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様 式 C-19 科 学 研 究 費 補 助 金 研 究 成 果 報 告 書 平 成 23 年 5 月 27 日 現 在 機 関 番 号 :32644 研 究 種 目 : 基 盤 研 究 (C) 研 究 期 間 :2008~2010 課 題 番 号 :20591747 研 究 課 題 名 ( 和 文 ) 細 胞 シート 工 学 を 応 用 した 前 十 字 靭 帯 損 傷 の 修 復 再 生 に 関 する 研 究 研 究 課 題 名 ( 英 文 ) Experimental study for anterior cruciate ligament using cell sheet technology 研 究 代 表 者 三 谷 玄 弥 (MITANI GENYA) 東 海 大 学 医 学 部 講 師 研 究 者 番 号 :80307280 研 究 成 果 の 概 要 ( 和 文 ): 前 十 字 靭 帯 ( 以 下 ACL) 由 来 積 層 可 細 胞 シートの 作 成 および 吸 収 糸 メッシュとの 組 み 合 わせによる 立 体 的 再 生 ACL の 作 成 に 成 功 した また 免 疫 組 織 学 的 検 査 real time PCR の 結 果 より Tenomodulin( 以 下 TnmD)が ACL において 特 異 的 マーカーと して 使 用 されうること また ACL 細 胞 シートが ACL としての phenotype を 維 持 しているこ とを 確 認 した また 膝 関 節 内 の 滑 膜 組 織 にも TnmD が 発 現 していることから ACL 再 生 におけ る cell source となりえることが 示 唆 された 研 究 成 果 の 概 要 ( 英 文 ):Triple-layered ACL cell sheets and SCL-derived cell sheets were fabricated successfully without enzymatic digestion. Furthermore, 3-dimensional bioengineered ACL was fabricated by a combination of triple-layered ACL cell sheets and bioabsorbable mesh composite. Immunohistochemical examination and real-time PCR revealed that TnmD is a specific marker of the human ACL, and ACL sheets have a similar phenotype to the ACL. The superior expression of TnmD in synovial tissues, and synovium-derived cell sheets indicates that synovium is a potential cell source for ACL regeneration. 交 付 決 定 額 ( 金 額 単 位 : 円 ) 直 接 経 費 間 接 経 費 合 計 2008 年 度 1,900,000 570,000 2,470,000 2009 年 度 700,000 210,000 910,000 2010 年 度 500,000 150,000 650,000 年 度 年 度 総 計 3,100,000 930,000 4,030,000 研 究 分 野 : 医 歯 薬 学 科 研 費 の 分 科 細 目 : 外 科 系 臨 床 医 学 キーワード:ACL 細 胞 シート 再 生 医 療 前 十 字 靭 帯 Tenomodulin 1. 研 究 開 始 当 初 の 背 景 前 十 字 靭 帯 ( 以 下 ACL) 損 傷 はスポーツ 膝 傷 害 のなかでも 頻 度 が 高 く, 米 国 では 年 間 10 万 件 の 受 傷 が 見 積 もられている ACL はジャンプの 着 地 や 急 な 方 向 転 換 など, 他 の 選 手 と 接 触 しない 減 速 動 作 により 容 易 に 損 傷 する したがって,そのような 減 速 動 作 を 繰 り 返 すスポーツ ACL 損 傷 を 放 置 し てスポーツ 活 動 を 継 続 すると 脛 骨 の 前 方 亜 脱 臼 による 機 能 不 全 がスポーツ 活 動 制 限 要 素 となる.ACL 損 傷 膝 を 放 置 するとスポー

