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ともひろふしはら
4 years ago
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カラム充填剤を使用しない液体クロマトグラフィー従来の液体クロマトグラフ法平成年月 7 日 ( 金 ) 東京薬科大学薬学部医療薬物薬学科薬物生体分析学渋沢庸一固体カラム充填剤を使用カラムの大部分は固定相支持体固定相が非常に少ないカラムへの非可逆的吸着損失が多い

高速向流クロマトグラフィー HSCCC 有機溶媒層水層固定相が液体固定相の極性や溶媒組成カラム中の固定相 / 移動相体積比移動相または固定相固定相または移動相自在に制御できるコイルの巻き A. Multilayer ( 多重層型 ) B.

1 カラム充填剤を使用しない液体クロマトグラフィー従来の液体クロマトグラフ法平成年月 7 日 ( 金 ) 東京薬科大学薬学部医療薬物薬学科薬物生体分析学渋沢庸一固体カラム充填剤を使用カラムの大部分は固定相支持体固定相が非常に少ないカラムへの非可逆的吸着損失が多い吸着による活性の低下向流クロマトグラフィー (Counter Current Chromatography) 固体の充填剤を全く使用しない細い中空のコイル状チューブをカラムに使用多量の液体を固定相として使用できるカラムへの非可逆的吸着損失がない吸着による活性の低下が起こらない高速向流クロマトグラフィー HSCCC 有機溶媒層水層固定相が液体固定相の極性や溶媒組成カラム中の固定相 / 移動相体積比移動相または固定相固定相または移動相自在に制御できるコイルの巻き A. Multilayer ( 多重層型 ) B. Eccentric ( 偏心型 ) A B J 型向流クロマトグラフ固定相液体の保持と, 二相の動的な攪拌効果カラム :. 0 mm I.D. 0 m PTFE チューブ公転軸 C. Toroidal ( ドーナツ型 ) C 自転軸 Inlet 遠心力とスクリュー効果 utlet P 連続的な撹拌, 分離 (000 rpm) 6

茶成分の分離分析法高速向流クロマトグラフィーによる茶カテキン単量体及び重合体の分離分析分離手法茶の主要成分キサンチン誘導体類カテキン単量体類テアフラビン類酸化重合体逆相 HPLC キャヒラリー電気泳動サイス排除 HPLC 7 8 PTFE tubing coil:

% TFA = ::) 他固定相移動相回転流速 (ml/min) 下層 (aqueous LP) 上層 (organic UP) 000 rpm (CCW) UP LP waste.

Diode-Array Detector Pump 廃液廃液逆相モード分離上層 (organic UP) 下層 (aqueous LP) 000 rpm (CW).0 9 ) 試料の注入 0 発酵の度合いによる茶葉の成分比較茶葉抽出法茶葉 00 mg を CH CN : 0.

2 茶成分の分離分析法高速向流クロマトグラフィーによる茶カテキン単量体及び重合体の分離分析分離手法茶の主要成分キサンチン誘導体類カテキン単量体類テアフラビン類酸化重合体逆相 HPLC キャヒラリー電気泳動サイス排除 HPLC 7 8 PTFE tubing coil: mmid mmd 0 m, Column volume: 0 ml 二相系 : 順相モード分離 HSCCC 分析条件 L-7 Diode-Array Type-J Detector Coil-planet Centrifuge L-700 Pump (t-bme:chcn:0.% TFA = ::) 他固定相移動相回転流速 (ml/min) 下層 (aqueous LP) 上層 (organic UP) 000 rpm (CCW) UP LP waste.0 順相モード有機溶媒層水層固定相保持率 (%) 固定相体積 00 カラム体積 J-CPC HSCCC 分析システム ) 固定相をカラムに充填 J-CPC Diode-Array Detector Pump ) カラム回転 (000 rpm) + 移動相の送液 ( - 8 ml/min) Diode-Array Detector Pump 廃液廃液逆相モード分離上層 (organic UP) 下層 (aqueous LP) 000 rpm (CW).0 9 ) 試料の注入 0 発酵の度合いによる茶葉の成分比較茶葉抽出法茶葉 00 mg を CH CN : 0.% TFA (:) で抽出抽出液 00 μl に BME 0 μl 添加発酵度 0% 不発酵茶 ( 緑茶 ) ~ 70% 半発酵茶 ( ウーロン茶 ) 80% > 発酵茶 ( 紅茶 ) 高速向流クロマトグラフの惑星運動茶葉試料の HSCCC 分析条件二相溶媒系 :BME-CH CN-0.% TFA= (::) カラム : 0 m.0 mm I.D. (0 ml) 固定相 : 下層移動相 : 上層下層流速 : ml/min

