AKT活性を抑制するペプチ ド阻害剤の開発 野口 昌幸 北海道大学遺伝子病制御研究所 教授 広村 信 北海道大学遺伝子病制御研究所 ポスドク 岡田 太 北海道大学遺伝子病制御研究所 助手 柳舘 拓也 株式会社ラボ 研究員 ナーゼAKTに結合するタンパク分子を検索し これまで機能の 分からなかったプロトオンコジンTCL1がAKTと結合し AKT の活性化を促す AKT活性補助因子 であることを見い出し た この結論はTCL1がAKTを介した細胞分裂 細胞死 アポ トーシス の抑制などを促進し 白血病やヒトリンパ系の腫瘍の 病因となっていることを明らかにした 2000 野口昌幸 実験医学 2000 図2参照 図2 研究の背景 TCL1-Akt 複合体モデル セリンスレオニンキナーゼAKT Protein Kinase Bの別称 は細胞死 アポトーシス を制御する重要な細胞内シグナル伝 達因子である 図1参照 AKTの活性化は乳癌 肺癌を始め 様々なヒト悪性腫瘍において病因となる 一方 プロトオンコジン TCL1はヒトT細胞芽球白血病をはじめ EBV感染症 Ataxia Telangiectasiaなど様々な悪性腫瘍でその発現が上昇してい る 図1 AKT.キナーゼは細胞死制御の要の分子である 我々はこれまで機能のわからなかったプロとオンコジンTCL1が AKTと２量体を形成を促すような形で複合形成し 活性化を促進 するAKT活性化補助因子であることを証明し ヒトT細胞芽球性白 血病の分子学的原因を明らかにした αβγ AKT/PKB する分子学的な機序を明らかにし Laine et al.,.2002 TCL１とAKTの結合ならびにTCL１の重合形 к к 我々はTCL1-AKT複合体内部でTCL１がAKTを活性化 成が共にAKT活性補助因子としての機能 アポトーシスの抑 制 細胞増殖 に必要不可欠のものであることを明らかにした AKTキナーゼは細胞内での細胞死 アポトーシス 制御の要の分 子であり 細胞外刺激によりPI3K, PDK1などのキナーゼを介して 活性化される 活性化されたAKTはBAD, FKHRL,IKBKなど様々 な分子と結合しリン酸化により細胞死 細胞増殖などの細胞反応 を制御している 申請者は 先にプロトオンコジンTCL1が細胞内のアポトーシ スを制御しているAKTキナーゼに結合し AKTを活性化する AKT活性補助因子 であることを明らかにし ヒトT細胞芽球 Kunstle et al.,. 2002 さらに AKT-TCL1 複合体の結晶構造解析を行い 特にAKTのPleckstrin Homology ドメインの構造を明らかにし 膜リン脂質PIP3との 構造的な関係を明らかにした Auguin et al., 2003;Auguin et al., et al., 2004; Auguin 2004 研究目的 AKTの活性化はヒトの様々な悪性腫瘍や血液疾患の原因 白血病の分子学的な原因を明らかにした AKT は細胞外からの刺激により細胞膜へ移行し AKTの 因子となっており 細胞死制御の要であるAKT活性化の制御 P Hドメインに 膜リン脂 質 P I P 3 が 結 合し P D K 1 は重要なポストゲノムの研究課題である しかし これまでAKT Phosphoinositide Dependent Kinase１ の働きにより活性 の活性を抑制する特異的阻害剤は有効なものがなかった 化される 活 性 化されたA K TはF K H R F o r k H e a d 我々は これまでの研究を元に細胞死を抑制する中心的な役 Transcription Factor BAD Nur77など様々な細胞内基 割を担う細胞内シグナル分子セリンスレオニンリン酸化酵素 質をリン酸化し アポトーシスや細胞増殖を制御する AKTの活性を特異的に阻害するペプチドを同定する 本研究 申請者はこれまでインターロイキン２のコモンガンマ鎖からの はアポトーシス制御など癌の基礎的研究のみならず TCL1遺 細胞内シグナル伝達因子の研究を続け セリンスレオニンキ 伝子の過剰発現や癌抑制遺伝子PTENの異常によるAKT 59
の活性化が背景となるヒト悪性腫瘍の治療薬開発につながる 図4 研究である 研究内容 私たちは図3に示すようなyeast two hybrid 法を用いて AKT分子に結合する細胞内分子のスクリーニングを行った この結果 これまで機能の分からなかったプロトオンコジン TCL1がAKTと結合し多量体を形成しAKTを活性化させる AKT活性補助因子 であることを示した この結果 TCL1 の異常により発症するヒトT細胞リンパ芽球性白血病TPLL T Cell Prolymphocytic Leukemia の分子学的な病因機序を 明らかにした Laine et al.,mol. Cell 2000; Laine et al., J. Biol. Chem. 2002 さらに Reversed Yeast Two Hybrid法 を用いたランダムアミノ酸ライブラリーを用いてプロトオンコジン TCL1がAKT PHドメインに結合するために必須な結合ドメイ ンのアミノ酸配列を同定した Kunstle et al., Mol Cell Biol. 1. 2002 また AKTのTCL1結合部位の結晶構造を明らかにし 標的ペプチドとAKTの結合に関する検討 野 生 型プロトオンコジンT C L 1はA k tのp l e c k s t r i n た Auguin et al., J. Biomol. NMR 2003 Homology Domain PH domain に結合する Akt-inペプチ 図3 ドはTCL1のAkt結合配列の一部である このペプチドがAkt 特異的結合分子の同定とその解析法 に結合するか否か あるいはもし結合すればどの部位と結合す るかを検討する必要がある このためリコンビナント蛋白を用い たPull Down Assay により 標的ペプチドの ＰＨドメイン選択 性ならびにAKT特異性を検証した 図5 Akt-inペプチドはと を介して結合する スライド 我々はYeast Two Hybrid 法を用いてAKTに結合する細胞内分 子を検索した さらにこれらのAKT結合分子の結合のAKT検証し そのリン酸化などのAKT活性への効果を検討した AKTとの結合 部位を結合分子のランダムライブラリーを用いて同定した 我々はこれらの生化学的 構造学的な研究を通し プロトオ ンコジンTCL1のAKT結合に必須なアミノ酸配列がTCL1の beta A sheetならびにｂe sheetからなる平面で形成される平 面であることを示した 本研究ではこれまでの研究により図4に 方法 βc GST TCL1のコントロールペプチドとともにAKT-in ペプチドを大腸菌にて作成した 示すこのTCL1のAKT結合平面も一部を形成するbeta A Akt-inペプチド: NH2-AVTDHPDRLWAWEKF sheetに相応するアミノ酸配列に基づいたペプチドakt-in COOH AVDTHPDRLWAWEKF を作成し AKT活性の抑制効 TAT-Flag Akt-in: NH2-YGRKKRRQRRR- 果 生化学的反応性 生物反応を解析しこのペプチドによる DYKDDDDK- AVTDHPDRLWAWEKF-COOH AKT阻害剤としての可能性を検証する コントロールペプチド βc: NH2- EKQHAWLPLTIECOOH 60
Akt-in ペプチドは Akt の活性を で抑制する M
Akt-in ペプチドはAKTとPtdIns(1,3,4,5)P4 結合を抑制する
Akt-in は in vitro での細胞増殖を抑制する