ツ 中 の 膝 くずれ 現 象 を 繰 り 返 すことにより 機 能 不 全 はさらに 悪 化 する. 同 時 に 膝 関 節 の 内 側 と 外 側 に 存 在 する 線 維 性 構 造 である 半 月 板 の 損 傷 が 続 発 または 悪 化 し, 関 節 面 の 損 傷 も 加 わって, 関 節 機 能 低 下 の 悪 循 環 をきたし, 最 終 的 に 膝 関 節 の 外 傷 性 膝 関 節 症 に 至 る 通 常 治 療 には 自 家 半 腱 様 筋 腱 や 膝 蓋 腱 を 用 いた ACL 再 建 手 術 が 行 われ るが 技 術 の 進 歩 した 現 在 でもドナーサイ トの 疼 痛 筋 力 低 下 再 々 建 時 のドナー 選 択 など 解 決 すべき 問 題 も 多 い よってドナ ー 採 取 を 要 しない 再 生 医 療 の ACL 不 全 膝 治 療 への 応 用 が 望 まれる しかし 腱 靭 帯 の 組 織 は 細 胞 成 分 が 乏 しく 再 生 が 難 しいこ と 腱 靭 帯 細 胞 を 特 異 的 に 同 定 する 手 法 が 一 般 的 でないため 瘢 痕 組 織 との 種 別 が 困 難 なこと などからこの 分 野 の 再 生 に 対 す る 研 究 は 同 じ 整 形 外 科 領 域 の 軟 骨 再 生 医 療 に 比 べ 未 発 達 であった しかし 2006 年 宿 南 らによって 腱 靭 帯 固 有 に 発 現 する 糖 タンパク Tenomodulin (TnmD)の 存 在 が 報 告 された これによ り 従 来 困 難 であった 健 常 靭 帯 組 織 工 学 的 靭 帯 と 瘢 痕 組 織 の 判 別 が 可 能 となる 可 能 性 が 考 えられた アップセル TM は 1993 年 Okano らに より 報 告 された 特 殊 な 培 養 皿 であり 熱 応 答 性 ポリマーであるポリN-イソプロピル アクリルアミド(PIPAAm)がナノインター フェース 技 術 で 表 面 に 構 築 されている 通 常 培 養 皿 上 で 培 養 された 細 胞 は 回 収 する 際 に 何 らかの 酵 素 的 処 理 が 必 要 となるがアッ プセル TM 上 で 培 養 された 細 胞 は 培 養 温 度 から 20 へ 温 度 を 下 げるのみで 細 胞 シー トとして 回 収 できる これを 用 いた 細 胞 シ ート 工 学 は 角 膜 肝 心 筋 食 道 などの 分 野 で 広 く 研 究 されており 中 でも 角 膜 にお いては 既 に 臨 床 応 用 されている 現 在 までに 我 々はこの 細 胞 シート 工 学 を 用 いて 日 本 白 色 家 兎 及 びヒト 軟 骨 滑 膜 の 細 胞 シートを 作 成 することに 成 功 し 臨 床 応 用 に 向 けたその 基 礎 的 研 究 を 行 っている よってこの 技 術 を 応 用 した ACL 再 生 の 研 究 を 行 う 着 想 に 至 った 2. 研 究 の 目 的 ACL 不 全 膝 における 細 胞 シート 工 学 を 応 用 した 治 療 の 可 能 性 を 検 討 するため ACL 細 胞 シート 作 製 し その 有 用 性 と 問 題 点 を 把 握 することである 3. 研 究 の 方 法 膝 ACL 再 建 術 の 際 に 郭 清 した 遺 残 ACL 及 び 人 工 膝 関 節 置 換 術 の 際 切 除 される 健 常 ACL を 患 者 本 人 の 承 諾 を 得 て 本 研 究 に 使 用 する それぞれの 組 織 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 遺 伝 子 的 に 評 価 する 単 離 した ACL 由 来 細 胞 滑 膜 組 織 を 培 養 し 十 分 な 細 胞 数 が 得 られた 時 点 で 温 度 応 答 性 培 養 皿 に 播 種 する コンフルエ ントに 達 した 時 点 で 20 度 以 下 に 温 度 を 下 げ シート 状 に 回 収 し 積 層 化 する 細 胞 シートが 脆 弱 で 剥 がすことが 困 難 であ った 場 合 フィブリン 糊 にてコーティングし 把 持 を 容 易 にする 健 常 ACL 線 維 損 傷 された 遺 残 ACL 及 び 作 成 したACL 細 胞 シートをTnmDの 抗 体 Anti-TnmD antibodyで 免 疫 染 色 を 行 い 遺 残 ACLとACL 細 胞 シートのヒトACL 細 胞 としての 形 質 維 持 の 有 無 について 検 討 する また 損 傷 部 位 を 取 り 除 き 酵 素 的 に 単 離 し た 遺 残 ACL 由 来 細 胞 および 脂 肪 性 滑 膜 靭 帯 性 滑 膜 皮 下 脂 肪 組 織 は 摘 出 後 Real time PCR 及 びモノクロナール 抗 体 を 用 い た 免 疫 組 織 化 学 的 にTnmDの 発 現 について 検 討 し 腱 靭 帯 への 特 異 性 を 当 研 究 機 関 で も 確 認 をする ブタACL 部 分 損 傷 モデルにヒトACL 損 傷 モデ ルに 貼 付 し 器 官 培 養 行 い 接 着 性 損 傷 被 覆 部 の 状 態 をコントロールと 比 較 し 評 価 する また 現 在 吸 収 糸 として 広 く 臨 床 に 使 用 され ているバイクリルメッシュを 細 胞 シートの 補 強 剤 として 用 い 靭 帯 様 に 整 形 し 培 養 を 継 続 し その 再 生 組 織 の 性 状 を 観 察 する また 靭 帯 の 生 理 的 環 境 であるメカニカルス トレスが 再 生 組 織 の 性 状 強 度 などに 与 える 影 響 について 検 討 する 4. 研 究 成 果

