H.24 年度前期雑誌会 1 Critical Factors of Vanillin Assay for catechins and Proanthocyanidins カテキンとプロアントシアニジンに対するバニリン試験の決定因子 著者 : Baoshan Sun, Jorge M. Ricardo-da-Silva, and Isabel Spranger 雑誌 : J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 4267-4274 紹介者 : 秋元美桜 (M2) 紹介日 : 2012.5.25
I n t r o d u c t i o n 2 プロアントシアニジン (PA) 自然界に広く存在する天然高分子 構成ユニットはflavan-3-ol( カテキン類 ) 植物由来食品で 栄養や感覚刺激特性に関して重要な役割を担う 様々な生理活性を有する ( 抗動脈硬化作用 抗酸化作用 ) カテキン類 (flavan-3-ol) B H H A C (+)-Catechin [(+)-C] ( )-Epicatechin [( )-EC] H R 1 4 R 2 Flavan-3-ol PA 含有量の評価 3 subunit 1 4 8 B H Folin-Ciocalteu 法 5 7 2 R 1 n A C 6 3 塩酸 -Bu 分解 R 2 5 4 C バニリン試験 H 8 R 1 G: Galloyl R 2 R 1 = H or R 2 = H or G
I n t r o d u c t i o n 3 PA 含有量の評価法 Folin-Ciocalteu 法 フェノール性 基の還元力に基づく試験法 特異性が低い それぞれの 基は感度が異なる Folin-Ciocalteu 試薬 3H 2 P 2 5 13W 3 5Mo 3 10H 2 3H 2 P 2 5 14W 3 4Mo 3 10H 2 フェノール性化合物 e - Basic condition 有色化合物 λ max 750 nm 塩酸 -Bu 分解 熱酸溶液中で PA をアントシアニジン (λ max 550 nm) へ分解 PA に非常に特異的 完全に分解せず 収率は PA の重合度と構造の影響を受ける 副反応としてポリマー (λ max 450 nm) の生成が起こる H R 1 H R 1 アントシアニジン λ max 550 nm H R 2 R 1 HCl / butanol Fe 3+ heat + R 2 R 2 R 1 = H or R 2 = H or galloyl H R 2 R 1
I n t r o d u c t i o n 4 バニリン試験 芳香族アルデヒド バニリンとの反応により有色化合物 (λ max 500 nm) を得る H + H H + H meta- 配向ジフェノール Catechin Vanillin Vanillin adduct λ max 500 nm (Hagerman, 2002) Flavanol( モノマーおよび多量体 ) meta- 配向のヒドロキシ基を持つ dihydrochalcone (Sarkar and Howarth, 1978) 感度 特異性 簡便さの点で優れている 再現性の欠如が示唆されている 研究目的 反応に影響するファクター正確性と再現性について確かめる 適切な反応条件を提案
E x p e r i m e n t a l 5 H Catechin + H Vanillin H + Me H Vanillin adduct λ max 500 nm 試料または標準物質 (120 mg/l Me 溶液 ) カテキン類 PA Grape seed より抽出 H H 1 (+)-Catechin [(+)-C] 2 ( )-Epicatechin [( )-EC] 3 PAオリゴマー 4 PAポリマー 重合度 : 2 ~ 12-15 重合度 : >12-15 試薬 a: バニリン / Me 試薬 b: HCl or H 2 S 4 / Me FACTRS 試料溶液 1 ml 120 mg/l 試薬 a 2.5 ml + + 1 %(w/v) (0.5 2.0 % (w/v)) 試薬 b 2.5 ml 9.0 N (1.8 9.0 N) 5-35 ºC 0-30 分 UV-Vis analysis バニリン濃度 酸の種類と濃度 反応温度 反応時間 含水量 妨害物質
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 6 1-1) 酸濃度の依存性 ((+)-C) Figure 1. Standard curves of (+)-catechin for vanillin assay established at various HCl concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ± SD. Figure 2. Standard curves of (+)-catechin for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ± SD. 良い線形性 (R 2 > 0.998) 酸の規定度が増加するにしたがい A 500 が増加 A 500 (HCl) << A 500 (H 2 S 4 ) 酸 触媒的な働き 目的としている反応の進行バニリンの自己反応 PA の分解 酸濃度は高いほど応答は良いが極端に高濃度は避けるべきである
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 7 1-2) 酸濃度の依存性 (PA) Figure 3. Standard curves of purified oligomeric PA for vanillin assay established at various HCl concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. Figure 4. Standard curves of purified oligomeric PA for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. R van/cat と比べ 酸濃度による影響は小さい ( 直線の傾き変化 ) R van/cat と比べ 酸の種類による影響は小さい (Fig.3, 4 の吸光度変化 ) A 500 (HCl) < A 500 (H 2 S 4 ) Butler ら (1982) は 反応感度と再現性の改善のため 溶媒をメタノールから氷酢酸に変更 溶液中の酸性度
