳細がのときの大部分はになると仮定し初期の確率を以下のように設定しアルゴリズムを使ってそれぞれの確率を推定するアルゴリズム ( ) は得られたデータから推定したい現象が観察できない場合にその確率を推定する一般的な統計の手法 64 Site Type Initial Probability A/A A/C A/G A/T T/C T/G T/T G/C C/C G/G G/ A/ C/ T/

65 詳細リードに含まれるエラーを考慮するため尤度のところにエラーを考慮した確率を推定する初期値を以下のように設定しアルゴリズムにて確率を推定する Reference Reads A C G T - A C G T

66 詳細変異コールモデルとモデルにより事後確率が計算できましたこの時リファレンスと同じアレルである場合も計算されます : -> と考えますの事後確率がと計算できたとしますウィザード中のパラメータで参照配列と異なる確率を指定していますこれをとするとの確率は % 以下であるということになりますの確率が % という事は指定した閾値を満たさないためこのポジションは変異としてコールされません A 66 Reference? それぞれの事後確率 A/A = 0.15 A/T = 0.8 A/C = 0.6 A/G = etc.

67 変異コール詳細参照配列と異なる確率を % とするとが % の場合そのポジションは変異があるとされリファレンスと異なるアレル ( ) のうち最も事後確率が高いものを変異のアレルとして返します Reference A? それぞれの事後確率 A/A = 0.15 A/T = 0.8 A/C = 0.6 A/G = etc. 67

68 活用例アプリケーションノート健常デンマーク人 200 名とデンマーク人結腸癌患者の比較による癌体細胞変異の検出 68

69 健常者解析フローマッピング Local Realignment 変異検出アミノ酸置換クオリティの悪いものを除去

70 癌患者解析フローマッピング Local Realignment 変異検出体細胞変異を除くアミノ酸置換各種フィルタリング

72 72 De Novo アセンブリ

73 原理ではグラフというネットワーク理論に基づいた方法でアセンブリを実行します各リードからさらに短い長さの配列のセットを作成しグラフを作成を利用しているオープンソースの方法ではが有名ですライブラリ配列リード Word セット 73

74 原理グラフではリードを短い配列に分断し ( ) グラフを作成します ( 例 ) リード長の場合は個のができるリード AGTTGATCTTACTAGAGGAA すべてのリードに対して同様に 74 1 AGTTGATCTT 2 GTTGATCTTA 3 TTGATCTTAC 4 TGATCTTACT 5 GATCTTACTA 6 ATCTTACTAG 7 TCTTACTAGA 8 CTTACTAGAG 9 TTACTAGAGG 10 TACTAGAGGA 11 ACTAGAGGAA を作成

75 原理グラフ作成簡単な例としてで考える AACGT ACGTC CGTCA GTCAA TCAAG AACGT ACGTC CGTCA GTCAA - TCAAG AACGTCAAG AACGT ACGTC CGTCA CGTCG GTCAA TCAAG AACGT ACGTC CGTCA - GTCAA TCAAG CGTCG AACGTCAAG AACGTCG 75

76 原理 AACGT ACGTC CGTCA - GTCAA TCAAG CGTCG AACGT ACGTC CGTCA - GTCAA TCAAG - CAAGT - AAGTC CGTCG - GTCGA - TCGAG - CGAGT - GAGTC AGTCC - GTCCA このように作成される多くのグラフから様々なステップを経てより確からしい Contig を作成していく 76

77 Bubble size はホモポリマーのようなシステマティックなエラーがあるときに変更すると有効なパラメータシステマティックエラーがあると分岐が起こりそれが長くつづくバブルを形成するシステマティックエラーを含んだバブル Bubble size はどこまでの長さをバブルの可能性があるとして調べに行くかの長さを設定するパラメータ最小は 12 からで上限 5000

78 まとめ次世代シーケンサーの解析には様々なステップが経て結果が出されているそれぞれのツールに含まれるパラメータはアルゴリズムがどのように動くのかを分かると理解も深まりどのように動かせばよいか分かってくる解析手法は日進月歩で変化しているので最新情報のチェックも忘れなく 78

79 79

GWB

GWB NGS データ解析入門 Web セミナー : 変異解析編 1 NGS 変異データ解析の手順シークエンス変異検出マッピングデータの精査解釈 2 CLC Genomics Workbench 使用ツールシークエンスデータのインポート NGS data import クオリティチェック QC for Sequencing Reads Trim Reads 参照ゲノム配列へのマッピング再アライメント