酵 素 的 処 理 を 要 することなく 温 度 応 答 性 培 養 皿 から 温 度 変 化 のみで 前 十 字 靭 帯 ( 以 下 ACL) 由 来 細 胞 シートの 作 成 に 成 功 した ( 図 1) また 上 から 重 ねることでシート 自 体 が 有 す る 接 着 性 を 利 用 し 積 層 可 細 胞 シートの 作 成 にも 成 功 した 他 の 組 織 と 比 べ 脆 弱 性 のある ACL 細 胞 シートは cell shifter を 用 いること で 回 収 する 確 率 を 上 げることが 出 来 た ま た 積 層 化 ACL 細 胞 シートと 吸 収 糸 メッシュ との 組 み 合 わせによる 立 体 的 再 生 ACL の 作 成 に 成 功 した ( 図 2) 免 疫 組 織 学 的 検 査 にて 健 常 ACL に TnmD が 発 現 していること 遺 残 ACL の 断 端 部 は その 発 現 が 少 ないことから TnmD の 発 現 が ACL の 靭 帯 としての phenotype 維 持 に 関 わ っている 可 能 性 が 示 唆 された また 作 成 され た ACL 細 胞 シートが 良 好 に TnmD を 発 現 し ていることから ACL 固 有 の phenotype を 維 持 していることが 示 唆 された また 免 疫 組 織 学 的 検 査 ( 図 3) および real time PCR( 図 4)の 結 果 より 膝 関 節 内 の 脂 肪 性 滑 膜 (SIF) 靭 帯 性 滑 膜 (SCL)にも TnmD が 発 現 していること(negative control の 皮 下 脂 肪 には 発 現 なし) 靭 帯 周 囲 滑 膜 由 来 細 胞 シートの 作 成 に 成 功 したことから ACL 再 生 における cell source となりえるこ とが 示 唆 された 図 1 ACL 細 胞 シートの 作 成 図 3 ACL SIF 図 4 膝 関 節 周 囲 組 織 の TnmD 発 現 SCL FAT Real time PCR ACL FAT SIF SCL 図 2 作 成 された 組 織 工 学 的 ACL 図 3 免 疫 組 織 化 学 的 検 討

5. 主 な 発 表 論 文 等 ( 研 究 代 表 者 研 究 分 担 者 及 び 連 携 研 究 者 に は 下 線 ) 雑 誌 論 文 ( 計 1 件 ) 1The properties of bioengineered chondrocyte sheets for cartilage regeneration BMC biotechnology 2009 Genya Mitani, Masato Sato*, Jeong IK Lee1, 沓 名 寿 治 (KUTUNA TOSHIHARU) 研 究 者 番 号 :90328120 東 海 大 学 医 学 部 講 師 (3) 連 携 研 究 者 なし ( ) 研 究 者 番 号 : Nagatoshi Kaneshiro, Miya Ishihara, Naoshi Ota, Mami Kokubo, Hideaki Sakai,Tetsutaro Kikuchi and Joji Mochida 1 件 投 稿 中 ( ECM journal) Experimental study on anterior cruciate ligament regeneration by cell sheet technology based on tenomodulin expression 学 会 発 表 ( 計 4 件 ) 1 三 谷 玄 弥 平 成 23 年 3 月 第 10 回 日 本 再 生 医 療 学 会 総 会 ヒト 膝 関 節 内 組 織 における Tenomodulin Scleraxis の 発 現 状 況 2 三 谷 玄 弥 平 成 22 年 10 月 第 25 回 日 本 整 形 外 科 学 会 基 礎 学 術 集 会 3 三 谷 玄 弥 平 成 22 年 7 月 2nd JOSKAS ヒト 膝 関 節 内 組 織 における Tenomodulin Scleraxis の 発 現 状 況 4ヒト 前 十 字 靭 帯 細 胞 シート 滑 膜 組 織 におけ る Tenomodulin の 発 現 状 況 三 谷 玄 弥 平 成 21 年 10 月 第 23 回 日 本 整 形 外 科 学 会 基 礎 学 術 集 会 再 生 医 療 に 向 けた 前 十 字 靱 帯 滑 膜 由 来 細 胞 シートの 検 討 図 書 ( 計 0 件 ) 産 業 財 産 権 出 願 状 況 ( 計 0 件 ) 取 得 状 況 ( 計 0 件 ) その 他 ホームページ 等 6. 研 究 組 織 (1) 研 究 代 表 者 三 谷 玄 弥 (MITANI GENYA) 東 海 大 学 医 学 部 講 師 研 究 者 番 号 :80307280 (2) 研 究 分 担 者 佐 藤 正 人 (SATOU MASATO) 東 海 大 学 医 学 部 准 教 授 研 究 者 番 号 :10056335