Mouse IFN gamma EIA Kit

研究用 Mouse IFN gamma EIA Kit 説明書 v201402

I. 製品概要 インターフェロン γ(ifn gamma IFN-γ) は主に抗原 分裂促進因子 または同種抗原によって活性化された T 細胞や NK 細胞 CD4 CD8 陽性リンパ球により産生されるサイトカインです 分裂促進因子または成長因子として T リンパ球をはじめとする様々な細胞の活性化や増殖 分化に関与し また抗原提示細胞の MHC 発現を増強する作用等も有しており 免疫応答や炎症応答で重要な役割を果たすことが知られています 本製品は 2 種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチタイプの EIA 法 ( 酵素免疫測定法 ) により 血清 血漿及び細胞培養上清中のマウス IFN gamma を定量するキットです プレートにあらかじめ抗体を固定化したプレコートタイプで 簡便な操作で再現性も向上します アビジン ビオチンシステムを利用しており 約 3 時間で 容易に未知濃度かつ多検体の高感度測定を行うことができます II. 測定原理 酵素免疫測定法による抗原検出の原理を以下に示します この測定にはマウス IFN gamma に対する特異抗体をコーティング済みの 96 ウェルプレートを使用します まず標準液および検体を各ウェルに加え 固相化された抗体と検体中のマウス IFN gamma を結合させます 次に各ウェルの洗浄を行った後 ビオチン標識した抗マウス IFN gamma 抗体を反応させます 反応後 洗浄により余剰抗体を除去して HRP 標識ストレプトアビジンをウェルに加えます 再度各ウェルの洗浄を行い TMB 基質液を加えると結合した IFN gamma の濃度依存的に青色に発色します 反応停止液を加えると 色調は青から黄に変化します プレートリーダーにより 450 nm の吸光度を測定し 得られた測定値より解析を行います 2

III. キットの内容 (1)Antibody Coated Microtiterplate 1 plate 抗マウス IFN gamma 抗体コーティングプレート (96 ウェル :8 ウェル 12 strips) (2)Wash Buffer Concentrate( 20) 20 倍濃縮洗浄液 25 ml (3)Standard mouse IFN( 凍結乾燥品 ) 1 ml 用 2 組換えマウス IFN gamma( 大腸菌由来 ) 8 ng (4)Assay Diluent A 検体希釈液 ( 血清または血漿用 ) 防腐剤として 0.09% アジ化ナトリウムを含む (5)Assay Diluent B( 5) 検体 ( 培養上清用 ) および試薬調製用希釈液 30 ml 15 ml (6)Detection Antibody mouse IFN( 凍結乾燥品 ) 0.1 ml 用 2 ビオチン標識抗マウス IFN gamma 抗体 (7)HRP-Streptavidin Concentrate HRP 標識ストレプトアビジン濃縮液 (8)Substrate Solution(TMBZ) 3,3,5,5 - テトラメチルベンジジン溶液 (9)Stop Solution without Sulfuric Acid 反応停止液 ( 硫酸不含 ) 0.2 ml 12 ml 12 ml IV. キット以外に必要な試薬及び器具 ( 主なもの ) マイクロプレートリーダー (450 nm の吸光度測定が可能な機器 ) マイクロピペットおよびチップ マルチチャンネルピペット プレート洗浄装置 Personal Microplate Washer( 製品コード MK950) が便利です ELISA 工程をオートメーション装置で実施する際 洗浄液 (Wash Buffer) が不足する場合は Wash and Stop Solution for ELISA without Sulfuric Acid( 製品コード MK021) を用いて 0.1% Tween 20/PBS を調製してご使用ください プレートミキサー 必要に応じて 空調式恒温槽 (20 ~ 30 ) 1 ~ 25 ml のピペット ( 試薬調製用 ) 100 ml と 1 L のメスシリンダー ペーパータオル 蒸留水 ELISA データ解析ソフト 両対数グラフ用紙等 検体希釈および標準液調製用チューブ V. 保存 本製品は ー 20 以下で輸送されます 解凍しない場合は 外箱ラベルに記載の有効期限まで - 20 で保存可能です 凍結融解の繰り返しは避けてください いったん解凍した場合は 2 ~ 8 で約 6 か月保存可能です 開封後のマイクロプレートや試薬類は 2 ~ 8 で約 1 ヵ月の保存が可能 未使用のマイクロプレートのウェルは乾燥剤入りのパウチに戻し 密封する 3

