よくある LC/MS トラブルとその解決法 ~ サポートセンターのノウハウ大公開 ~ 日本ウォーターズ株式会社 JASIS 2013 新技術説明会 9 月 4 日 ( 水 ) 15:50~16:15 2013 Nihon Waters K.K. 1 本日の内容 感度に関するトラブル キャリーオーバ及びゴーストピークに関するトラブル 再現性に関するトラブル 分析に関するトラブルは 原因が MS 側に起因するのか LC 側の問題なのか それともカラムに由来するのかを見極める事が重要です カラム分離に関する問題? MS 検出器の問題? サンプル注入に関する問題? ポンプの送液の問題? 2013 Nihon Waters K.K. 2 1
感度に関するトラブル 2013 Nihon Waters K.K. 3 感度低下の原因分類と確認方法 標準品 保存中の分解 再調製 試料注入 注入正確性の低下 注入量を変えて測定 ( レスポンスの直線性を確認 ) 試料残量の低下 試料量を増やす LC/MS システムにおける分解 UV で分解 熱分解 装置構成や測定条件を変更していないかどうか LC/MS システムへの吸着 ( バイアルを含む ) バイアルやカラムへの吸着 濃度を変えて測定 ( レスポンスの直線性を確認 ) イオン化の抑制 カラムの劣化による分離能の低下 移動相の汚染 LC/MS システムの汚染 感度低下前と異なる点がないかどうか MS 内の透過量の低下 MS の汚染 感度確認用の標準試料を測定 ( システムチェック ) 2013 Nihon Waters K.K. 4 2
感度に関するトラブルフローチャート例 今までは測定可能 標準溶液の問題の可能性 分析条件は変更していない 標準溶液再調製 ( 標準溶液の原因か否か探る ) 以前の条件で再測定 ( メソッド類が原因か否か探る ) LC MS カラムなどトラブルの原因箇所の切り分け 今回 初めてメソッド開発 分析対象物質は そもそも LC/MS でイオン化するのか? 分析対象物質の構造式や化学的特性は調べたか? 分析条件の最適化 2013 Nihon Waters K.K. 5 測定条件の確認方法過去と現在のメソッドの設定 / 実測内容 感度良好時 ( 過去 ) のクロマトグラムと Experimental Record 感度低下時 ( 現在 ) のクロマトグラムと Experimental Record これらの内容を比較 ( 印刷も可能 ) 2013 Nihon Waters K.K. 6 3
見えない妨害成分によるマトリックス効果 高濃度にリン酸塩を含む試料を測定 目的成分 目的成分のクロマトグラムポジティブモード MRM リン酸イオンの SIM ネガティブモード MS スキャン 移動相 B のプロファイル (%) 2013 Nihon Waters K.K. 7 LC の洗浄方法例 参考文献 :MSメソッド開発時などのLC 洗浄方法 サポート番号 :TUTR134684447 http://www.waters.com/japan_masslynx_tips 2013 Nihon Waters K.K. 8 4
MS 洗浄方法例 Reserpine_004 100 S/N:PtP=94.73 MRM of 1 Channel ES+ 609.25 > 195 1.21e3 % 6000 回血漿検体分析後 1.21e3 0 Reserpine_005 100 S/N:PtP=2059.45 MRM of 1 Channel ES+ 609.25 > 195 1.16e5 % サンプルコーン洗浄後 1.16e5 0 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 Time P/N : 1402271 品名 : POLISHING COMPOUND (HYPREZ) 2013 Nihon Waters K.K. 9 キャリーオーバ及びゴーストピークに関するトラブル 2013 Nihon Waters K.K. 10 5
キャリーオーバ及びゴーストピークの原因分類と確認方法 キャリーオーバ 1 回以上前に注入した測定成分が その後の測定において検出されること ニードルの洗浄不足ドルの洗浄不足 注入バルブへの残留 オートサンプラーを使わずに測定 ゴーストピーク 測定成分とは異なる成分が検出され 測定上の妨害となること 移動相 移動相交換 または グラジェントの平衡化時間を変えて測定 カラム カラムを外す または カラムを交換 LC/MSシステムに由来 カラムを外す システムの洗浄 バイアルの内部 バイアルの変更 バイアル洗浄後に測定 バイアルの蓋 蓋を外して測定 2013 Nihon Waters K.K. 11 キャリーオーバとゴーストピークに関するトラブルフローチャート例 ブランクサンプルを数回連続注入してピーク強度が下がる キャリーオーバ ニードル洗浄液の種類の見直しニードル洗浄回数や量の見直し ゴーストピーク LC システム インジェクタ カラム サンプルバイアルなどゴーストピーク原因箇所の切り分け まず最初に インジェクタを動かさずに分析 (Empower- プレップ注入 MassLynx- グラジエントブランク ) MassLynx Tips 参照 ピークが検出しなかったら インジェクタ またはサンプルバイアル由来 ピークが検出したら 移動相 カラム または LC システム由来 移動相交換 及び カラム有り無しなどで何処由来かを確認 0( ゼロ ) ml 注入で通常分析を行い ピークが検出するかどうかを確認 2013 Nihon Waters K.K. 12 6
キャリーオーバ及びゴーストピークの対処方法 キャリーオーバ ニードルの汚染 o 測定成分が溶解する溶媒高極性 水の割合を増やす 低極性 有機溶媒を増やす o 酸 又は アルカリの添加 溶解度を高めるようにpHを調製 バルブへの残留 o 注入前にバルブを駆動 ゴーストピーク 移動相 o 測定ごとに調製 LC/MSグレードド ベンダーを変更 カラム LC/MS システム o MSメソッド開発時などのLC 洗浄方法 を実行 バイアルの内部及び蓋 o バイアルの変更 2013 Nihon Waters K.K. 13 バイアル選択例 2013 Nihon Waters K.K. 14 7