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 8 2) 反応時間 Figure 5. Effect of reaction time on A 500 of vanillin reaction with (+)-catechin. (+)-Catechin concentration = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. Figure 6. Effect of reaction time on A 500 of vanillin reaction with purified oligomeric PA. Purified oligomeric PA concentration = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. 反応は速く A 500 は反応時間に因らずほぼ安定 極大値が見られる ( 反応は遅く 退色もしやすい ) 酸濃度 : 高いほど値が安定 反応時間 : 15 25 分 反応時間 : A 500 が極大値をとる時間 酸濃度 : 高いほど良い
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 9 3) 反応温度 PA 温度に依存しない 反応温度 : R.T. (+)-C A 500 は温度に依存する 反応温度 : 25 35 ºC に固定 反応溶液をさらに異なる温度で 10min インキュベーションしたとき A 500 が異なる値を与え 温度と A 500 の関係は Fig. 7 と一致 反応は 5-35 ºC の範囲で可逆的 参考 ) バニリン反応の可逆性 (Dalby and Shuman, 1978) Figure 7. Effect of reaction temperature on A 500 of vanillin reaction with (+)-catechin and purified oligomeric PA. Concentrations: (+)-catechin = 120 mg/l; purified oligomeric PA = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD.
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 10 4) 水分 水分量の増加に伴い A 500 が著しく減少 溶媒 : 無水メタノール 3%(v/v) 水 (+)-C: 56 59% 減少 PA: 33 38% 減少 Levasseur の理論 (Cabannes, 1953) 有機溶媒中の実質的な ph は 溶液中の水の量に強く依存 H 2 S 4 と HCl が同じ規定度の場合 A 500 (H 2 S 4 ) > A 500 (HCl) Figure 8. Effect of water content in reaction medium on A 500 of vanillin reaction with (+)-catechin and purified oligomeric PA. Concentrations: (+)-catechin =120 mg/l; purified oligomeric PA = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. H 2 S 4 ( 市販 ) 純度 96 98% 水 2-4% HCl( 市販 ) 純度 35 37% 水 63 65% 大量の水を含む低い吸光度の原因 しかしながら カテキンと PA で影響が異なることは説明できない
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 11 5) バニリン濃度 反応を完全に進行させるためにバニリンは試料に対して過剰量が必要 > 1 %(w/v) で それ以上増加しない 高濃度で 自己縮合反応の可能性 (Broadhurst and Jones, 1978) 1-1.2 %(w/v) が推奨される 参考 ) Figure 9. Effect of vanillin concentration in reagent a on A500 of vanillin reaction with (+)-catechin and purified oligomeric PA. Concentrations: (+)-catechin = 120 mg/l; purified oligomeric PA = 120 mg/l. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. 試薬 a (1 %(w/v), 2.5mL) 10 g / L 2.5mL 27.4mM 152.15 g / mol 6.0 ml カテキン溶液 (120 mg/l, 1.0 ml) 120mg / L 1.0 ml 0.0689mM 290.27 g / mol 6.0 ml 397 倍
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 12 6) 標準化合物 Figure 2. Standard curves of (+)-catechin for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ± SD. Figure 4. Standard curves of purified oligomeric PA for vanillin assay established at various H 2 S 4 concentrations. Each point is a mean of three replicate measurements ±SD. カテキンと PA ではバニリンとの反応性が異なる カテキンを標準として用いると PA の定量が正確に行えない
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 13 6) 標準化合物 サンプル試験 Grape seed のメタノール抽出物からあらかじめカテキン類を除去したサンプル 2 種 (PA オリゴマーを豊富に含む ) それぞれの検量線を用いて計算した PA 濃度 (PA オリゴマー換算濃度 カテキン換算濃度 )
