ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) ( 旧称 :New ELISA plate) 住友ベークライト株式会社 S- バイオ事業部 - 1 -
ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) の特長 当社独自の表面処理技術によりブロッキング 操作なしで低いバックグランドを提供します 血清などに含まれる種々タンパク質の非特異吸着を抑制します 予めブロッキング処理がされている為 ブロッキング剤 (BSA スキムミルクなど ) の選定が不要です ばらつきの少ない安定したバックグランドを提供します 専用の抗体固定化バッファを使用する事により短時間 (2~4 時間 ) で抗体をプレートに固定化する事ができます 自家蛍光が少ない素材を使用しています 約 120 の耐熱性があります ( 但し フレームはポリスチレン製の為 60 までの耐熱性です ) - 2 -
1 固定化原理 ウェル内面は弊社独自の低吸着表面を施している為 殆どのタンパク質は吸着しません 2 キットに付属の専用固定化バッファで固相化用抗体を希釈しウェルに分注するとバッファと表面処理層が反応し表面処理層がゲル化します その際 抗体がゲル内に取り込まれます ( 下中図 ) 3 固定化バッファを除去しますと抗体が固定化されます ( 下右図 ) ウェル ( 断面図 ) 固定化バッファ 抗体 タンパク質無吸着層 ゲル化する 固定化バッファ除去抗体が取り込まれる固定化 - 3 -
Abs. 450 nm ヒト血清の基板への非特異吸着性 当社品 : フ ロッキンク なしでヒト血清を分注後 抗ヒト IgG 抗体と反応他社品 :BSA またはスキムミルクによりフ ロッキンク した後 ヒト血清を分注 抗ヒト IgG 抗体と反応 2 1.6 1.2 ヒト血清 - ヒト血清 + HRP 標識抗ヒト IgG ( 他社品のみスキムミルク添加 ) 人血清人血清 0.8 0.4 * 他社品のみフ ロッキンク 有り 0 当社品他社品 BSA 他社品スキムミルク *Human Serum AB(20 倍希釈 ) と 1h 反応 当社品は他社品に比べてヒト血清の非特異吸着が少ないことが判ります - 4 -
ウェル間のシグナルばらつき (96 穴ウェル ) 吸光度 当社品 他社品 スキムミルク フ ロッキンク 他社品 BSA フ ロッキンク 平均値 1.030 1.229 1.265 標準偏差 0.037 0.033 0.032 CV (%) 3.592 2.749 2.552 ラットアルフ ミン Y HRP 標識抗ラットアルフ ミン抗体 ウサキ ギ由来抗ラットアルフ ミン抗体 * 他社品のみフ ロッキンク 有り ウェル間のばらつきを示す CV 値は 5% 未満の低い値です - 5 -
ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) 製品表 キット内容 96ウェルプレート (8ウェル 12 列 ) プレートシール 抗体固定化液 保存液 プロトコル 実験実施例 2 種等 品番 品名 枚 / ケース 希望小売価格 ( 税別 ) BS-X7310 ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) スターターセット 4 7,200 円 BS-X7311 ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) 20 30,000 円 BS-X7312 ELISA 用プレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) 50 65,000 円 - 6 -
応用例 1 Human IL - 4 Immunoassay Kit - 7 -
本キットのアッセイの流れ 試薬およびスタンダード抗原を調製する スタンダード溶液およびサンプルを各ウェル 100 ml ずつ分注し 室温で 2 時間静置 溶液を除き 3 回洗浄 ビオチン標識抗体溶液を各ウェル 100 ml ずつ分注し 室温で 1 時間静置 溶液を除き 3 回洗浄 ストレプトアビジン HRP 溶液を各ウェル 100 ml ずつ分注し 室温で 30 分静置 溶液を除き 3 回洗浄 基質液を各ウェル 100 ml ずつ分注し 遮光して室温で 25 分静置 停止液を各ウェル 100 ml ずつ分注し 450 nm の吸光度を測定する - 8 -
O.D. (A450) O.D. (A450) スタンダード抗原による検量線データ例 Human IL-4 Kit HS Standard Curve Human IL-4 Kit HS Standard Curve 3 0.3 2.5 0.25 2 0.2 1.5 0.15 1 0.1 0.5 0.05 0 0 25 50 75 100 125 0 0 2 4 6 8 10 antigen concentration (pg/ml) antigen concentration (pg/ml) 右図 : この領域を拡大したもの 感度 : < 1 pg/ml 検出レンジ : 2.0-125 pg/ml CV 値データ 高濃度中濃度低濃度濃度 (pg/ml) 125 31.2 2.0 CV 値 2.9% 4.3% 6.6% - 9 -