バイアル選択例蓋の材質と特徴 セプタムの素材 デザイン特徴 PTFE 1 回限りのインジェクションに適す 対溶媒性 対薬品性に優れる サンプルの長期保存には適さない PTFE/ シリコン 複数回インジェクションやサンプルの保存に適す 複数回の使用でも高い密閉性を維持 穴が開くまではPTFEとして 穴が開いた後はシリコンとしての対薬品性プレスリットPTFE/ シリコン サンプル吸引時の陰圧状態を防ぎ サンプル吸引量の再現性に優れる 高い密閉性を維持 複数回インジェクションに適す 穴が開くまではPTFEとして 穴が開いた後はシリコンとしての対薬品性セプタムレスPE( ポリエチレン ) 対溶媒性 対薬品性に優れる セプタム使用しないためセプタム脱落等のトラブルなし 1 回限りのインジェクションに適す 穴が開くまでは密閉状態 PFOSやPFOAなどのパーフルオロ化合物分析の際にリスクがない 2013 Nihon Waters K.K. 15 再現性に関するトラブル 2013 Nihon Waters K.K. 16 8
再現性低下の原因分類と確認方法 測定メソッド データポイント数が適切でない メソッドと生データのクロマトグラムを確認 試料注入 注入精度の低下 試料を計量するシリンジのプライムの前後で 標準溶液の連続測定結果を比較 マトリックス効果 試料由来のマトリックスがカラムに残留し 後の試料に影響 標準溶液の連続測定を 実試料の連続測定の前後で実施 MS イオン源 イオン化 ( 液滴形成と溶媒の気化 ) が不安定 ESI のキャピラリー交換の前後で 標準溶液の連続測定結果を比較 2013 Nihon Waters K.K. 17 再現性に関するトラブルフローチャート例 ピークの開始点 ~ 終了点までのデータポイント数 15 ポイントの確認済 現在のデータポイント数の確認と MS メソッドの DwellTime 調整 標準溶液の連続注入 (n=6 以上 ) で確認 日間差や挟み込み分析の再現性を問題にしているのであれば まずは標準溶液の連続注入を実施 その結果 再現性の問題は無し 装置的な問題は無し 日が変わるところで何か変化はなかったかを確認 挟み込み分析の場合は 未知試料の分析を行ったことで再現性に問題が生じたと考えられる サンプルシリンジのプライムは実施済み オートサンプラー ( サンプルシリンジ 洗浄シリンジ ニードルシール ) のリークテストを実施 サンプルシリンジのプライムを実施後 標準溶液の連続注入を再確認 イオン源 (ESI スプレー ) のメンテナンス等 日間差 または挟み込み分析の合間で カラム洗浄メソッドを入れる (InletPreRun InletPostRun) 基本的な診断パターンです 2013 Nihon Waters K.K. 18 9
測定メソッドの設定データポイント数の確認 データポイント 1 コをプロットするのに必要な時間が Dwell Time 1 つのピーク当たり 15 ポイント程度のデータポイントが理想 データポイントが足りないため 再現性悪い クロマトグラム画面 : [Display] メニュ [View] で横軸表示を [Time] から [Scan] へ クロマトグラムの横軸を [Scan] にすると データポイントを確認する事ができます マウスで右ドラッグした範囲のデータポイント数を表示しています 2013 Nihon Waters K.K. 19 試料注入の精度サンプルシリンジのプライム ( エアーの除去 ) 試料が計量される経路 FL タイプのインジェクタの流路図 2013 Nihon Waters K.K. 20 10
マトリックス効果挟み込み分析による確認 標準溶液サンプル (1 回目 ) 未知試料サンプル 標準溶液サンプル (2 回目 ) 2013 Nihon Waters K.K. 21 マトリックス効果試料測定後にカラム洗浄メソッドを追加 標準溶液サンプル (1 回目 ) 未知試料サンプル 標準溶液サンプル (2 回目 ) カラム洗浄の効果が認められれば 測定で使用する LC のメソッドの洗浄時間や有機溶媒組成を変更する 分析前に実行される InletMethod ( 注入操作は無し ) 分析後に実行される InletMethod ( 注入操作は無し ) 2013 Nihon Waters K.K. 22 11
イオン源キャピラリーの劣化 イオン源における液滴形成 溶媒気化が不安定になると再現性が低下する可能性 移動相の有機溶媒組成が低く 移動相の流速が高い場合には 脱溶媒ガスの温度及び流量を高めに設定する イオン化の際には 試料溶液が通るステンレスキャピラリーには 数 kv の高電圧がかかるため ステンレスキャピラリーは徐々に先端が劣化 ( 表面が平滑ではなくなる ) してくる それに伴い スプレーが不安定になる可能性がある ESI イオン源 2013 Nihon Waters K.K. 23 本日の内容 感度に関するトラブル キャリーオーバ及びゴーストピークに関するトラブル 再現性に関するトラブル 分析に関するトラブルは 原因が MS 側に起因するのか LC 側の問題なのか それともカラムに由来するのかを見極める事が重要です 丹念に原因を切り分け 同一条件の測定を最低 2 回以上繰り返す 原因の可能性があるものを排除し 問題が解決したら 一つ一つ元に戻し 原因を特定する カラム分離に関する問題! MS 検出器の問題! サンプル注入に関する問題! ポンプの送液の問題! 2013 Nihon Waters K.K. 24 12
( 参考 ) トラブルシューティング操作ガイド集 - MassLynx http://www.waters.com/japan_masslynx_tips 2013 Nihon Waters K.K. 25 13