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 14 吸光度 A500 は試料濃度 [C] および酸濃度 [H + ] に依存しているので A 500 カテキン : A f ([ C][ H ]) [C] : 試料濃度 (mg/l) [H + ] : 試薬 b 中の硫酸濃度 (5-25 %(v/v), 1.8-9.0 N) PA: (1) 0.02[ C] cat[ H ] 0.015 2 ( R 0.989, n 20) 500 A500 0.00575[ C] pro([ H ] 0.2625) 0.014 2 ( R 0.995, n 20) (2) (3) 一方 同じ濃度のカテキンと PA オリゴマーが同じ A 500 を与える酸濃度 [H + ]* を計算すると [ C] cat [ C] pro, A500 A500 d A d A 500 500 0.020[ C] cat[ H ]* 0.015 0.00575[ C] pro([ H ]* 0.2625) 0.014 0.02[ H ]* 1 0.00575([ H ]* 0.2625) [ H ]* 0.106 10.6% より (7) (8) (9) カテキンとPAが同じ濃度とき すなわち [ C] cat [ C] pro [ C] のとき 酸濃度依存性は カテキン : PA: 式 (4) (5) より d A d [ H d A d [ H 500 500 d A d [ H 0.02[ C] ] 0.00575[ C] ] 500 ] d A d [ 500 H 3.48 ] (4) (5) (6) カテキンの反応は PA の反応の 3.5 倍 酸濃度の影響を受けやすい 硫酸濃度を 10.6%(ca. 3.6 N) に設定するとカテキンと PA を同等に扱うことが出来る PA 含有量を過大に見積もる ; 3.3%(v/v) HCl (Price et al., 1978) PA 含有量を小さく見積もる ; 46.7%(v/v) H 2 S 4 (Scalbert et al., 1989, Scalbert., 1992) 2 つの矛盾する主張は A 500 の酸濃度の依存性によって説明できるもしくは塩酸中の水の影響 その一方で 呈色の安定性と感度の観点より あらかじめサンプル中のカテキン類とPAを分離し別々に高濃度のH 2 S 4 を用いて定量することがしばしば必要になる
R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n 15 7) 妨害物質 アスコルビン酸 アスコルビン酸塩 - 2H 反応を妨害 酸化力の強い H 2 S 4 と反応していると考えられる 非常に酸化を受けやすい アントシアニジン (490-540 nm に吸収 ) バニリンとは反応しないが 吸収帯が重なる適切なブランクを用いることで対処可能 H フェノール酸 H H H H H H H ケイ皮酸 p- ヒドロキシ安息香酸カフェ酸没食子酸 p- クマル酸シリング酸 非フラバノール H H H ケルセチンケンペロールミリセチン バニリンとは反応しない反応の妨害もしない
C o n c l u s i o n 16 バニリン試験 (1) 試料中のPAからカテキンの分離し それぞれに対し定量を行う (2) 溶媒には無水メタノールを用いる (3) H 2 S 4 濃度を 7.2-9.0 Nにし その濃度を厳重にコントロールする (4) 検量線の作成に 試料と同種のPAを標準品に用いる (5) 妨害物質を除去し 適切なブランクを使用する (6) カテキン量の推定において 反応温度を制御し 反応時間は15 分に固定する PA 量の推定では反応は室温で行い A 500 が最大となる時間を反応時間とする
H A H C A B B C H A H H C B H H H A C H B 18 (4 8) (4 6) (2 7, 4 8) B-type proanthocyanidin A-type proanthocyanidin Structure of dimeric proanthocyanidins H H H H H + H + H H + H + oxidation Anthocyanidin Catechin dimer (Proanthocyanidin) Hypothetical reaction mechanism explaining the acid-catalyzed cleavage of proanthocyanidins H Catechin
H + H H H H H H + H -H 2 H 19 Hypothetical reaction mechanism explaining the reaction of vanillin with (+)-catechin H H H H H + H + H xidation H + H H + H H
Charge distribution of (+)-catechin 20 DFT B3LYP Mulliken
Y (Absorbance) Y (Absorbance) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 λ max 499 nm 試料 : 0 100 μg/ml (+)-catechin monohydrate 硫酸 バニリン添加室温 15 分反応 25 ppm (+)-catechin 50 ppm (+)-catechin 100 ppm (+)-catechin 0 220 320 420 520 620 Wavelength (nm) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 λ max 504 nm 試料 : 0 100 μg/ml FDPT(110830) 硫酸 バニリン添加室温 15 分反応 25 ppm FDPT 50 ppm FDPT 100 ppm FDPT 0 220 320 420 Wavelength (nm) 520 620
Absorbance Absorbance 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 λ max 539 nm cf.) Acid-butanol assay 試料 : 0 100 μg/ml FDPT(110830) 硫酸添加 バニリン不添加室温 15 分反応 0 ppm FDPT (control) 25 ppm FDPT (control) 50 ppm FDPT (control) 100 ppm FDPT (control) 100 ppm FDPT (control) 4 day 0 220 320 420 Wavelength (nm) 520 620 Acid-butanol assay 0.8 室温における酸分解速度は遅い硫酸バニリン試験においてアントシアニジンは生成しない 0.6 0.4 0.2 FDPT 0.6 N HCl / 1-butanol, Fe 3+ Heat at 100ºC, 50 min 0 220 320 420 Wavelength (nm) 520 620
23 H H H H H H H H H H H H
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