内容 < 基礎 > ODS の構造と特性移動相緩衝液 < 分析方法のノウハウ > 解離性化合物分離の改善試料の注入テクニック上手なカラムのダウンサイジング 2μmODS カラムの使用 < トラブルシューティング > 保持時間が変化したピーク面積が変化した水系 100% に近い移動相 SN を大きくす

逆相 HPLC のノウハウ 東京事業所クロマト技術部 藤本一馬 1

内容 < 基礎 > ODS の構造と特性移動相緩衝液 < 分析方法のノウハウ > 解離性化合物分離の改善試料の注入テクニック上手なカラムのダウンサイジング 2μmODS カラムの使用 < トラブルシューティング > 保持時間が変化したピーク面積が変化した水系 100% に近い移動相 SN を大きくするカラムの洗浄と保管 2

内容 < 基礎 > ODS の構造と特性移動相緩衝液 < 分析方法のノウハウ > 解離性化合物分離の改善試料の注入テクニック上手なカラムのダウンサイジング 2μmODS カラムの使用 < トラブルシューティング > 保持時間が変化したピーク面積が変化した水系 100% に近い移動相 SN を大きくするカラムの洗浄と保管 3

ODS の構造と特性 シリカゲル基材 物性値 (L-column L-column2) 平均粒子径 :2,3,5μm 平均細孔径 :12 nm 比表面積 :340 m 2 /g 細孔容積 :1.1 ml/g 拡大 二次粒子 ( 一次粒子の集合 ) 4

ODS の構造と特性 1ODS の構造 ( 一官能性 ODS) CH 3 : CH 2 or CH 3 : 酸素 C 18 H 37 Si Cl CH 3 : 水素 : シラノール : Si シリル化反応 5

ODS の構造と特性 2ODS の構造 ( 三官能性 ODS) Cl C 18 H 37 Si Cl : CH 2 or CH 3 : 酸素 : 水素 : シラノール : Si Cl シリル化反応 6

ODS の構造と特性 3ODS の構造 一官能性 ODS と三官能性 ODS の安定性の違い C 18 H 37 C 18 H 37 H 3 C Si CH HO Si δ + 3 δ + H + O δ H + O δ OH Si シリカゲル骨格 Si シリカゲル骨格 ポーリングの電気陰性度 : O > C > H >Si 3.5 2.5 2.1 1.8 W. Noll, Chemistry and Technology of Silicones, Academic Press, Orland, 1968, p.312. 7

ODS の構造と特性 4ODS の構造 エンドキャッピング ( 二次シリル化 ) : CH 2 or CH 3 : 酸素 : 水素 : シラノール : Si CH 3 CH 3 Si Cl CH 3 トリメチルシリル化 残存シラノール 8

ODS の構造と特性 ODS における保持機構 疎水性相互作用 ( 本来の保持機構 ) : CH 2 or CH 3 : 酸素 : 水素 : シラノール : Si < 二次的相互作用シラノールとの相互作用 金属不純物との相互作用 NH 2 保持機構を複雑化する HO O 金属不純物 9

ODS の構造と特性 塩基性化合物分析によるカラム評価 1 2 CH 3 C-3 O OH N H CH 3 E-1 D-1 F-2 1. プロプラノロール 50 mg/l H N CH 3 L-column ODS 0 10 20 L-column 2 ODS min 2. マプロチリン 500 mg/l カラムサイズ :4.6 150 mm, 5μm; 移動相 :CH 3 CN / 25 mm リン酸緩衝液 ph7 (3/7); 流量 : 1 ml/min; 温度 : 40 ; 検出 : UV 220 nm; 試料 : in CH 3 CN,1 μl ピークテーリングの程度によりエンドキャッピングの優劣が分かる 10

ODS の構造と特性 酸性化合物分析によるカラム評価 L-column2 ODS Tf 1 =1.098 L-column ODS Tf 1 =1.249 Brand D-1 TF 1 =1.364 Brand E-1 TF 1 =2.034 Brand F-2 TF 1 =1.164 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 カラム : 4.6 x 150 mm (C18, 5μm) 移動相 : アセトニトリル / 20 mm リン酸 (2/98) 温度 : 40 ; 流量 : 1 ml/min; 検出 : UV 210 nm; 試料 : 1. ぎ酸 1 2 3 4 min 2. 酢酸 ピークテーリングの程度により基材シリカゲルの純度とエンドキャッピングの優劣がわかる 11

ODS の構造と特性 配位性化合物分析によるカラム評価 Brand D-1 Brand F-2 L-column ODS 0 2 4 6 8 10 カラム : 5 μm, 4.6 150 mm 移動相 : CH 3 CN / 20 mm H 3 PO 4 (40/60) 流量 :1 ml/min; 温度 : 40 ; 検出 :UV 254 nm 試料 :0.5 mg/l ヒノキチオール in CH 3 CN, 10 μl L-column2 ODS min O OH ヒノキチオール ピークテーリングの程度により基材シリカゲルの純度とエンドキャッピングの優劣がわかる 12