VI. 使用目的 血清 血漿および細胞培養上清中のマウス IFN gamma 量の測定 VII. 準備 全ての試薬および検体は使用前に室温 (20 ~ 30 ) に戻す 1. 試薬の調製 抗体プレート[(1)Antibody Coated Microtiterplate] 使用前に室温に戻してから開封する 洗浄液 25 ml の (2)Wash Buffer Concentrate( 20) を 475 ml の蒸留水で希釈してよく混和し 洗浄液とする 万一 析出物が認められた場合 室温まで温めて緩やかに混和して結晶を溶解してください ELISA 工程をオートメーション装置で実施する際 洗浄液が不足する場合があります その際には Wash and Stop Solution for ELISA without Sulfuric Acid( 製品コード MK021) を用いて 0.1% Tween 20/PBS を調製してご使用ください Assay Diluent A( 血清 血漿検体希釈用 ) (4)Assay Diluent A をそのまま使用する 防腐剤として 0.09% アジ化ナトリウムが含まれている 血清または血漿測定の場合 標準液および検体の希釈に用いる Assay Diluent B( 細胞培養上清検体の希釈および試薬調製用 ) (5)Assay Diluent B( 5) を蒸留水で 5 倍希釈して 1 Assay Diluent B を調製する 培地または培養上清測定の場合 標準液および検体の希釈に用いる マウス IFN gamma 標準液 ( 大腸菌由来 ) (3)Standard mouse IFN のバイアルを軽くスピンダウンしてから開封する Assay Diluent A または 1 Assay Diluent B( 検体の希釈と同じ種類の希釈液の使用を推奨 ) のいずれか 1 ml をバイアルに加え 粉末が完全に溶解するまで丁寧に混和して マウス IFN gamma 8 ng/ml の標準液を調製する ( 復元した Standard mouse IFN は - 20 以下で保存可能 :- 80 推奨 ) VII-3. に従って 標準液の希釈系列を調製する ビオチン標識抗マウス IFN gamma 抗体 [(6)Detection Antibody mouse IFN] 内部の凍結乾燥物が蓋側についている場合があるので かならずバイアルを軽くスピンダウンしてから開封する 1 Assay Diluent B 100 μl をバイアルに加えてピペッティングで丁寧に混和し ビオチン標識抗マウス IFN gamma 濃縮液を調製する ( 調製後 4 で 5 日間は保存可能 ) 使用時に 1 Assay Diluent B で 120 倍に希釈して使用する 1 本のバイアルに 48 ウェル分の測定に十分な量が含まれる (2 本添付 ) 4

