サンプルのマルチプレックスおよび下流の解析におけるインデックスのミスアサインメントの影響

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るるみかいて
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1 サンプルのマルチプレックスおよび下流の解析におけるインデックスのミスアサインメントの影響インデックスのミスアサインメントの原因とインデックスホッピングの影響を軽減するベストプラクティスはじめに次世代シーケンス (NGS) 技術の改良によりシーケンススピードが大幅に向上しデータ出力が飛躍的に増加したことで現在のシーケンスプラットフォームにおいて大規模なサンプルの解析が可能になりました 10 年前 Genome Analyzer は 1 回のランあたりのシーケンスデータの出力が最大 1Gb でしたが今日では同様のコアテクノロジーに基づいた NovaSeq システムにより 2 日間で最大 2Tb のシーケンスデータを生成できます 10 年前と比較するとデータ出力量が 2,000 倍以上に増加しています 1 この飛躍的に向上したデータ出力量を有効に利用するためにはマルチプレックス法がカギとなりますマルチプレックス法はライブラリー調製時に各 DNA 断片にインデックスと呼ばれるユニークな配列を付加することで行いますこれによって一回のシーケンスランで同時に多数のライブラリーをプールしシーケンスできるようになりますマルチプレックス法によって得られたデータは最終のデータ解析前にプールしたそれぞれのライブラリーをインデックスの配列情報によってコンピューター上で振り分けるデマルチプレックスと呼ばれる複雑なプロセスを要します ( 図 1) マルチプレックス法におけるライブラリー間のインデックスのミスアサインメントはマルチプレックス法が開発された当初からシーケンスデータに影響すると知られていた問題です 2 本書はインデックスホッピングが起こりうるメカニズムインデックスホッピングの測定方法ならびにシーケンスデータの品質に関するインデックスホッピングの影響を低減させるためのベストプラクティスについて記述していますインデックスミスアサインメントの発生メカニズムインデックスの組み換えインデックスホッピング Exclusion Amplification(ExAmp) ケミストリーおよび整列化フローセル技術の開発はデータ出力量の増加コスト削減ラン時間の短縮など NGS 技術に重要な進歩をもたらしましたこの開発によって 1,000 ドルゲノムを含む幅広いアプリケーケーションに対応できるようになりました 3 しかし整列化フローセルで用いるクラスター形成は従来のブリッジ増幅を用いたクラスター形成よりも高い割合でインデックスのミスアサインメントを起こすことが確認されていました 4 インデックスホッピングはインデックスのミスアサイ図 1: マルチプレックス法とインデックスホッピングの概要マルチプレックス法ではライブラリー調製時に各 DNA 断片にユニークなインデックス配列を付加することにより 1 回のシーケンスで同時に複数のライブラリーをランすることが可能となりますシーケンスリードはデマルチプレックスを行うことによりそれぞれのサンプル毎に振り分けられ適切なアライメント結果が得られますインデックスホッピングはシーケンスリードの不正確なアサインメントを引き起こしリードのミスアライメントまたは下流の解析における不正確なデータの解釈につながる可能性があります

ンメントの原因となりますこれによりシーケンスリードが本来のインデックスではない同一プール中の別のインデックスが付加されたライブラリーに誤ってアサインされる可能性がありミスアライメントおよび不正確な解析結果を引き起こすことにつながります ( 図 1) インデックスホッピングは整列化フローセル中のインデックスのミスアサインメントの増加を引き起こす主な原因となります