ODS の構造と特性 逆相カラムの選び方 ファーストチョイスは高性能なカラム 高理論段数 低吸着性 高耐久性 ロット間のばらつきが少ない 低カラム圧力 目的成分にあったカラムを選ぶ メーカーのアプリケーションデータなどを検索 デモカラムを試す 13

移動相 水の規格によるベースラインの比較 Mili-Q HPLC 用蒸留水 イオン交換水 精製水 0 10 20 30 カラム : L-column ODS 5μm,4.6 150 mm; 検出 :UV 210 nm 移動相 :HPLC 用アセトニトリル / 水 (10/90 100/0 0 30 min) ; 流量 :1 ml/min min 水に不純物が含まれていると ベースラインが上昇したり ゴーストピークが出現する 14

移動相 有機溶媒の規格による UV 吸収の比較 吸光度 0.6 0.5 特級アセトニトリル 0.4 0.3 0.2 HPLC 用アセトニトリル 0.1 0 200 220 240 260 280 300 320 340 波長 HPLC 用アセトニトリル 吸光度 相対蛍光強度 グラジェントの規格があり 低波長 (250nm 以下 ) での吸光度が低い 2 吸光度 1.5 1 0.5 特級メタノール HPLC 用メタノール HPLC 用メタノール 吸光度 相対蛍光強度の規格があるが グラジェントの規格はない 0 200 220 240 260 280 300 320 340 波長 15

移動相 カラム圧の比較 カラム圧 (MPa) 12 10 8 6 4 2 0 アセトニトリル / 水 メタノール / 水 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 移動相の有機溶媒組成 (%) カラム : L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 流量 :1 ml/min; 温度 : 室温 16

移動相 有機溶媒の種類による溶出順序の違い アセトニトリル /20 mm リン酸 (35/65) メタノール /20 mm リン酸 (35/65) 安息香酸 フェノール フェノール 安息香酸 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 250 mm 流量 :1 ml/min; 温度 :30 アセトニトリル ( 非プロトン性 ) とメタノール ( プロトン性 ) で溶出順序が変わることがある 17

移動相 分配係数 (Pow) とは 水と1-オクタノールの間の分配係数 物質の疎水性を表す計算式 : Pow = Co / Cw Pow が大きければ 疎水性が高い Co: オクタノール中の試料濃度 Cw: 水中の試料濃度 構造式 名称 log Pow 保持時間 ベンゼン 2.13 小 CH 3 トルエン 2.73 ナフタレン 3.3 大 試料の疎水性が大きくなると溶出は遅くなる 18

移動相 R 化合物の構造と logpow 化合物 logpow 化合物 logpow アニリン (-NH2) 0.9 エタノール -0.31 フェノール (-OH) 1.46 n- ヘキシルアルコール 2.03 ベンズアルデヒド (-CHO) 1.48 n- ペンタン 3.39 安息香酸 (-COOH) 1.87 シクロヘキサン 3.44 ベンゼン (- H) 2.13 n- ヘキサン 3.9 トルエン (-CH3) 2.73 n- ヘプタン 4.66 クロロベンゼン (-Cl) 2.84 n- オクタン 5.18 親水性の官能基が付くと logpow が小さくなり 溶出が早くなる 19

移動相 移動相の調製法 アセトニトリル / 水 (7/3 v/v) を調製する場合 アセトニトリル 水 70 ml + 30 ml ( 約 98mL) それぞれを個別に量りとり 1つの容器に入れる 各溶媒が室温になってから計る 20

移動相 移動相の調製誤差と保持時間 (A) アセトニトリル / 水 (70/30) (A) (B) (B) アセトニトリル / 水 (69/31) カラム :L-column ODS 4.6 150 mm 移動相 : アセトニトリル / 水 試料 :p- ターフェニル (in アセトニトリル ) 0 5 10 15 20 移動相の有機溶媒が1% の差で保持時間が1.2 分 (7%) 変化した 21

移動相 移動相の脱気 脱気を行なわず気泡が発生する事によるトラブル ポンプ内 保持時間の変化 カラム内 クロマトグラムに異変 検出器内 スパイクノイズ ベースラインの変動 脱気方法 アスピレータを用いた減圧脱気 高分子膜を用いたインライン減圧脱気 ヘリウムガスのバブリングによる脱気 いつも同じ方法 同じ時間で脱気する 22

緩衝液 緩衝液とは 溶液に酸または塩基を加えた時や希釈した時に ph の変化を緩める作用をもつ溶液を緩衝液 (buffer solution) という 弱酸 + 共役塩基 H 3 PO 4 と H 2 PO 4 - ( 弱塩基 + 共役酸 NH 3 と NH 4+ ) 例 : リン酸緩衝液 (ph=1.83 付近のとき ) H 3 PO 4 H 2 PO 4- +H + 緩衝作用が働く条件 H 3 PO 4 とH 2 PO 4- が共存 ph が pka± 約 1の範囲 23

緩衝液 緩衝液を調製する方法 ph メータを見ながら調製 (ph 調整は有機溶媒との混合前の段階で行なう ) 一定量を秤量し調製 ( 質量による調製は再現性が高い ) 24