HRP 標識ストレプトアビジン [(7)HRP-Streptavidin Concentrate] バイアルを軽くスピンダウンしてから開封する HRP 標識ストレプトアビジン濃縮液を 1 Assay Diluent B で 300 倍に希釈して使用する 調製例 : スピンダウンして開封する HRP 標識ストレプトアビジン濃縮液をピペットで丁寧に混和する 1 Plate 分として 40 μl を量りとり 1 Assay Diluent B 12 ml とよく混和して 300 倍希釈液を調製する 調製した HRP 標識ストレプトアビジンは 24 時間以内に使用する 希釈溶液は保存不可 反応停止液 [(9)Stop Solution without Sulfuric Acid] そのまま使用する 粘度の高い溶液のため 投入後プレートミキサー等で十分に撹拌してください 発色後の色素安定性に優れており 6 時間は吸光度が安定しています 2. 検体 血清または血漿検体の希釈には (4)Assay Diluent A を用いる 培養上清検体の希釈には 1 Assay Diluent B を調製して用いる 標準液の調製は検体希釈と同じ種類の希釈液を使用することで測定精度が向上する 正常血清および血漿の標準的な希釈倍率 : 2 ~ 4 倍希釈活性化刺激を与えたリンパ球細胞培養上清の測定倍率 :10 ~ 100 倍希釈 IFN gamma の発現量は検体によって異なるので 希釈率の検討を行ってください 3. 標準曲線作成のための標準液希釈系列の調製マウス IFN gamma 標準液 (8 ng/ml) の調製に用いた希釈液と同じものを用いて 原液 (8 ng/ml) の 2 倍希釈物から段階希釈を行い 標準液 (4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.063 ng/ml) を調製する 希釈ごとによく混和し ピペットチップを交換すると技術精度が向上する 上記の 7 濃度の標準液の他に 希釈液のみ (Assay Diluent A または 1 Assay Diluent B) の 0 ng/ml の標準液を 1 本準備する 5

VIII. 測定方法 使用前に試薬や検体を室温 (20 ~ 30 ) に戻す 標準液および検体の測定は少なくとも 2 重測定で行うことが望ましい 1. 各濃度の標準液および検体を 100 μl ずつ各ウェルに加える ウェルにカバーをし 室温で 1 時間静置反応させる 検体中の測定対象が極めて微量の場合や測定処理サンプル数が多い場合など 1. の反応を 4 で一晩行い 2. 以降は通常の検出工程で測定することも可能です 2. 反応液を除去して 洗浄液で 4 回洗浄する プレート洗浄装置およびマルチチャンネルピペットを使用して洗浄液 300 μl を各ウェルに加えて洗浄する 各ステップで反応液を完全に除去することが良い結果を得るために重要である 洗浄後 アスピレーター ( 吸引 ) またはデカント ( 振り落し ) で洗浄液を充分に除く さらに プレートを逆さにして ペーパータオルに何度か打ちつけて液を切る 3. 調製したビオチン標識抗体を 100 μl ずつ各ウェルに加える 室温で 1 時間静置反応させる 4. 反応液を除去して 洗浄液で 4 回洗浄する 2. と同様に行う 5. 調製した HRP 標識ストレプトアビジンを 100 μl ずつ各ウェルに加える 室温で 30 分間静置反応させる 6. 反応液を除去して 洗浄液で 4 回洗浄する 2. と同様に行う 7. Substrate Solution(TMBZ) を 100 μl ずつ各ウェルに加える 遮光 室温で 15 分間発色反応させる 8. 基質液を添加した順に反応停止液を 100 μl ずつ各ウェルに加え プレートミキサーで充分に混合撹拌する 9. プレートリーダーを用いて 450 nm で吸光度測定する 6

測定法の概略 1. 試薬を調製する 検体と標準液を調製し 配置を決める 2. 検体および標準液を 100 μl ずつ各ウェルに加える 室温で 1 時間または 4 で一晩反応させる 洗浄 3. ビオチン標識抗体を 100 μl ずつ各ウェルに加える 室温で 1 時間反応させる 洗浄 4. HRP 標識ストレプトアビジンを 100 μl ずつ各ウェルに加える 室温で 30 分反応させる 洗浄 5. TMBZ を 100 μl ずつ各ウェルに加える 室温で 15 分間反応させる 第一反応 第二反応 第三反応 6. Stop Solution を 100 μl ずつ各ウェルに加える 450 nm で吸光度を測定する IX. 定量値算出方法 両対数グラフ用紙か 専用のソフトウェアを用いて 2 重測定した標準液の濃度を X 軸に 吸光度を Y 軸にとり 標準液の結果をプロットして検量線を作成する 2 重測定したコントロールおよび検体の吸光度値をもとに検量線より検体定量値を算出する 標準液ゼロ濃度値の吸光度が 0.2 を超える場合には ゼロ濃度値の吸光度を Blank 補正として全体から差し引いて濃度換算してください 7

