新規酢酸耐性菌を用いたリグノセルロース系バイオマスからのエタノール生産 北見工業大学工学部 バイオ環境化学科 准教授小西正朗 1
研究背景 バイオリファイナリー (Biorefinery): バイオマス等を原料としバイオプロセス物質生産の次世代基盤技術 スイートコーン コーンコブ ( 穂軸 ) 酵素糖化 発酵基質としての問題点糖化効率が悪い発酵阻害の問題 発酵に用いられる宿主はこれらの物質への耐性が低い除去操作が必要 ( 活性炭処理等 ) 製造コスト増加 前処理の複雑化 コーンコブ酵素糖化液 バイオプロセス 有用物質生産 エタノール乳酸糖アルコールポリマー原料高機能性物質 ( アスタキサンチン ) 様々な物質へ変換 発酵阻害を受けない菌の探索 2
発酵阻害物質の生成 3
任意の代謝遺伝子 糖化液 + 発酵阻害物質 発酵阻害耐性菌を宿主とした微生物工場の開発 発酵阻害耐性菌 合成生物学による代謝導入 発酵阻害耐性菌有用菌 課題 : 発酵阻害に対する特性 遺伝子導入技術の開発 課題 : ゲノム情報遺伝導入法 乳酸 ( ポリマー原料 ) バイオアルコールバイオマスプラスチック有機酸酵素製剤 グルコース ピルビン酸 TCA 回路 解糖系 乳酸 ( ポリマー原料 ) 検討項目 : 発酵阻害耐性菌の探索 乳酸菌由来乳酸脱水素酵素 (LDH) 培養特性評価ドラフトゲノム解析遺伝子導入法 4
先行研究例 ( 糖脂質 [ ソホロリピッド,SL] 生産 ) 硫酸処理酵素処理 ph 5 1.0~5.0% 硫酸 メイセラーゼ フィルター滅菌 121, 60min ソホロリピッド生産菌による糖化液からのソホロリピッド生産 3% 以上の硫酸前処理で増殖 糖脂質生産を阻害 Konishi M.*, Yoshida Y., Horiuchi J.: Efficient production of sophorolipids by Starmerella bombicola using a corncob hydrolysate medium. J. Biosci. Bioeng. 119, 317-322 (2015) 5
スクリーニング方法 ( 耐性菌の探索 ) 北見工業大学屈斜路研修所概観 6
発酵阻害耐性菌の分類ー系統分類ー 子嚢胞子 形態観察 生化学試験でも P. membranifaciens と一致 NBRC へ寄託寄託番号 :NITE P-02257 7
糖化液中での増殖挙動 増殖特性評価使用菌株 : Pichia menbranifaciens KS47-1 株, Pichia menbranifaciens NBRC 10125, Pichia manshurica NBRC 10726, Pichia deserticola NBRC 70716, Pichia kluyveri NBRC 1165, Kregervanrija fluxuum NBRC 0773, Saccaromyces cerevisiae BY4742 培地 : YM 培地, コーンコブ糖化液培地 20 ml 培養方法 : 振とうフラスコ培養 (28 C, 200 rpm) 8
糖化液の分析例 Intensity (-) 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 HMF(2.23) Frufural (3.58) 0 0 2 4 6 8 10 コーンコブ糖化液 (10 倍希釈 ) Vaniline (7.10) Retention time (min) Column: μboundasphere 5μ 100Å (3.9 150 mm) Mobile phase: 0.1% H3PO4/CH3CN = 85/15 Flow rate: 1 ml / min Sample Volume: 10 μl Detector: UV (275 nm) HMF: 5-hydroxymethyl furfural 阻害物質 : 酢酸 フルフラール ヒドロキシメチルフルフラール (HMF) などを含む 9
個別成分に対する耐性 10
高濃度酢酸存在下でのエタノール発酵 200 ml 容量バッフル付フラスコ酢酸添加 YPD 培地 20 ml(100 g/l glucose, 20 g/l peptone, 10 g/l yeast extract, 250 mm acetate (ph 5.0) 温度 : 28 C, 攪拌 : 200 rpm (0~24h), 70 rpm (24h~) KS47-1 NBRC10125 NBRC10125 BY4742 KS47-1 好気条件 (~24h) Acetate Biomass Glucose BY4742 スイッチング BY4742 NBRC10125 KS47-1 嫌気 [ 微好気 ] 条件 (24 h~) Acetate Biomass KS47-1 Glucose Ethanol 11