緩衝液 一定量を秤量し調製する方法 例 : 20 mm リン酸緩衝溶液 (ph7.0) を調製する場合 PO 4 の合計が 20 mm となるように調製 KH 2 PO 4 (M.W. 136.09) Na 2 HPO 4 (M.W. 141.96) 1.143 g (8.40 mm) 1.646 g (11.60 mm) 水で溶解し 全量を 1L とする 緩衝液の調製は一定量を秤量し調製すると簡便で再現性が良い 25

緩衝液 緩衝液調製の計算 解離定数を Ka として pka を h とおくと h=-logka リン酸を X (mol/l) リン酸二水素ナトリウムを Y (mol/l) 合計の濃度を M (mol/l) 目的とする ph を P と置く 電荷均衡より [H + ]+[Na + ]=[H 2 PO 4- ]+[OH - ] 物質収支より [NaH 2 PO 4 ]+[H 3 PO 4 ]=M 解離定数 Ka=[H + ][H 2 PO 4- ]/[H 3 PO 4 ]=10^-h この連立方程式を解いて X と Y を得ることができる 26

緩衝液 11L 調製する場合のモル数 ( 計算による ) 10 mm 20 mm 30 mm 調製したい ph KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 6 8.79 1.21 17.58 2.42 26.36 3.64 6.2 8.21 1.79 16.41 3.59 24.62 5.38 6.4 7.43 2.57 14.85 5.15 22.28 7.72 6.6 6.45 3.55 12.91 7.09 19.36 10.64 6.8 5.34 4.66 10.69 9.31 16.03 13.97 7 4.20 5.80 8.40 11.60 12.60 17.40 7.2 3.14 6.86 6.27 13.73 9.41 20.59 7.4 2.24 7.76 4.48 15.52 (pka=6.86を用いて計算 実際にpHを測定して用いること) 6.72 23.28 ( 単位 :mmol) 27

緩衝液 21L 調製する場合のモル数 ( 計算による ) 5mM 10 mm 20 mm 調製したい ph CH 3 COOH CH 3 COONa CH 3 COOH CH 3 COONa CH 3 COOH CH 3 COONa 4.0 4.36 0.64 8.62 1.38 17.14 2.86 4.2 3.98 1.02 7.90 2.10 15.74 4.26 4.4 3.52 1.48 7.00 3.00 13.96 6.04 4.6 2.98 2.02 5.94 4.06 11.85 8.15 4.8 2.40 2.60 4.79 5.21 9.56 10.44 5.0 1.84 3.16 3.66 6.34 7.32 12.68 5.2 1.34 3.66 2.67 7.33 5.33 14.67 5.4 0.94 4.06 1.87 8.13 (pka=4.76を用いて計算 実際にpHを測定して用いること) 3.73 16.27 ( 単位 :mmol) 28

緩衝液 リン酸の解離 非解離状態の存在率 ( リン酸の pka 1.83 6.43 11.46) 100 H 3 PO 4 H 2 PO - 4 HPO 2-4 PO 3-4 80 OH HO-P-OH O 存在率 (%) 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 リン酸緩衝液は ph 4 と 9 付近では緩衝能を持たない ph 29

緩衝液 1 緩衝能の有無の比較 ( ピーク形状 ) (A) 緩衝能なし (B) 緩衝能あり (1) (1) 安息香酸 (100 mg/l) HO O OH O CH O 3 pka=4.2 pka=8.5 (2) メチルパラベン (100 mg/l) (1) (2) (2) 緩衝能のない移動相で分析すると 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 pka が ph に近い解離性化合物のピークがひずむ カラム : L-column2 ODS 5μm, 4.6 150 mm 移動相 : (A) 20 mm KH 2 PO 4 (ph4.4) / アセトニトリル (75 / 25) (B) 20 mm 酢酸緩衝液 (ph4.4) / アセトニトリル (75 / 25) 注入量 : 5 μl 30

緩衝液 2 緩衝能の有無の比較 ( 注入量の影響 ) 20mM KH 2 PO 4 (ph4.4) / アセトニトリル (75 / 25) ( 緩衝能なし ) 注入量 5μL 2μL 1μL t R ( 安息香酸 ) 3.759 min 3.636 min 3.558 min (1) t R ( メチルパラベン ) 7.701 min 7.679 min 7.615 min (2) 0 2 4 6 8 10 20mM 酢酸緩衝液 (ph4.4) / アセトニトリル (75 / 25) ( 緩衝能あり ) 注入量 5μL 2μL 1μL (1) t R ( 安息香酸 ) 3.135 min 3.123 min 3.133 min t R ( メチルパラベン ) 7.585 min 7.567 min 7.638 min (2) 0 2 4 6 8 10 カラム : L-column2 ODS 5μm, 4.6 150 mm 試料 : (1) 安息香酸 (100 mg/l),(2) メチルパラベン (100 mg/l) 緩衝能のない移動相で分析すると 注入量が多くなるにつれ解離性化合物は保持時間が遅くなる 31