2 ンメントの原因となりますこれによりシーケンスリードが本来のインデックスではない同一プール中の別のインデックスが付加されたライブラリーに誤ってアサインされる可能性がありミスアライメントおよび不正確な解析結果を引き起こすことにつながります ( 図 1) インデックスホッピングは整列化フローセル中のインデックスのミスアサインメントの増加を引き起こす主な原因となります遊離アダプターまたはプライマーの混入アダプターを核酸断片に結合した後遊離した非結合アダプターを除去するためにライブラリーを精製しますライブラリー精製はビーズを用いた方法またはゲル精製法によって行い遊離したアダプターやプライマーを除去することができます遊離したアダプターやプライマーの除去が十分でないと調製したライブラリーに混入することになりインデックスホッピングおよびインデックスのミスアサインメントを引き起こす可能性がありますこの可能性を検証するためにアダプターを除去したライブラリープール中に DNA インプット量に対してモル濃度で 0~35% の異なる濃度のアダプターを混合しましたインデックスホッピングの割合は混合したアダプターの増加量に一致して直線的に増加しました ( 図 2) この結果より調製したライブラリーをシーケンスランを行う前に確実に精製することの重要性が示されています図 3: ユニークなインデックスを用いたコンタミネーションの全アダプターの組み合わせのインデックスホッピングの割合 (%) 有効 ( 緑 ) および無効 ( 赤 ) な組み合わせはそれぞれ緑と赤でハイライトされていますインデックスホッピングの発生率はインデックスの組み合わせによって偏りを生じることはありませんインデックスホッピングの影響ライブラリー調製方法はインデックスホッピング率に影響することが示されています一般的に TruSeq DNA PCR-Free Library Prep Kit などのライゲーションのみを行いライブラリー調製を行う方法では TruSeq Nano DNA Library Prep Kit のような PCR 増幅のステップを含むライブラリー調製法よりもインデックスホッピングの割合が高いライブラリーを形成します ( 図 4) 従来のブリッジ増幅による不均一化フローセル上にクラスター形成したライブラリーはインデックスホッピング率 (1%) が ExAmp のクラスター形成による整列化フローセル上のライブラリーをランしたインデックスホッピング率 (2%) と比較して低いことが認められます例えば TruSeq PCR-Free ライブラリーのシーケンスでは整列化フローセルよりも不均一化フローセル上で低いインデックスホッピング率が示されています ( 図 4) 図 2: 遊離アダプターによるインデックスホッピングインデックスホッピングの割合をアダプター混合量に対してプロットしています全インデックスホッピング ( 赤線 ) と混合した遊離アダプター量 ( 黄線 ) との正の相関関係が示されていますインデックスホッピング発生頻度の測定ライブラリーをプールした実験からインデックスホッピングの割合を定量化することができますユニークなペアである i5 および i7 インデックスアダプターを用いて dual index ライブラリーを作成しそれぞれのライブラリーをプールしシーケンスを行った後デマルチプレックスを行いました全ての想定されるアダプターの組み合わせのうち無効な ( サンプルに使用されていない ) 組み合わせのインデックスホッピングの割合を % で示しました ( 図 3) 例えば 0.17% という値は 600 対の正確なインデックスペアあたり約 1 つのインデックスホッピングが発生することを意味しています図 4: インデックスホッピングの発生率の差インデックスホッピングの割合はライブラリー調製方法に関わらず不均一化フローセルよりも整列化フローセルが高いことを示しています PCR 増幅のステップを含むライブラリー調製方法 ( 例 TruSeq Nano) はライゲーションのみの方法 ( 例 TruSeq DNA PCR-Free) と比較して低いインデックスホッピング率を示します RNA シーケンス実験でのインデックスホッピングの影響非常に高い発現マーカーが存在するサンプルの RNA シーケンス (RNA-Seq) に関してインデックスホッピングの一般的な影響の程度を示すために stranded mrna ライブラリーを異なる 2 種類のヒト組織のトータル RNA サンプルから調製しましたこ