X. 性能 1. 標準曲線下記の標準曲線は代表的な一例である 測定ごとに標準曲線を作成してください Mouse IFN gamma(ng/ml) 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.063 0 A450 1.474 1.074 0.701 0.410 0.244 0.160 0.118 0.067 < Assay Diluent の違いによる検量線同時比較について > 検体 Assay Dilution A 濃度 (ng/ml) A450 検体 1 Assay Dilution B 濃度 (ng/ml) A450 Std 01 4.000 1.013 Std 09 4.000 1.122 Std 02 2.000 0.687 Std 10 2.000 0.762 Std 03 1.000 0.417 Std 11 1.000 0.471 Std 04 0.500 0.239 Std 12 0.500 0.274 Std 05 0.250 0.140 Std 13 0.250 0.172 Std 06 0.125 0.118 Std 14 0.125 0.135 Std 07 0.063 0.091 Std 15 0.063 0.091 Std 08 0.000 0.068 Std 16 0.000 0.059 8

2. 検出感度 マウス IFN gamma の最少検出感度 :63 pg/ml 3. 添加回収試験 マウス血清 血漿 細胞培養上清に既知量のマウス IFN gamma をスパイクして添加回収試験を行った 検体 回収率平均 (%) 範囲 (%) 血清 95.38 83 ~ 103 血漿 93.49 82 ~ 102 細胞培養上清 94.75 83 ~ 103 4. 希釈直線性 < 高濃度のマウス IFN gamma を血清にスパイクして作製したサンプルを希釈した例 > 30.000 25.000 濃度 (ng/ml) 20.000 15.000 10.000 5.000 y = 991.24x + 7.2145 R² = 0.9953 0.000 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 倍率 < 希薄なマウス IFN gamma を含む培養上清サンプルを希釈した例 > 0.300 0.250 濃度 (ng/ml) 0.200 0.150 0.100 0.050 y = 0.2497x + 0.029 R² = 0.9895 0.000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 倍率 9

5. 再現性 同時再現性 :CV < 10% 日差再現性 :CV < 12% 6. 特異性本製品は以下の組換えサイトカインと交差反応がないことを確認しています 7. 測定例 Mouse CD30 L CD30 T CD40 CRG-2 CTACK CXCL16 Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CFS IGFBP-3 IGFBP-5 IGFBP-6 IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-3 Rb IL-4 IL-5 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40/p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 KC Leptin R Leptin(OB) LIX L-Selectin Lymphotactin MCP-1 MCP-5 M-CSF MIG MIP-1α MIP-1γ MIP-2 MIP-3β MIP-3α PF-4 P-Selectin RANTES SCF SDF-1α TARC TCA-3 TECK TIMP-1 TNF-α TNF RI TNF RII TPO VCAM-1 VEGF < CD3ε 抗体で刺激したマウス脾臓細胞の IFN gamma 産生量測定の予備試験 > 使用動物及び組織 :ICR マウス 7 週齢オス 脾臓組織刺激用抗体 :Mouse CD3ε Antibody(500 μg/ml) 滅菌済み使用培地 :RPMI1640/10% FCS 含有 /1% ペニシリン ストレプトマイシン含有使用試薬 : 溶血用緩衝液 (ACK Lysing Buffer) 使用機材 :96 ウェル培養プレートガラスホモジナイザー ( もしくはステンレスメッシュ ) 方法 : 1. あらかじめ CD3ε 抗体を滅菌 PBS で 1 μg/ml に希釈し 96 ウェル培養プレートに 100 μl/well で加え 4 一晩コーティングする ブランクウェルは未処理とする 使用直前にコーティングしたウェルから抗体溶液を無菌的に除き PBS で 2 回洗浄し 培養用培地で 1 回洗浄しておく 2. 個体別マウスから摘出した脾臓を培地中でガラスホモジナイザー ( もしくはステンレスメッシュ ) を用いて細胞分散させ 遠心と洗浄を 1 回ずつ行う 3. 溶血処理を行う (37 10 分静置 ) 4. 溶血実施後の脾臓細胞に培地を加えて遠心と洗浄を 2 回ずつ行う あらためて培地 5 ml で細胞を懸濁する 5. 40 μm のポアサイズのセルストレーナーを通過させて不溶物等を除く 6. 脾臓細胞懸濁液の細胞数をカウントし 1 10 7 cells/ml に調整する 7. CD3ε 抗体をコーティングしたウェルおよびブランクウェルに 個体別脾臓細胞懸濁液を 100 μl/well で投入する 24 時間検出用と 48 時間検出用はそれぞれ用意する ( この段階で 1 ウェル中の標準細胞数は 1 10 6 cells/well ) 8. 培地を 100 μl/well で追加し 37 5% CO2 下で培養を開始する 9. 24 時間後と 48 時間後の上清を 100 μl ずつ回収し 測定まで - 80 保管する 10. 未知濃度のサンプル測定のため 個体別および採取時間別培養上清を 1 Assay Diluent B で 50 倍と 100 倍の 2 通りに希釈してサンプルとする 10