緩衝液 3 緩衝能の有無の比較 ( 再現性 ) ロット番号 (A) 20mM KH 2 PO 4 (ph4.4) 安息香酸の保持時間 メチルハ ラヘ ンの保持時間 分離度 (B) 20mM 酢酸緩衝液 安息香酸の保持時間 メチルハ ラヘ ンの保持時間 (ph4.4) 分離度 E4311 3.725 7.990 19.523 3.117 7.543 26.555 E4312 3.541 7.415 18.794 3.059 7.301 26.386 E4313 3.636 7.679 18.754 3.123 7.567 26.4 CV(%) 2.53 3.91 2.28 1.14 1.97 0.354 カラム : L-column2 ODS 5 μm, 4.6 150 mm 移動相 : (A) 20mM KH 2 PO 4 (ph4.4) / アセトニトリル (75 / 25) (B) 20mM 酢酸緩衝液 (ph4.4) / アセトニトリル (75 / 25) 試料 : 安息香酸 (100 mg/l) メチルパラベン(100 mg/l) 注入量 : 2μL 緩衝能のない移動相では解離性化合物のロット間のばらつきが大きくなる 32

緩衝液 逆相 HPLC で使用される代表的緩衝液 添加剤トリフルオロ酢酸酢酸 (NH 4 Na K) ギ酸 (NH 4 Na K) りん酸アンモニア重炭酸アンモニウムホウ酸クエン酸 pka 有効緩衝範囲 推奨使用条件 <1.0 0.02~0.1% 4.76 3.76~5.76 0.1~1.0% 3.54 2.5~4.5 0.1~1.0% 1.83 1~2.8 1~10mM 6.43 5.4~7.4 11.46 9.36 8.4~10.4 <10mM 9.87(HCO 3 ) 8.9~10.9 5~10mM 9.36(NH 4 +) 8.4~10.4 6.11(CO 2-3 ) 5.1~7.1 9.24 8.2~10.2 2.90 1.9~3.9 4.35 3.4~5.4 5.69 4.7~6.7 ( 化学便覧第 5 版 及び液クロ文の巻より ) 33

緩衝液 緩衝液使用上の注意 用いる ph で緩衝能がある緩衝液を使う 緩衝液の UV 吸収に注意が必要 塩の析出の恐れがある 有機溶媒と混合したとき 100 mm のリン酸カリウム水溶液の場合 アセトニトリル >70% メタノール >80% で析出するナトリウム塩よりカリウム塩のほうが溶解し易い グラジェントのとき組成の全ての範囲で析出しないこと 移動相の交換時 カラムの平衡化に時間を要する 緩衝液を使わない移動相を使うと 前の移動相の影響が出る場合がある 34

内容 < 基礎 > ODS の構造と特性移動相緩衝液 < 分析方法のノウハウ > 解離性化合物分離の改善試料の注入テクニック上手なカラムのダウンサイジング 2μmODS カラムの使用 < トラブルシューティング > 保持時間が変化したピーク面積が変化した水系 100% に近い移動相 SN を大きくするカラムの洗浄と保管 35

解離性化合物 解離性化合物 解離性化合物とは 解離性の官能基をもった物質であり ph によって解離しイオンになる性質を持つ ( イオン性物質 ) 酸性官能基芳香族水酸基 (-OH) カルボキシル基 (-COOH) リン酸基 (-PO 3 H) スルホン酸基 (-SO 3 H) 塩基性官能基アミノ基第一級アミン (-NH 2 ) 第二級アミン (-NH-) 第三級アミン ( -N- ) 第四級アンモニウムイオン (-N-) イミノ基 ( =N-) 36

解離性化合物 酸性化合物の分析法 緩衝液を使用する方法 ( 解離を調節 ) 解離平衡を安定化させて分析する ( 対象物質 : 弱酸性の化合物 ) イオンペアクロマトグラフィー解離している化合物に イオン対試薬を添加しイオン対を形成させて固定相に保持させる ( 対象物質 : 強酸性の化合物 ) 37

解離性化合物 1 緩衝液を使用する方法 ( 解離を調節 ) ph による安息香酸の解離 非解離状態の存在率 存在率 (%) 100 50 COOH COO - 0 ph = pka = 4.2 1 2 3 4 5 6 7 8 ph pkaから 2 小さいpHにすると解離状態は1% となる ( 酸の場合 ) ph=pkaのとき 解離状態と非解離状態が1:1で存在する 38

解離性化合物 2 緩衝液を使用する方法 ( 解離を調節 ) ph が異なる場合のクロマトグラム 0.2 ph6.7 緩衝液の ph と保持時間 0.15 0.1 ph2.2 ph 2.2 保持時間 ( 分 ) 6.65 解離状態 (%) 1.0 0.05 6.7 1.85 99.7 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 移動相 : アセトニトリル /25 mm リン酸緩衝液 (25/75) 試料 : 安息香酸 緩衝液の ph が変わると 解離平衡が移動し それに合わせて保持時間が変わる 39

解離性化合物 1 イオンペアクロマトグラフィー R SO 3 - Na + スルホン酸等は ph を酸性にしても 解離を抑えることができない C 4 H 9 C 4 H 9 N + C 4 H 9 C 4 H 9 Br - C 4 H 9 R SO 3 - イオン対試薬 ( 5 ~ 20 mm ) 1 テトラブチルアンモニウム (TBA) ブロマイド価格が安いが 低波長に UV 吸収がある 2 テトラブチルアンモニウム (TBA) ホスフェイト ( 水溶液 ) 価格は高いが UV 吸収が小さい N + C 4 H 9 C 4 H 9 C 4 H 9 会合体形成電荷を打ち消しあって疎水性が増加する 40