ドラフトゲノム解析 北海道ライフサイエンステクノロジー社に委託し KS47-1 株の Genome 解析を行った Table. Velvet(Ver 1.2.03) によるアセンブルの結果 k-value 61 Contig 379 Total contig size 11399492 Max. contig size 552197 Minimum contig size 121 N50 contig size 287258 Table. MiGAP によるアノテーションの結果 CDS trna rrna KS47-1Genome 4666 181 5 ゲノム解析 ( 方法 ) ゲノム DNA 抽出 : アルカリ SDS 法シーケンス : HiSeq 2000 (Illumina), 2 Gb, ペアエンドアセンブル : DDBJ Read Annotation Pipeline (Velvet V 1.2.03) アノテーション : MiGap (Microbial Genome Annotation Pipeline Ver 2.18) ORF, RNA 予測 : AUGSUTUS 2.5.5, trnascan-se 1.23, NCBI BLAST 2.2.18, RNAmmer 1.2 Annotation: NCBI BLAST 2.2.18 Reference Databese set: RefSeq release 67, TrEMBL release 2014_04, NR [20141001] Table.3 NCBI BLAST(2.2.18) 解析の結果 Software RefSeq 39 TrEMBL 935 NR 932 Total 1906 特許出願 : 発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母特願 2016-239366 ( 基礎出願特願 2016-116160) 論文投稿 :Konishi M*, Arakawa T., Kato Y., Ishida M., Horiuchi J: Genome Announc. [in press] DOI:10.1128/genomeA.01672-16 12
既知の酵母との遺伝的類似性 Pichia membranifaciens KS47-1 1606 本菌株特異的遺伝子 2893 16 56 175 2439 Saccharomyces cerevisiae S288C Venn diagram based on the similarity of CDSs among P. membranifaciens KS47-1, P. membranifaciens NRRL Y2026, and Saccharomyces cerevisiae S288C. The overlap was described by thresholds of 60% identities and 70% coverages using in silico MolecularCloning Genomic Edition version 6.0.35D. Diagram was draw by R version 3.3.2. 2893 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026* *) Riley, R., Haridas, S., Wolfe, K.H., Lopes, M.R., et al. 2016. Comparative genomics of biotechnologically important yeasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 113: 9882-9887. 13
酢酸耐性関連遺伝子 出芽酵母 (S. cerevisiae) で知られている酢酸耐性遺伝子と類似性の高い遺伝子を探索 Table. Estimated inhibitory compounds-tolerance associated genes of KS47-1. Query (S. cerevisiae S288c) Results Pichia membranifaciens KS47-1 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026 Name Accession No. Length Accession Length Q_cov Identity Accession Length Q_cov Identity (a.a) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) Acetate tolerant-associated genes FPS1 CAA38096 669 GAV27344 581 8 38 No Hit (PMKS-000808) HOG1 NP_013214 435 GAV30090 418 54 48 XP_019016084 439 88 79 (PMKS-003596) (PICMEDRAFT_17479) PMA1 NP_011507 918 GAV27308 913 98 82 XP_019017200 911 98 83 (PMKS-001114) (PICMEDRAFT_73562) PDR12 NP_015267 1501 GAV27646 1495 98 64 XP_019019180 1489 98 64 (PMKS-000772) (PICMEDRAFT_31991) HAA1 NP_015333 694 No Hit No Hit TPO2 NP_011654 641 GAV27934 708 98 59 XP_019018723 602 95 63 (PMKS_001402) (PICMEDRAFT_31287) TPO3 NP_015482 608 GAV27934 708 96 62 XP_019016311 524 95 62 (PMKS-001402) (PICMEDRAFT_31287) Abbreviation: Q_cov, Query coverage. 14
