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in situ PCR
研究室 in situ PCR 標的菌種と遺伝子 ( 報告年 ) 応用 Dept. of Marine Sciences University of Georgia USA Escherichia coli O157slt II Escherichia coli 16SrDNA Ralstonia eutropha phl (1997,1998,1999,2002) Pseudomonas aeruginosa naha Pseudomonas putida todc1 (1995,1997, 1997,1997) Dept. of Biotechnology Technical Univ. of Denmark Denmark 水産化学研究科 Salmonella typhimurium lacz, groel, tsf Serratia liquefacien flhdc (1997,1998,1999,2000,2000) Vibrio halioticoli alyvg2 (2000),, Southeast Environmental Research Center, Florida International Univ. USA 早稲田大学理工学部応用科学科 Nitrosococcus oceani cbbl (2001) Nitrosomonas europaea amoa (2001) In situ PCR
In situ PCR 2. 微生物数が少ない試料への対応 3. 手法の標準化
これまでの in situ PCR では主に DNA が標的 精度の向上には 1. 抗原 DNA RNA を同時に標的とする 2. より特異性の高いプライマーを使用する
< > In situ PCR (50~95 ) In situ LAMP (65 ) Polymerase *LAMP: loop-mediated isothermal amplification
5 5 5 3 2c 3c 5 Loop Target :130 ~ 200 bp 35~50 bp 3 1c 5c 4c 6c 5 4 6 2 3 1 3 4c 5 2c 1c 6
本研究でデザインしたプライマーおよびプローブリスト slt II ( ベロ毒素 ) slt II ( ベロ毒素 ) domain Bacteria 16S rdna Aeromonas hydrophila gyrb VT2B3 VT2F3 VT2 VT2FIP VT2BIP EUBFIP EUBBIP AhgBFIP AhgBBIP AhgBF3 AhgBB3 in situ PCR in situ PCR FISH after in situ PCR 5 -ATCAGTCGTCACTCACTGGT-3 5 -CCAGTTATCTGACATTCTG-3 5 -ATGCATCTCTGGTCATTGTAT-3 5 -GCGTTTTGTCACTGTCACAGCAGA TAGCCTGACGAAATTCTCTCTGT-3 5 -TGCTCTGGATGCATCTCTGGTCAT ATCTGGTTTCATCATATCTGGCG-3 5 -GGTAAGGGTCYTCGCGTWGCA TCAAAKGAATTGACGGGGGC-3 5 -CATGGCTGTCGTCAGCTCGTG TANGGGTTGCGCTCGTTG-3 5 -GTAGCAGAAGTGCGCCTCGC CCAGCTCTCCTTCCTCAACT-3 5 -ACCTGAACCAGAACAAGACCCC CACACCGATGCCATCCTG-3 5 -TACGAGATCCTGGCCAAGC-3 5 -GTTCCACTGCATCGCTACT-3 Kurokawa et al. 1997 Kurokawa et al. 1997 Aeromonas sobria gyrb AsgBBFIP AsgBBIP AsgBF3 AsgBB3 5 -GCCAGAAACGCACCTCGGTAC CAGGCACCACTCAAGCAG-3 5 -ACTACGAAATCCTGGCCAAGCG CACGCTCGTCATGCAGAC-3 5 -ACGAGCAGACCTATCACCT-3 5 -AAATGCACCTCACGACCAT-3
1.5 時間 パラホルムアルデヒド固定後, スライドガラスに滴下 酵素処理 2.5 時間 LAMP PCR 18.5 時間 FISH
O157 UV 励起 DAPI による核酸染色 : 全ての細菌 Blue 励起 FITC 標識抗 O157 抗体染色 : O157 抗原をもつ細菌 Green 励起 slt II 遺伝子の増幅 : ベロ毒素遺伝子をもつ細菌 + 蛍光抗体法 in situ PCR + 蛍光抗体法 サンプル : E. coli K12 と E. coli O157:H7 の混合試料 抗原と遺伝子を同時に標的として高精度に検出
16S rrna (rdna)
UV 励起 DAPI による核酸染色 : 全ての細菌 Green 励起 gyrb 遺伝子の増幅 : 特定細菌 Aeromonas hydrophila gyrb プライマー Aeromonas sobria gyrb プライマー サンプル : Arm. hydrophila と Arm. sobria の混合試料 gyrb 遺伝子を標的に近縁種を区別
In situ PCR
slt II UV 励起 DAPI による核酸染色 : 全ての細菌 Green 励起 slt II 遺伝子の増幅 : ベロ毒素遺伝子をもつ細菌 E. coli O157:H7 E. coli K12 試料を効率的に濃縮し, かつ定量性を向上
画像解析による微生物計数の迅速化 自動化 高精度化画像解析による微生物計数の迅速化 自動化 高精度化画像解析による微生物計数の迅速化 自動化 高精度化画像解析による微生物計数の迅速化 自動化 高精度化細菌をマルチカラー標識細菌をマルチカラー標識細菌をマルチカラー標識細菌をマルチカラー標識 DNA rrna 抗原抗原抗原抗原呼吸活性呼吸活性呼吸活性呼吸活性画像解析画像解析画像解析画像解析
DAPI ( ) ( ) 256 256 192 128 64 Detritus Bacteria 192 128 64 Detritus Bacteria 0 0 0 64 128 192 256 0 64 128 192 256
BACS 3 Cy3 FITC DAPI UV,Blue,Green 3 UV (DAPI) Blue (FITC) Green (Cy3)
BACS UV (DAPI), etc. Blue (FITC) Green (Cy3) 抗原陽性抗原陽性抗原陽性抗原陽性標的配列有標的配列有標的配列有標的配列有抗原陽性かつ抗原陽性かつ抗原陽性かつ抗原陽性かつ標的配列有標的配列有標的配列有標的配列有
BACS UV DAPI による核酸染色 : 全ての細菌 Blue GFP (): Green (): GFP *40
BACS (log cells / ml) 7 6 5 4 3 2 y=0.98x+0.085;r=0.99 1 1 2 3 4 5 6 7 7 6 5 4 3 2 y=0.98x+0.13;r=0.99 1 1 2 3 4 5 6 7 7 6 2 2 y=1.18x-0.87;r=0.97 y=0.91x+0.28;r=0.97 1 1 2 3 4 5 6 7 1 1 2 3 4 5 6 7 (log cells / ml) 7 6 5 4 3 5 4 3 E. coli (GFP)
SEM-ISH (in situ hybridization) による確認 試料 : Brevundimonas diminuta(α) および E. coli (γ) の混合試料 1 μm プローブ : Gold labeled GAM probe (23S rrna of γsubclass of Proteobacteria) 菌株 (Subclass of Proteobacteria) Brevundimonas diminuta (α) Comamonas testosteroni (β) Escherichia coli (γ) シグナルの有無 EUB NON ALF BET GAM + + + + - - - - - - - + - - +