解離性化合物 2イオンペアクロマトグラフィー ( 酸性染料の分析例 ) HO N N SO 3 Na 1 2 3 1.α- ナフトールオレンジ OH N N SO 3 Na 2. アシッドオレンジ 7 0 5 10 N H N N SO 3 Na 3. アシッドオレンジ5 カラム :L-column2 ODS 5μm, 4.6 x 150 mm 移動相 : アセトニトリル / 水 (45/55,10 mm TBA-PO 4 ); 流量 :1 ml/min; 検出 :UV 430 nm; 注入量 :1 μl 試料 :1.α-ナフトールオレンジ, 2. アシッドオレンジ7, 3. アシッドオレンジ5 41

解離性化合物 イオン対試薬 塩基性化合物用 1-ペンタンスルホン酸ナトリウム 1-ヘキサンスルホン酸ナトリウム 1-ペプタンスルホン酸ナトリウム 1-オクタンスルホン酸ナトリウムドデカン-1-スルホン酸ナトリウム n-ドデシル硫酸ナトリウム 酸性化合物用 臭化テトラブチルアンモニウム水酸化テトラブチルアンモニウムリン酸テトラブチルアンモニウム 42

解離性化合物 塩基性化合物の分析法 緩衝液を使用する方法 ( 解離を調節 ) 解離平衡を安定化させて分析する イオンペアクロマトグラフィー 第一級 ~ 第三級アミン移動相を酸性にして 溶質を十分に解離させて行う 第四級アンモニウムイオン移動相の ph 調整は必要ない 43

解離性化合物 緩衝液を使用する方法 N 1 2 3 F O NH O F N CH 3 O O CH 3 1. Paroxetine (400 mg/l) 2. Citalopram (200 mg/l) H 3 C NH O CF 3 0 10 20 カラム :L-column2 ODS 5μm,4.6 150 mm ; 移動相 : アセトニトリル / 25 mm リン酸緩衝液 ph7.0 (35/65); 流量 :1 ml/min; 温度 :40 ; 検出 :UV230 nm; 注入量 :2 μl min 3. Fluoxetine (300 mg/l) 緩衝液を用いることで溶質の解離平衡が一定となり シャープなピークが得られる 44

解離性化合物 1 イオンペアクロマトグラフィー ピーク形状の改善 保持をさせたい R 2 R 1 N + X - R 4 R 3 イオンぺアクロマトグラフィー R SO 3 - Na + R SO 3 - R 2 R 1 N + R 4 R 3 第四級アンモニウムイオンは ph で解離を抑えることはできない イオン対試薬 (1) アルキルスルホン酸移動相中 5~10mM で用いる (2) 過塩素酸塩移動相中 100~200mM で用いる 保持時間はそれほど大きくならないが テーリング防止効果が大きい * 会合体形成電荷を打ち消し合って疎水性が増加する イオン対試薬のアルキル基の長さ 試薬の濃度 (5~10 mm) で保持時間を調整できる * 林守正, 島津評論,45(1988)171. 45

解離性化合物 2 イオンペアクロマトグラフィー ( 第四級アンモニウムイオンの分析例 ) カラム : L-column2 ODS 5 μm, 4.6 150 mm 移動相 : アセトニトリル / 水 (3/7, 10 mmペンタンスルホン酸ナトリウム ) 流量 :1 ml/min 温度 : 40 注量 :1 μl 試料 : ベルベリン O O N + OCH 3 OCH 3 0 5 10 min 第四級アンモニウムイオンはイオンペアクロマトグラフィーを使用することで理論段数が向上し 保持が強くなる 46

解離性化合物 塩基性化合物のテーリング防止策 移動相 酸性移動相を使用する イオン対試薬を使用する アンチテーリング剤 ( アミン類 ) を使用する 移動相にメタノールを使用する 温度を高くする カラム 十分なエンドキャッピングの ODS を使う最も効果的で条件検討が容易 47

解離性化合物 酸性移動相を使用する カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 流量 :1 ml/min 温度 :40 試料 : プロプラノロール CH 3 Tf=1.212 CH 3 CN/20 mm リン酸 (30/70) O OH N H CH 3 Tf=1.489 CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph7(30/70) 0 5 10 15 酸性にすると 残存シラノールの解離が抑えられ 塩基性物質が残存シラノールとイオン結合できない 48

解離性化合物 イオン対試薬を使用する Tf=0.997 CH 3 CN/100 mm 過塩素酸ナトリウム (30/70) Tf=1.056 CH 3 CN/20 mm リン酸 +5 mm ヘキサンスルホン酸ナトリウム (30/70) Tf=1.212 CH 3 CN/20 mm リン酸 (30/70) 0 5 10 15 カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 流量 :1 ml/min 温度 :40 試料 : プロプラノロール 塩基性化合物はイオン対試薬と結合するため 残存シラノールと相互作用できない 49

