学位論文執筆に関する留意事項(博士課程 乙号・甲号共通)

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1 学位論文内容の要旨 Reliable High-Throughput Method for Inhibition Assay of 8 Cytochrome P450 Isoforms Using Cocktail of Probe Substrates and Stable Isotope-Labeled Internal Standards ( カクテル基質アプローチを用いたハイスループットかつ高い信頼性の CYP 阻害評価系の構築 ) Kazumasa Kozakai 小坂井一将 Regenerative Medicine Yokohama City University Graduate School of Medicine 横浜市立大学大学院医学研究科医科学専攻臓器再生医学 ( Doctoral Supervisor:Hideki Taniguchi, Professor )

2 学位論文内容の要旨 Reliable High-Throughput Method for Inhibition Assay of 8 Cytochrome P450 Isoforms Using Cocktail of Probe Substrates and Stable Isotope-Labeled Internal Standards ( カクテル基質アプローチを用いた ハイスループットかつ高い信頼性の CYP 阻害評価系の構築 ) 1. 序論新薬開発ステージにおける候補化合物のドロップアウトや市販後に新薬が市場から撤退しており (Monahan et al., 1990; Honig et al., 1993; Desager and Horsmans, 1995; Wysowski and Bacsanyi, 1996; SoRelle, 1998, Krayenbühl et al., 1999; Sica and Gehr, 2002), その原因としてチトクローム P450 (CYP) 阻害による薬物相互作用 (DDIs) が挙げられる (Bachmann and Lewis, 2005; Wienkers and Heath, 2005; Zhou, 2008).DDIs を回避するため製薬企業では創薬初期ステージから CYP 阻害試験が実施されている.CYP 阻害様式には薬物自体 ( 親化合物 ) による直接阻害 (DI) と薬物由来の代謝物による時間依存的阻害 (TDI) の 2 つのカテゴリーがある (White, 2000).DI はその作用のほとんどが可逆的であるために, 投与された薬物自体が代謝や排泄などによって体内から消失するのに伴って阻害の影響は減弱する. 一方, 代謝物に由来する TDI は不可逆的阻害作用を有することが多く, 投与された薬物自体が体内から消失しても阻害作用が持続するため, 臨床の場では DI よりも TDI の方が重篤な副作用に繋がるケースが多い. したがって,DI と TDI を明確に区別して評価することが重要である. しかしながら, 薬物の代謝に関与している主要な CYP 分子種は, 肝臓および小腸に 8 種類 (CYP1A2,CYP2A6,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6 および CYP3A) 存在しており, さらに近年, 膨大な数の新規化学物質が合成されるようになっていることから, 従来法で DI と TDI を区別しながら各 CYP 分子種に対して個別に評価することは労力, 時間および費用の関係から非常に困難であり, より安価でスループットの高い種々の CYP 阻害評価系の構築が製薬会社の研究所で望まれている. そこで, 我々は高い信頼性を持ってハイスループットで DI と TDI を明確に評価するために,8 つの各 CYP 分子種に対する特異的なプローブ基質の溶液を一つに混合して, 一回の実験で同時にこれらの CYP 分子種の酵素活性を一斉に評価できるカクテル基質アプローチを構築し, 本アプローチのバリデーションデータを取得した.

3 2. 実験材料と方法 8 つの CYP 分子種の酵素活性同時測定系の構築 CYP1A2,CYP2A6,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6 および CYP3A に対する各特異的基質の代謝物を安定同位体で標識化した ISs を用いて, 代謝反応で生成された各基質代謝物をたった 1.5 分間で定量できる測定系を構築した. 代謝反応系の最適化 8 つの CYP 分子種に対する各プローブ基質 ( シングル基質 ) およびそれらのカクテル ( カクテル基質 ) をヒト肝ミクロゾームで代謝反応させて種々の条件検討を行うことによって, 可能な限り基質間相互作用を回避した反応条件の最適化を行った. カクテル基質アプローチによる DI 試験各 CYP 分子種に特異的な DI 剤を用いて, シングルおよびカクテル基質アプローチで DI 試験を実施し, 両アプローチで得られた IC 50 値を比較することによりバリデーションデータを取得した. カクテル基質アプローチによる TDI 試験 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 および CYP3A に対して TDI 能を有する典型的な TDI 剤を用いてシングルおよびカクテル基質アプローチで TDI 試験を実施し, 両アプローチで得られた TDI パラメータ値 (k obs, K I および k inact ) を比較することによってバリデーションデータを取得した. また TDI の簡易評価法である IC 50 シフトアプローチをシングルおよびカクテル基質を用いて実施し, 両アプローチで得られた shifted IC 50 および IC 50 値を比較することによりバリデーションデータを取得した. 3. 結果と考察我々が構築したカクテル基質アプローチは, 薬物の代謝に関与する主要な 8 つの CYP 分子種に対する各特異的基質のカクテルをヒト肝ミクロゾームと共にインキュベーションし, 生成する各基質代謝物を超高速液体クロマトグラフィー (UPLC-MS/MS) を用いて,1.5 分間の短い測定時間で, それらの CYP 活性を一斉に測定する方法である. またこの方法は,ISs として各基質代謝物の安定同位体を用いるため, マトリックスエフェクトによる定量結果の信頼性低下の回避が可能であり, 定量精度および真度はともに 20% 以下で, 日間変動も大きくない信頼性の高い迅速な測定系であった. これらのことから, 我々が構築した測定系は高い処理能力と信頼性が求められる創薬初期ステージにおいて非常に有効といえる. カクテル基質アプローチを構築するにあたって最も重要なポイントは, 基質間相互作用を可能な限り回避することである. そこで, 基質間相互作用による各 CYP 活性への影響を確認するため, すべてのシングルおよびカクテル基質を用いて各 CYP 分子種における代謝反応時間と基質代謝物の生成量の直線性を確認した. その結果, インキュベーション開始後 10 分までは全ての CYP 活性に直線性が認められ, シングル基質とカクテル基質間の各 CYP 活性値の差は 2 倍以内あった. 次に各 CYP 分子種に特異的な 8 つの DI 剤を用いて, シングルおよびカクテル基質