結果 : 抗体刺激培養 24 hr. 抗体刺激培養 48 hr. 無刺激培養 48 hr. No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.1 希釈率 A450 測定濃度原液換算濃度 (ng/ml) (ng/ml) 50 0.248 0.294 14.7 100 0.152 0.143 14.3 50 0.472 0.681 34.1 100 0.273 0.334 33.4 50 0.295 0.370 18.5 100 0.185 0.194 19.4 50 0.419 0.583 29.2 100 0.238 0.277 27.7 50 0.050 感度以下 感度以下 100 0.052 感度以下 感度以下 50 0.053 感度以下 感度以下 100 0.056 感度以下 感度以下 50 0.538 0.811 40.6 100 0.311 0.396 39.6 50 0.922 1.763 88.2 100 0.483 0.702 70.2 50 0.632 1.008 50.4 100 0.431 0.605 60.5 50 0.679 1.114 55.7 100 0.369 0.494 49.4 50 0.617 0.975 48.8 100 0.362 0.483 48.3 50 0.644 1.033 51.7 100 0.367 0.492 49.2 2 0.186 0.165 0.3 4 0.128 0.084 0.3 考察 : 今回の予備試験の細胞数と培養培地量の条件において 動物個体により IFN gamma の誘導される時間は異なるが 抗体刺激を与えたリンパ球上清の測定をするためには概ね 50 倍希釈でサンプル測定することができる 抗体刺激をしていないリンパ球上清については 48 時間までは 2 倍希釈での測定が適切と思われる 48 時間以降では無刺激群でも若干の IFN gamma の上昇が確認された ( データ未掲載 ) XI. 参考文献 1)Naylor SL, et al., Mouse immune interferon (IFN-gamma) gene is on chromosome 10., Somat Cell Mol Genet, 10:531-534 (1984) 2)Cooper AM, et al., Disseminated tuberculosis in interferon genedisrupted mice., Journal of Experimental Medicine, 178:2243-7 (1993) 3)Dalton DK, et al., Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes., Science, 259:1739-42 (1993) 4)Gu D and Sarvetnick N, Epithelial cell proliferation and islet neogenesis in IFN-gamma transgenic mice., Development, 118:33-46 (1993) 11

XII. 関連製品 Human IFN gamma EIA Kit( 製品コード MK153) Pig IFN gamma EIA Kit( 製品コード MK154) XIII. 注意 本製品は研究用として販売しております ヒト 動物への医療 臨床診断用には使用しないようご注意ください また 食品 化粧品 家庭用品等として使用しないでください タカラバイオの承認を得ずに製品の再販 譲渡 再販 譲渡のための改変 商用製品の製造に使用することは禁止されています ライセンスに関する最新の情報は弊社ウェブカタログをご覧ください 本説明書に記載されている会社名および商品名などは 各社の商号 または登録済みもしくは未登録の商標であり これらは各所有者に帰属します v201402