解離性化合物アンチテーリング剤 ( アミン類 ) を使用する Tf=1.092 CH 3 CN/20 mm リン酸 +5 mm トリエチルアミン (30/70) Tf=1.212 CH 3 CN/20 mm リン酸 (30/70) 0 5 10 15 カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 流量 :1 ml/min 温度 :40 試料 : プロプラノロール 添加アミン類が残存シラノールと結合するため塩基性化合物は残存シラノールと相互作用できない 50

解離性化合物 移動相にメタノールを使用する Tf=1.174 CH 3 OH / 25 mm リン酸緩衝液 ph7 (80/20) TF=1.972 CH3CN / 25 mm リン酸緩衝液 ph7 (55/45) 6 8 10 12 14 min カラム :L-column ODS 5μm,4.6 150 mm 流量 :1 ml/min; 温度 : 40 ; 検出 : UV 225 nm 試料 : アミトリプチリン in CH 3 CN; Inj.vol.1 ml メタノールが残存シラノールと水素結合するため 塩基性化合物は残存シラノールと相互作用できない 51

解離性化合物 温度を高くする 1 2 3 Tf 3 =1.117 60 Tf 3 =1.262 50 Tf 3 =1.458 40 カラム :L-column2 ODS 3μm, 4.6 150 mm 移動相 :CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph7(35/65) 流量 :1 ml/min 試料 :1. パロキセチン 2. シタロプラム 3. フルオキセチン各 2μL Tf 3 =1.656 30 2 1 3 Tf 3 =1.806 20 0 10 20 H 3 C NH 温度が高くなると塩基性化合物と残存シラノールの間の吸脱着速度が速くなり テーリングが改善される O CF 3 3. フルオキセチン 52

解離性化合物 高度にエンドキャッピングされたカラムを使用する Tf=1.161 Tf=1.489 L-column2 ODS L-column ODS 0 5 10 15 カラム : 5μm, 4.6 150 mm 移動相 :CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph7(30/70) 流量 :1 ml/min 温度 :40 試料 : プロプラノロール 残存シラノールのほとんどない ODS では 中性緩衝液でも良いピーク形状が得られる 53

分離の改善 分離の改善 N α 1 k R s = 4 α 1+ k Rs : 分離度, N : 理論段数 α: 分離係数, k : 保持係数 N を高くする カラムを長くする 粒子径を小さくする 注入溶媒として貧溶媒を使用する 温度を高くする 分析条件の変更 ph 温度 有機溶媒の種類 αの増大 移動相の組成を変える k の増大 カラム種類の変更 高度にエンドキャッピングしたカラム N の増大 充填剤修飾基 αの増大 54

分離の改善 粒子径を小さくする 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1) サルファジアジン 2) サルフィソミジン 3) サルファチアゾール 4) サルファメトキサゾール 5) サルファメラジン 6) サルファモノメトキシン 7) サルファドキシン 8) サルファメトキシピリダジン 9) サルファジミジン 0 5 10 15 5 μm 4.6 150 mm N 7 =11781 Rs(8,9) =0.881 0 5 10 15 3 μm 4.6 150 mm N 7 =20230 Rs(8,9)=1.409 粒子径を小さくすることで分離がよくなる 55

分離の改善 有機溶媒の種類の変更 (a) 1 2 (a) メタノール / 10mM 酢酸アンモニウム (15/85) R S (1,2)=6.576 α(1,2)=1.80 (b) 1 2 0 5 10 (b) アセトニトリル / 10mM 酢酸アンモニウム (10/90) R S (1,2)=1.898 α(1,2)=1.21 カラム :L-column ODS 5μm,4.6 150 mm; 試料 : サルファ剤 移動相の溶媒を変えることで分離が改善される場合がある 56

分離の改善 移動相の組成を変えて溶出を遅くする メタノール比率 2+3 25% 20% 2 3 R S (2,3)=0.898 k(3)=0.885 R S (2,3)=1.064 k(3)=1.473 15% 2 3 R S (2,3)=1.468 k(3)=1.606 10% 2 3 R S (2,3)=1.463 k(3)=5.104 0 10 20 カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 移動相 : メタノール /10 mm 酢酸アンモニウム 保持係数が 2.5 (150 mm のカラムで約 5 分 ) 以下のときは遅く溶出して分離させる 57

分離の改善 温度を高くする 1 2 3 60 50 40 F カラム :L-column2 ODS 3μm,4.6 150 mm 移動相 :CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph7(35/65) 流量 :1 ml/min 試料 :1. パロキセチン 2. シタロプラム 3. フルオキセチン各 2μL N NH 2 1 3 30 20 0 10 20 物質によって保持の温度依存性が異なる ( 一般的には 温度が高くなると保持は早くなる ) O O O 1. パロキセチン O N 2. シタロプラム F 58

分離の改善 高度にエンドキャッピングしたカラムの使用 2 F O NH A 1 O O 1. パロキセチン B N 0 5 10 15 O F カラム : A: 他社カラム 5μm, 4.6 150 mm B: L-column2 ODS 5μm, 4.6 150 mm 移動相 :CH 3 CN/25 mm リン酸緩衝液 ph7.0 (33/67) N 2. シタロプラム エンドキャッピングが十分なカラムへ変更することで分離が改善される 59