C 不発酵緑茶半発酵ウーロン茶発酵紅茶茶抽出液の順相 HSCCC クロマトグラム orbance Abso ECg TFs TFs EGCg EC EGC CAF 固定相液体 (LP) 0 nm 80 nm TRs TRs LC 分離モードの改良と発展 : 三相溶媒系 HSCCC

0 0 0 60 Retention time (min) 上相が固定相なら逆相分配下相が固定相なら順相分配 n-hexane - MeAc CH CN water 混合溶媒系は混ざり合わない三相を形成する for HSCCC Hex:MeAc:ACN:water (:::)

$H H H H H Glu Rha HN H N 6 H UP MP LP Three-phase HSCCC fractionation profile & TLC profiles of the fractions Solvent system: n-hexane-meac-ch$ CN-water (:::) CHCl : MeH (0:) (0:) Coptis Rhizoma ELSD 6 nm A B C D E F G H I J K L MN UP mobile MP mobile LP mobile phase Phellodendron Bark nm A

CN-water (:::) CHCl : MeH (0:) (0:) Coptis Rhizoma ELSD 6 nm A B C D E F G H I J K L MN UP mobile MP mobile LP mobile phase Phellodendron Bark nm A

3 C 不発酵緑茶半発酵ウーロン茶発酵紅茶茶抽出液の順相 HSCCC クロマトグラム orbance Abso ECg TFs TFs EGCg EC EGC CAF 固定相液体 (LP) 0 nm 80 nm TRs TRs LC 分離モードの改良と発展 : 三相溶媒系 HSCCC 高速向流クロマトグラフィー (HSCCC) 互いに混ざり合わない二相溶媒系の一方の相を固定相, 他方の相を移動相とする液々分配クロマトグラフィー上相 ( 有機溶媒層 ) 下相 ( 水相 ) 二相溶媒ではなく三相溶媒では何ができるのか? Retention time (min) 上相が固定相なら逆相分配下相が固定相なら順相分配 n-hexane - MeAc CH CN water 混合溶媒系は混ざり合わない三相を形成する for HSCCC Hex:MeAc:ACN:water (:::) Hex-rich upper phase (UP) Intermedieate phase (IP) Aqueous lower phase (LP) 固定相溶媒 : IP + LP 移動相 ( ステップワイズで切替溶出 ): UP IP LP ELSD Intensity (mv) 疎水性極性の異なる種類の標準試料の一斉分離 H UP IP LP CH 0 H Retention Time (min) H H H H H C H H N H H H H H H H H H H H H H Glu H H H H H H H H H H H H H Glu Rha HN H N 6 H UP MP LP Three-phase HSCCC fractionation profile & TLC profiles of the fractions Solvent system: n-hexane-meac-ch CN-water (:::) CHCl : MeH (0:) (0:) Coptis Rhizoma ELSD 6 nm A B C D E F G H I J K L MN UP mobile MP mobile LP mobile phase Phellodendron Bark nm A B C D E F G H G H I J K L M N C Fr. No Cinnamon Bark A 0nm CH A 00nm A 0nm 6 Fennel (min) 7 A 80nm ELSD Retention time (min)

4 三相溶媒系はヘキサン可溶の脂溶性物質から水溶性極性物質までを一度に溶解できる三相溶媒系を用いる HSCCC では向流クロマトグラフィーによる大腸菌破砕液中の MBP 融合 Hstpの精製可溶化した物質を疎水性の大きさ順に粗分離できる試料成分の ( 質的量的 ) 疎水性分布が判る分離の間の吸着ロスが全くない ( 回収率 00%) どんなに汚い試料でもカラムは劣化しない試料前処理がいらない天然物や生体試料の直接注入と分離が可能 9 0 一般的なタンパク質分離精製法 CCC による大腸菌破砕液からの Hstp の精製沈殿法塩析有機溶媒沈殿 ph 処理水性二相分配法バッチ抽出法向流分配法カラムクロマトグラフィーアフィニティーイオン交換ゲル浸透疎水性順相逆相吸着向流クロマトグラフィー (Countercurrent chromatography; CCC) Hstp : Sirp のパラログである Hst ファミリーのつ <Sirp の NAD 依存性ヒストン脱アセチル化活性 > Sirp NAD Ac アセチル化ヒストン H または H ニコチンアミド + アセチル ADP リボース脱アセチル化ヒストン ( クロマチンの不活性化 ) at 80 nm Absorbance Amylose-resin カラムによる MBP 融合 Hstp のアフィニティークロマトグラフィー MBP-Hstp Retention time (min) 一般的な水性二相溶媒 CCC によるタンパク質分離用の新規の水性二相溶媒系の探索タンパク質 PEG 000-リン酸カリウム (KPi) 緩衝液系 PEG 8000-dextran T00 系 PEG-rich KPi buffer-rich タンパク質 PEG 8000-rich dextran T00-rich (Mw 00,000) polyethyleneglycol (PEG): (-CH CH -) n dextran 除去クロマトグラフィー塩析失活, 回収率の低下 dextran: (-C 6 H 0 -) n