同時 日差再現性試験 (3 日間, N = 3) Human IL-4 Immunoassay Kit について 同時 日差再現性の検討として 3 日間 N = 3 で検量線を描くアッセイを行いました その結果 同時 日差再現性のある検量線が描けることを確認いたしました 抗原濃度 (pg/ml) 125 62.5 31.2 15.6 7.8 3.9 2.0 0 Ave. 2.9732 1.7526 0.9034 0.4760 0.2540 0.1560 0.1028 0.0612 1 回目 S.D. 0.0951 0.0417 0.0244 0.0385 0.0101 0.0036 0.0016 0.0043 CV(%) 3.2 2.4 2.7 8.1 4.0 2.3 1.5 7.0 Ave. 2.6064 1.4262 0.8376 0.4437 0.2495 0.1437 0.1019 0.0606 2 回目 S.D. 0.1526 0.0403 0.0114 0.0112 0.0152 0.0094 0.0047 0.0047 CV(%) 5.9 2.8 1.4 2.5 6.1 6.6 4.7 7.8 Ave. 2.8217 1.6592 0.8722 0.4741 0.2614 0.1491 0.1036 0.0532 3 回目 S.D. 0.1242 0.0564 0.0166 0.0095 0.0132 0.0019 0.0036 0.0018 CV(%) 4.4 3.4 1.9 2.0 5.0 1.3 3.5 3.4 S.D. : Standard Deviation CV : Coefficient Varidation - 10 -
血清サンプルでの同時再現性試験 Human IL-4 Immunoassay Kit において 以下の 3 水準の濃度 ( 高 中 低 ) の血清サンプルを 20 回測定した結果の平均値と CV 値を求めました その結果 どの濃度帯でも CV 値 7% 以下と良好な結果が得られました Sample 1 Sample 2 Sample 3 Mean (pg/ml) 89.53 15.43 3.01 SD 2.05 0.64 0.20 CV 値 2.29 4.15 6.72 SD : Standard Deviation CV : Coefficient Variation - 11 -
O.D. (A450) Human IL-4 Immunoassay Kit のプレートについて 4 での保存安定性を評価しました その結果 本プレートは 4 で 1 年相当の保存が可能であることが示されました ( 試験継続実施中 ) 3 2.5 保存安定性試験 Hu IL-4 Kit HS Standard Curve 2 1.5 1 0 ヶ月 1 ヶ月 1 年相当 0.5 0 0 25 50 75 100 125 antigen concentration (pg/ml) 保存方法 : プレートと乾燥剤 ( シリカゲルのパック ) をアルミ袋に入れ 脱気 シール - 12 -
O.D. (A450) 特異性試験 Human IL-4 Immunoassay Kit において 濃度 30 ng/ml で他の抗原との反応を実施しました その結果 以下の抗原はクロス反応性がないことを確認しました ヒト IL-1b, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-g, MIP-1b, G-CSF, TNF-a 3 Over range 2.5 2 1.5 1 0.5 0 IL-1b IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-8 IL-10 IL-13 IL-18 IFN-g MIP-1b G-CSF TNF-a - 13 -
Human IL-4 Immunoassay Kit の特長 高感度 : 1 pg/ml オーダーの検出が可能 安定的 : バックグラウンドが低いため 低濃度領域でも Cv 値 7% 以下の安定した測定が可能 定量性 : 再現性のある検量線が描けるため 定量的なサイトカインの検出が可能 感度 検出レンジ < 1.0 pg/ml 2.0-125 pg/ml 反応時間 3.9h 保存温度 2 ~ 8 製品外観 価格 未定 内容物 抗ヒト IL-4 モノクローナル抗体固定化プレート (96 ウェル ) ヒト IL-4 スタンダード抗原 スタンダード希釈液 ビオチン化抗ヒト IL-4 モノクローナル抗体 ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ (HRP) ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ (HRP) 希釈液 洗浄液 (10 倍濃縮品 ) 基質液 (TMB) 停止液 (1N 硫酸 ) プレートシール プロトコール ( 冊子 ) 品番品名包装希望小売価格 ( 税別 ) BS-80421 Human IL-4 Immunoassay Kit 8 ウェル 12=96 ウェル 55,000 円 - 14 -
応用例 2 Avidin Plate - 15 -
S-BIO Avidin Plate の特長 1. 当社独自の表面処理技術によりフ ロッキンク 操作なしで低いバックグランドを提供します フ ロッキンク 剤 (BSA, スキムミルクなど ) の選定の手間が不要です ハ ラツキのない安定したバックグランドを提供します 2. 強固なアヒ シ ン ヒ オチン反応をつかってヒ オチン化生体分子を結合します 糖鎖 ペプチドなどの低分子化合物も固定化できます 品番 品名 包装 希望小売価格 ( 税別 ) BS-X7603 アビジンプレート ( フ ロッキンク レスタイフ ) 5 枚 / ケース 25,000 円 - 16 -