試料の注入テクニック試料溶液の溶媒比率とピーク形状の関係 試料溶媒のメタノールの割合を変化 メタノール比率 50% 0 5 10 15 サンプル溶媒組成に対するクロマトグラムの変化 60% 70% 80% 90% 20 カラム :L-column ODS 5μm, 2.1x150 mm 試料 :17b- エストラジオール ( 濃度 : 1 μg/ml) 移動相 : メタノール / 水 (55/45) 流量 :0.2 ml/min 注入量 :100 μl 有機溶媒比率が高いとピーク形状が悪くなる 60

試料の注入テクニック 試料溶媒の組成と注入量による理論段数の変化 110% 100% 40% アセトニトリル 60% アセトニトリル 90% 分析条件 理論段数の変動率 80% 70% 60% 50% 40% 80% アセトニトリル 80% アセトニトリル 100% アセトニトリル カラム :L-column ODS 5μm, 4.6 150 mm 移動相 : アセトニトリル / 水 (60/40) 試料 :1 mg/ml ナフタレン 30% 20% 0 10 20 30 40 50 注入量 (μl) 移動相と同じ組成だと理論段数が変化しない 61

試料の注入テクニック 試料溶液中の有機溶媒が多い場合ピーク形状が悪くなる理由 有機溶媒 100% 試料溶媒 水の比率の多い試料溶媒 バンド幅が最初から広い! カラム入口部で一旦濃縮される 試料溶媒の基本は移動相と同じ組成 注入量は 精度や感度に問題の無い範囲で少なく設定する 62

試料の注入テクニック カラム内径と注入量 理論段数の変動率 100% 90% 50% 内径 4.6 mm 内径 3.0 mm 内径 1.5 mm 内径 2.1 mm カラム :L-column ODS 5μm, 150 mml. 移動相 : アセトニトリル / 水 (60/40) 試料 : ナフタレン (1 mg/ml, アセトニトリル溶液 ) 0 2 4 6 8 10 注入量 (μl) 内径が小さいほど注入量によって理論段数へ影響 63

上手なカラムのダウンサイジング 内径 3 mm カラムの上手な使い方 変更項目 旧型式 HPLC 理論段数 新型式 HPLC 4.6 150 mm カラムを3.0 150 mmへ変更配管を0.13 mmへ変更セミミクロ用セルに変更 12733(100 %) 9848 (77 %) 9981 (78 %) 11680 (91 %) 11888(100 %) 10690 (89 %) 11266 (94 %) 11467 (96 %) 内径 3 mm カラムは HPLC の型式及びセル容量の影響を受け易い 64

上手なカラムのダウンサイジング 1 セミミクロカラムの上手な使い方 ポンプ 配管の内径 長さ カラム 検出器 移動相 インジェクター セルボリューム 廃液 システムの変更カラムは4.6 150 mm カラムを2.1 150 mmに変更セミミクロ用のセルに変更セミミクロ用のインジェクターに変更 理論段数 13000 (100 %) 8936 (69 %) 11537 (89 %) 11621 (89 %) セミミクロカラムはデッドボリュームの影響を受け易い 65

上手なカラムのダウンサイジング 2 セミミクロカラムの上手な使い方 配管の内径と長さの理論段数への影響 2.1 150 mm のカラムでのナフタレンの理論段数 内径 (mm) 0.13 0.25 250 12548 (108 %) 11621 *1 (100 %) 長さ (mm) 550 12464 (107 %) 11495 (99 %) 1050 12576 (108 %) 10356 (89 %) *1: 内径 0.25 mm 長さ 250 mm の配管を使用時の理論段数を基準 (%) 配管の内径が 0.25 mm のとき 理論段数が低い 配管の内径が 0.13 mm のとき 長さは理論段数に影響しない 66

2μmODS カラムの使用 データ収集間隔 データ収集間隔とピーク高さの変化 1 ピーク高い 間隔狭く 2 0.8s 0.1s 0.05s 0.025s 3 4 LC:Agilent 1200SL カラム :L-column2 ODS 2μm 2.1 50 mm 移動相 :CH 3 CN/H 2 O(50/50) 流量 :0.6 ml/min 温度 :25 検出 :UV254 nm 注入量 :0.5μL 試料 :1. ウラシル 2. ベンゼン 3. トルエン 4. ナフタレン 0 1 2 保持時間 保持時間の短いピークはデータ収集間隔を狭くする 67

2μmODS カラムの使用 データ収集間隔 データ収集間隔の選択の目安 2.1 50 mm の場合 保持時間 (min) 0.3 流量 (ml/min) 0.6 0.9 0.5 0.05 0.025 0.025 データ収集間隔 (sec) 1 0.1 0.05 0.025 2 0.1 0.1 0.05 3 0.2 - - t 0 (min) 0.416 0.217 0.149 使用装置 :Agilent 1200SL 流量 保持時間により最適なデータ収集間隔は異なるので適切な値を選択する ただし 増やしすぎるとノイズが大きくなる 68