5 . PEG (Mw 000~8000)-dextran T0 (Mw 0,000) 系. PEG (Mw 000~8000)-dextran T0 (Mw 0,000) 系 PEG リン酸カリウム緩衝液水性二相溶媒の調製方法 dextran 混和上層 (PEG-rich) 静置測定下層 (dextran-rich) 上層と下層の体積比上層と下層の動粘度低分子量 PEG-dextran 系水性二相溶媒二相溶媒系体積比 ( 上層 / 下層 ) 7.%PEG000-0%dextran T0.6 %PEG0-7.%dextran T0.7.%PEG000-%dextran T0.7.%PEG0-%dextran T0.7.%PEG000-%dextran %dextran T0.7 0%PEG8000-.%dextran T0.9 %PEG000-%dextran T0.6 0%PEG0-%dextran T %PEG000-%dextran T0. 7.%PEG0-0%dextran T0. 7.%PEG000-0%dextran T0. %PEG8000-.%dextran T0.0 上層動粘度 (mm /s) 下層 dextran T0 は限外ろ過膜を通過する H 希釈 ( ) 限外ろ過 0% dextran T0 溶液膜上の残留溶液限外ろ過膜 ( 限外分子量 0,000) ろ液旋光度測定法による dextran T0 の定量 ( 日本薬局方第改正 ) 0% dextran T0 溶液膜上の残留溶液ろ液旋光度 (α D ) 濃度 (g/00ml).8.0. 組換え大腸菌大量培養 CCC 用試料の調製 00 g,0min 00 kda 6 k 97 k 66 k k k 菌体破砕 Mw 上清 000 g,min Hstp MBP 上清 (lysate) 7 8 撹拌静置 PEG-rich dextran-rich 分配係数測定 lysate ( 大腸菌破砕液の可溶性画分 ) MBP 融合 Hstp ( アフィニティークロマトグラフィーによる精製画分 ) K lysate = K MBP-Hstp = 上層の吸光度 (80 nm) 下層の吸光度 (80 nm) 上層の吸光度 (80 nm) 下層の吸光度 (80 nm) 9 Partition co oefficient (K) % PEG 0-0% dextran T0-0 mm リン酸カリウム緩衝液系における分配係数 ph 9 lysate MBP-Hstp 0 0

ポンプ交差軸型向流クロマトグラフ検出器ポンプ交差軸型向流クロマトグラフ検出器カラムホルダー自転固定相

0) 大腸菌破砕液中の Hstp の CCC 分離 NAD 依存性ヒストン脱アセチル化酵素活性測定 at 80 nm

k 66 k k k MBP-Hstp MBP Hstp 0% SDS-PAGE Hstp NAD アセチル化ペプチド

I.S. 0 min 0 min 脱アセチル化物 retention time (min).

6 ポンプ交差軸型向流クロマトグラフ検出器ポンプ交差軸型向流クロマトグラフ検出器カラムホルダー自転固定相公転移動相二相溶媒系 :7% PEG 0-0% dextran T0-0 mm KPi (ph 9.0) 大腸菌破砕液中の Hstp の CCC 分離 NAD 依存性ヒストン脱アセチル化酵素活性測定 at 80 nm Absorbance a Fraction number 00 kda 6 k 97 k 66 k k k MBP-Hstp MBP Hstp 0% SDS-PAGE Hstp NAD アセチル化ペプチド incubation at 7,0 min reverse-phase HPLC analysis アセチル化ペプチド I.S. 0 min 0 min 脱アセチル化物 retention time (min). タンパク質を塩析させることなく,CCC 精製後限外ろ過で容易にタンパク質画分から除去できる比較的低分子量の PEG-dextran の水性二相溶媒を見つけることができた.. 大腸菌破砕液中の MBP 融合 Hstp は, PEG0-dextran T0 の二相溶媒を用いた CCC により, 融合タンパク質が切断を受け,Hstp 単独で, 活性を保持したまま一段階で精製することができた. 6

Microsoft PowerPoint - 薬学会2009新技術2シラノール基.ppt

Microsoft PowerPoint - 薬学会2009新技術2シラノール基.ppt シラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因いや違う! クロマニックテクノロジーズ長江徳和日本薬学会 9 年会緒言緒言逆相型固定相中の残存シラノール基は, 吸着やピークテーリング等の原因であるとされている残存シラノール基に基づく主な相互作用は, 吸着, イオン交換, 水素結合であるこれらの二次効果相互作用を積極的に利用することで, 極性化合物に対して特異的な保持を示す新規な逆相固定相の創出が可能であると思われる