酢酸耐性機構 既知の酢酸の取り込みやストレス応答に関与する遺伝子はヒットしない 高毒性 ph 低下 15
酢酸代謝遺伝子 その他耐性関連遺伝子 Table. Estimated acetate assimilation associated gene and inhibitory compounds-tolerance associated genes of KS47-1. Query (S. cerevisiae S288c) Results Pichia membranifaciens KS47-1 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026 Name Accession No. Length Accession Length Q_cov Identity Accession Length Q_cov Identity (a.a) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) Acetate assimilation ACH1 NP_009538 526 GAV26611 524 99 73 XP_019016311 524 99 74 (PMKS-000065) (PICMEDRAFT_17688) ACS1 NP_009347 713 GAV28358 673 95 59 XP_019020447 671 90 67 (PMKS_001829) (PICMEDRAFT_14799) GAV28674 319 44 63 (PMKS_002148) ACS2 NP_013254 683 GAV28358 673 98 70 XP_019020595 673 98 69 (PMKS_001829) (PICMEDRAFT_71027) GAV28674 319 46 63 (PMKS_002148) ALD4 NP_015019 519 GAV27085 525 95 69 XP_019019753 525 95 47 (PMKS_000546) (PICMEDRAFT_74876) Furfural and 5-HMF tolerant associated genes ADH6 NP_014051 360 GAV28462 375 99 42 XP_019015385 375 99 47 (PMKS_001933) (PICMEDRAFT_74876) NP_010030 361 GAV30683 362 99 37 (PMKS-004202) ADH7 NP_014051 360 GAV28462 375 98 41 XP_019015385 375 99 47 (PMKS_001933) (PICMEDRAFT_74876) NP_010030 361 GAV30683 362 98 40 (PMKS-004202) ZWF1 NP_014158 505 GAV30453 236 44 56 XP_019016188 508 97 58 (PMKS_003967) (PICMEDRAFT_17573) ARI1 CUA76880 342 GAV26909 349 95 37 XP_019019389 359 93 36 (PMSK_000370) (PICMEDRAFT_16083) Abbreviation: Q_cov, Query coverage. 16
酢酸代謝 ACS1 Acetate CoA ligase 17
酢酸同化経路 Acetate CoA ligase (ACS1) Acetate CoA Acetyl CoA TCA cycle ATP AMP + PPi 好気的で ATP リッチな条件で活性化している可能性 酢酸同化による解毒作用が強力か? 18
まとめ コーンコブ糖化液中で増殖阻害を受けない酵母 Pichia membranifaciens KS47-1 株を分離した 好気培養で酢酸を優先的に利用できる 好気培養と嫌気培養を組み合わせた 2 段階培養で 250mM 酢酸存在下でエタノールを生産できる (6 g/l) ドラフトゲノム解析により 酢酸耐性ならびに代謝遺伝子について解析を進めている 酢酸取り込みについては未知の遺伝子を持っている可能性が高い 酢酸以外の増殖阻害物質に対しても高い耐性を持つ フルフラール類の耐性に関与する遺伝子を保持している 19
展望 コーンコブ以外のバイオマスでの有効性 遺伝子組換え系の構築 (Pichia pastoris の宿主ベクター系をベースに検討中 ) 遺伝子組換え系を利用した異種タンパク生産 合成代謝遺伝子を組み込んだ種々の物質生産 バイオマス由来発酵阻害物質に対しロバストなバイオプロセス構築副生成酢酸の有効利用 特異な耐性関連遺伝子の利用 既存の微生物に酢酸耐性付与 20
問い合わせ先 北見工業大学社会連携推進センター 内島典子 TEL 0157-26-4161 E-mail ucchi_f@mail.kitami-it.ac.jp 北見工業大学工学部バイオ環境化学科 小西正朗 TEL 0157-26-9402 E-mail konishim@mail.kitami-it.ac.jp 21