2μmODS カラムの使用 110.0 耐久性に及ぼすフィルターの効果 理論段数の安定率 ( % ) 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 フィルターあり フィルターなし 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 注入回数 カラム :L-column2 ODS 2μm 2.1 50 mm 移動相 :CH 3 CN/H 2 O(60/40) 流量 :0.6 ml/min, 温度 :25 検出 :UV254 nm, 注入量 :0.5μL 試料 : ナフタレン フィルター使用で 耐久性が向上する 移動相や試料はろ過する 移動相や試料の時間を経たものは再調製する 69

内容 < 基礎 > ODS の構造と特性移動相緩衝液 < 分析方法のノウハウ > 解離性化合物分離の改善試料の注入テクニック上手なカラムのダウンサイジング 2μmODS カラムの使用 < トラブルシューティング > 保持時間が変化したピーク面積が変化した水系 100% に近い移動相 SN を大きくするカラムの洗浄と保管 70

保持時間の変化 対処方法 1 保持時間が変化した 液漏れ確認 : 接続タイプのチェック 増し締め シール交換 3 2 圧力の変動 : エア抜き チェックバルブ洗浄 設定条件の確認 : 流量 移動相組成 温度 4 7 移動相が置き換わるまで待つ カラム交換 送液ポンプ インジェクター カラム 恒温槽 検出器 8 サクションフィルター洗浄 交換移動相 5 クーラー無しのオーブンの設定温度は室温プラス 10 以上 廃液 6 再調製 ph の確認 移動相の脱気 71

ピーク面積の変化 対処方法 ピーク面積が変化した サンプルの保管条件十分に攪拌する試料溶媒の変更 吸着しないカラムへ変更 送液ポンプ インジェクター カラム 恒温槽 検出器 移動相 適切な容量のシリンジシリンジ内の気泡洗浄回数の変更 洗浄液の変更 波形処理の見直し S/N が小さい 廃液 72

水系 100% に近い移動相 水系 100% に近い移動相の場合 水系 100% に近い移動相でカラム圧を下げると 保持時間が短くなるトラブルが発生する ギ酸 酢酸 オリジナル 保持時間減少 保持時間回復 L-column2 ODS 4.6 150 mm, 移動相 : アセトニトリル /20mM リン酸 (5/95) 73

水系 100% に近い移動相 水系 100% に近い移動相の場合 細孔から移動相が抜け出て表面積が小さくなるために保持時間が短くなる 通常 移動相 水系 100% 移動相 充填剤 細孔 充填剤 空隙 有機溶媒比率の高い移動相で一旦置換し ポンプを止めずに分析する 溶媒 / 水 (50/50) 以上の移動相での置換が必要である ( 置換時間は 10 分で十分 ) 74

SN を大きくする 1SN を大きくする ( シグナルを大きく ) 試料溶媒の水の比率を増加 ( 移動相と同じ組成へ ) グラジェントを行う 理論段数の高いカラムへ変更内径の細いカラムに変更 移動相 送液ポンプ インジェクター 溶媒比率を増やし 溶出時間を短くする 注入量の増加濃縮カラムの使用 カラム 恒温槽 検出器 吸収の大きい波長を選択 蛍光など検出器の変更 廃液 75

SN を大きくする 2SN を大きくする ( ノイズを減らす ) 検出器の温度変化を減らす 移動相 送液ポンプ インジェクター カラム 恒温槽 検出器 ランプの交換セルの洗浄 交換 廃液 吸収の少ない溶媒と試薬を使う 76

カラムの洗浄と保管 カラムの詰まりを防ぐには 試料 移動相 ( 緩衝液 ) はあらかじめろ過する ( 試料は移動相に溶かしてから ろ過する ) 緩衝液を含んだ移動相を流す前に一旦塩を抜いた移動相を流す 緩衝液を含んだ移動相を使った後 長期間使わないときはカラムを洗浄する 前処理の再検討 ( 試料の夾雑物を減らす ) 分析条件の再検討 ( 注入量 塩濃度 ) システムのメンテナンス ( プランジャーシールの交換 ) ガードカラムの使用 日常の圧力をチェック ( 早期発見 ) 77

カラムの洗浄と保管 ODS カラムの洗浄方法 実施例 : 使用した移動相メタノール / リン酸緩衝液 (20/80) カラム L-column ODS 4.6 150 mm 1. 塩等を取り除いた移動相 : メタノール / 水 20/80 2. 有機溶媒の濃度を上げた移動相 : メタノール / 水 60/40 3. 有機溶媒 100% で洗浄 : メタノール 100% カラム容量の 10 倍程度の量で洗浄する (1 ml なら約 30 分間 ) 脂溶性の夾雑物を多く含む試料の場合 THF( テトラヒドロフラン ) 次にアセトニトリルで更に洗浄する ただし 無駄な洗浄はカラムの劣化を促進させる 78

おしらせ ご案内 デモカラム L-column, L-column2 および G-column を対象に 購入前に最大 2 ヶ月間 分析条件や分離を試すことができます ホームページのご案内アプリケーションや技術資料など 最新の情報を掲載しています http://www.cerij.or.jp アンケートにご協力お願いします 79