O.D.(A450) 特長 1 低いバックグラウンド 評価プロトコール HRP 標識タンパクを分注し 1 時間静置弊社品 :PBST でタンパクを希釈他社品 :PBST+0.1%BSA でタンパクを希釈 PBST 300uL でプレートを 3 回洗浄 TMB で発色し 450nm の吸光度を測定 アビジン 表面処理層 プレート BSA-HRP IgG-HRP Streptavidin(SA) -HRP 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 当社品他社品 A 他社品 B BSA-HRP IgG-HRP SA-HRP HRP 標識タンパク質のプレートへの非特異吸着量を比較した例です 3 種類の HRP 標識タンパク質 (BSA Mouse-IgG Streptavidin) をプレートに分注して吸着させた後 3,3,5,5 テトラメチルベンジジン (TMB) を HRP の基質として用い 基質の発色度からプレートへのタンパク質の非特異吸着量を比較しました タンパク質の種類によらず低いバックグラウンド を示すと共に ブロッキングの工程を省く事による作業の効率化を実現しました - 17 -
O.D.(A450) 特長 2 高いビオチンの固定化能 評価プロトコール ヒ オチン -HRP を各濃度に調整し分注 30 分静置弊社品 :PBST でタンパクを希釈他社品 :PBST+0.1%BSA でタンパクを希釈 PBST 300uL でプレートを 3 回洗浄 ビオチン化 HRP アビジン表面処理層プレート TMB で発色し 450nm の吸光度を測定 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6 8 ビオチン化 Biotin-HRP(ng/mL) HRP(ng/mL) 当社品他社品 A 他社品 B ビオチン化 HRP の固定化量を比較した例です アビジンプレートにビオチン化 HRP 溶液を分注して固定化させた後 3,3,5,5 テトラメチルベンジジン (TMB) を HRP の基質として用い 基質の発色度からビオチン化 HRP の固定化量を比較しました 高いビオチン化分子の固定化能を示します - 18 -
実験例 : サンドイッチ ELISA による CRP 検出 CRP 検出サンドイッチ ELISA プロトコール ビオチン標識抗 CRP 抗体をアビジンプレートに分注し 室温で1 時間静置する 各濃度の精製タンパクCRPを100mLずつ分注し 37 で1.5 時間静置 HRP 標識抗 CRP 抗体溶液を各ウェル100mLずつ分注し 37 で1 時間静置 基質液を各ウェル100mLずつ分注し 遮光して25 分静置 停止液を各ウェル 100mL ずつ分注し 450nm の吸光度を測定する 溶液を除き 3 回洗浄洗浄液 :0.05%Tween20 0.2%BSA in TBS - 19 -
吸光度 @485 実験例 : サンドイッチ ELISA による CRP 検出 1.2 1 0.8 住べ 他社品 A 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 抗原濃度 (ng/ml) ブロッキング無しで 他社品同等以上の結果が得られます - 20 -
ウェル間のシグナルばらつき (96 穴ウェル ) ヒ オチン -HRP を 10ng/mL の濃度に調整し 96 穴プレート全ウェルに分注 30 分静置 洗浄 0.05%TX100 in PBS 300uL,3 回 発色 当社品 A 他社品 Ave. 1.456 1.333 Std. 0.042 0.033 CV(%) 2.872 2.454 ウェル間のばらつきが 5% 以下と低いです - 21 -
Avidin Plate プロトコール 1. 洗浄 フ レートを Tween 系 Triton 系界面活性剤溶液溶液 ( 推奨 0.05 % Tween 20 PBS) で 3 回洗浄する 2. ビオチン化分子の固定 ビオチン化分子溶液を Tween 系 Triton 系界面活性剤溶液 ( 推奨 0.05 % Tween 80 PBS) で任意の濃度に希釈する 例 )HRP 標識ビオチン :0.1~6 ng/ml に希釈して使用 各ウェルに 100 ml ずつ分注して室温で 1 h 静置する 基板を洗浄する - 0.05 % Triton X-100 リン酸バッファ 300 ml 分注後 タッピング を 3 回行う 3. 固定化した分子を用いたアッセイ 分注する試料を Tween 系 Triton 系界面活性剤溶液 ( 推奨 0.05 % Tween 80 PBS) で任意の濃度に希釈して使用する 洗浄は 0.05 % Triton X-100 リン酸バッファ 300 ml 分注後 タッピング を 3 回行う 4. 標識抗体の検出 ペルオキシダーゼによる発色の吸光度を測定する 例 ) スミロンペルオキシダーゼ用発色キット T を用いた場合 発色液 (TMBZ 発色剤 : 基質液 =100:1 に混合 ) を各ウェルに 100 ml ずつ分注し室温で 15 min 静置する 停止液を各ウェルに 100 ml ずつ分注して反応を停止する 吸光度を測定する (450 nm) - 22 -
お知らせ PCR 用チューフ (200μL 用 ) にアビジンをコートした Avidin tube も別途販売しております アヒ シ ンコートされたマイクロビーズやスライドガラス ( 素材はプラスチック ) なども開発中です ご興味ございましたらご相談下さい - 23 -
お問い合わせ先 住友ベークライト株式会社 S-バイオ事業部マーケティンク 営業部五十嵐 E-mail : s-bio@sumibe.co.jp TEL : 03-5462-4831-24 -