4 アプローチで DI 試験を実施した. カクテル基質とそれぞれのシングル基質での各 CYP 分子種の阻害曲線プロファルは類似し IC 50 値もほぼ一致した. 臨床の現場においては,DI 評価よりも TDI 評価の方が重要なので, 本評価系が TDI 評価にも活用可能か検証した.CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 および CYP3A に対して TDI 能を有する典型的な TDI 剤を用いてシングルおよびカクテル基質アプローチで TDI 試験を実施した結果, カクテル基質を用いて算出した TDI パラメータ値は, シングル基質を用いて算出した値と同程度であった. なお, 本法は TDI の簡易評価法である IC 50 シフトアプローチへの適用も可能であること示された. 本研究により我々が構築したカクテル基質アプローチは, 創薬の必須評価項目である CYP の DI および TDI 評価において, 信頼性を損ねることなく労力, 時間および費用を従来法よりも大幅に低減できる非常に有用な評価系であり, 創薬初期ステージでのスループットの高い非常に有効なツールであることが示された.

5 引用文献 Bachmann, K. A. and Lewis, J. D. (2005). Predicting inhibitory drug-drug interactions and evaluating drug interaction reports using inhibition constants. Ann. Pharmacother. 39, Desager, J. P. and Horsmans, Y. (1995). Pharmacokinetic-pharmacodynamic relationships of H1-antihistamines. Clin. Pharmacokinet. 28, Honig P. K., Wortham, D. C., Zamani, K., Conner, D. P., Mullin, J. C., and Cantilena, L. R. (1993). Terfenadine-ketoconazole interaction. Pharmacokinetic and electrocardiographic consequences. J. A. M. A. 269, Krayenbühl, J. C., Vozeh, S., Kondo-Oestreicher, M., and Dayer, P. (1999). Drug-drug interactions of new active substances: mibefradil example. Eur. Clin. Pharmacol. 55, Monahan, B. P., Ferguson, C. L., Killeavy, E. S., Lloyd, B. K., Troy, J., and Cantilena, L. R. Jr. (1990). Torsades de pointes occurring in association with terfenadine use. J. A. M. A. 264, Sica, D. A. and Gehr, T. W. (2002). Rhabdomyolysis and statin therapy: relevance to the elderly. Am. J. Geriatr. Cardiol. 11, SoRelle, R. (1998). Withdrawal of Posicor from market. Circulation 98, White, R. E. (2000). High-throughput screening in drug metabolism and pharmacokinetic support of drug discovery. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, Wienkers, L. C. and Heath, T. G. (2005). Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Disc. 4, Wysowski, D. K. and Bacsanyi, J. (1996). Cisapride and fatal arrhythmia. N. Engl. J. Med. 335, Zhou, S. F. (2008). Drugs behave as substrates, inhibitors and inducers of human cytochrome P450 3A4. Curr. Drug Metab. 9,

6 論文目録 Ⅰ 主論文 Reliable High-Throughput Method for Inhibition Assay of 8 Cytochrome P450 Isoforms Using Cocktail of Probe Substrates and Stable Isotope-Labeled Internal Standards Kozakai, K., Yamada, Y., Oshikata, M., Kawase, T., Suzuki, E., Haramaki, Y. and Taniguchi, H.: Drug Metab. Pharmacokinet. Vol.27, No.5, Page , 2012 Ⅱ 副論文 Cocktail-Substrate Approach-Based High-Throughput Assay for Evaluation of Direct and Time-Dependent Inhibition of Multiple Cytochrome P450 Isoforms Kozakai, K., Yamada, Y., Oshikata, M., Kawase, T., Suzuki, E., Haramaki, Y. and Taniguchi, H.: Drug Metab. Pharmacokinet. Vol.29, No.2, Page , 2014 Ⅲ 参考論文 1 In Vivo Evaluation of Drug-Drug Interaction via Mechanism-Based Inhibition by Macrolide Antibiotics in Cynomolgus Monkeys. Ogasawara, A., Negishi, I., Kozakai, K. and Kume, T.: Drug Metab. Dispos., Vol.37, No.11, Page , Alprazolam as an in vivo probe for studying induction of CYP3A in cynomolgus monkeys Ohtsuka, T., Yoshikawa, T., Kozakai, K., Tsuneto, Y., Uno, Y., Utoh, M., Yamazaki, H., Kume, T. : Drug Metab. Dispos., Vol.38, No.10, Page , 2010

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