3 こでは組織特異的マーカーの発現が非常に豊富な組織 ( 肝臓 ) と特異的なトランスクリプトに偏らない分散型の発現プロファイルを示す組織 ( 脳 ) を選択しましたライブラリーは TruSeq Stranded mrna Library Prep Kit を用いプロトコールに従ってライブラリーを調製しましたサンプルはユニークなインデックスセットを付加しインデックスホッピングを別々に測定しました HiSeq 4000 システムを用いて肝臓と脳のサンプルをミックスしたレーンまたは肝臓サンプルのみ脳サンプルのみの組織別にプールしたレーンで 6 プレックスのランを実施しましたシーケンスデータでデマルチプレックスを行った後 BaseSpace Sequence Hub の RNA Express App と標準的な解析パイプラインを用いて解析を行いましたインデックスホッピング率は解析したレーンにおいて 0.3~0.5% と測定されました FPKM( 遺伝子発現強度の単位 ) の遺伝子発現プロットでは組織サンプルを混合したレーンの脳サンプルにおいてアルブミン ( 肝臓中 120,000~950,000 カウント ) のような肝臓の強発現マーカー遺伝子が検出されましたこれは脳サンプルのみをシーケンスしたレーンには見られていないためインデックスホッピングによって生じた現象であると考えられます ( 図 5 上 ) 組織サンプルを混合したレーンの脳サンプルにおいて認められたこれらの肝臓マーカーは肝臓サンプル中で認められたレベルの ~0.13% であることがわかりました肝臓組織とともにシーケンスした脳サンプルの反復実験を比較解析した FPKM 遺伝子発現プロットではサンプル間での特異的な発現の差は見られず両者が同等のバックグラウンドノイズを示すことを表しています ( 図 5 下 ) これらの結果よりインデックスホッピングの影響を最小にするためには同類のサンプルを一緒にプールすることが最適でありそれによって優位に高発現する転写産物へのインデックスホッピングの解析における影響を軽減することができますインデックスホッピングを減少させるためのベストプラクティスインデックスホッピングの影響を低減させるためにシーケンサーシステムによる特別な推奨方法ライブラリー調製ワークフローおよびアプリケーションが特定されていますインデックスホッピングの影響を減少させるための一般的なガイドラインおよび推奨方法を示します ( 表 1) 推奨する条件以外で調製したライブラリーの保存 ( 表 1) はインデックスホッピング率を増加させることが示されていますそれぞれのライブラリーは 20 で保存し 4 での保存は避けてくださいプールした後できるだけ早くライブラリーをシーケンスするまたは 20 で保存することでインデックスホッピングが低減します図 5: RNA-Seq 解析におけるインデックスホッピングの影響肝臓および脳からのトータル RNA ライブラリーを 6 プレックスで HiSeq 4000 システムを用いてシーケンスしました組織サンプルを混合もしくは別々にプールしてシーケンスを行い比較解析を行った FPKM 発現プロットを示します組織サンプルをプールしたレーンの脳サンプルで非常に高く発現する肝臓マーカー遺伝子の検出 ( 赤色の囲み内 ) はインデックスホッピングの発生を示しています下段のプロットで組織サンプルを混合したレーンの反復実験の比較解析の発現プロファイルではほとんど影響がないことが示されています表 1: インデックスホッピングを低下させるベストプラクティス現象の発生を軽減する方法 / 推奨方法ユニークなインデックスを使用し a dual indexライブラリーを調製 1 レーン当たり 30 カバレッジでヒトゲノムをシーケンス b アダプターの除去 ( 精製スピンカラムなど ) c 推奨温度 20 で調製ライブラリー c を保存同様の RNA-Seq サンプルを混合利点 / 結果インデックスホッピングが生じたリードを Undetermined read をして分類サンプルのプールとインデックスホッピングを回避インデックスホッピング率の低減インデックスホッピング率の低減高発現遺伝子および低発現遺伝子の混入を低下 a. HiSeq X シリーズのシーケンスシステムではサポートされていません b. HiSeq X シリーズのシーケンスシステムのみ可能です c. TruSeq Sample Preparation Best Practice および Troubleshooting Guide をご覧くださいデュアルインデックスシーケンスのためのサンプルプールガイドライン TruSeq High-Throughput(HT)Library Prep Kit にはキットによって DNA アダプタープレート (DAP) または RNA アダプタープレート (RAP) のいずれかが含まれていますアダプタープレートは 96 のユニークなインデックスアダプターのコンビネーションを含む 96 プレートで最大 96 のユニークなインデックス化ライブラリーをマニュアルまたは自動で調製するためにデザインされていますイルミナはアダプタープレートの利用を最大にしインデックスホッピングを低減または同定するために用いる 12 種類の 8 プレックスコンビネーション ( 表 2) または 16 種類の 6 プレックスコンビネーション ( 表 3) に

4 表 2: 8プレックスコンビネーションのためのプールガイドライン座位座位座位座位座位座位 A5 B6 C1 E2 F4 G3 B4 A2 E3 C6 G5 F1 C3 E5 F6 G1 D2 H4 E1 C4 G2 F3 H6 D5 F10 G12 D7 H8 A9 B11 G9 F8 H11 D12 B10 A7 D11 H10 A12 B7 C8 E9 H7 D9 B8 A11 E12 C 座位座位座位座位座位座位 A10 B12 C7 E8 F9 G11 B9 A8 E11 C12 G10 F7 C11 E10 F12 G7 D8 H9 E7 C9 G8 F11 H12 D10 F5 G6 D1 H2 A4 B3 G4 F2 H3 D6 B5 A1 D3 H5 A6 B1 C2 E4 H1 D4 B2 A3 E6 C5 表 3: 6 プレックスコンビネーションのためのプールガイドライン A5 B6 C1 E2 F4 G3 A10 B12 C7 E8 F9 G11 B4 A2 E3 C6 G5 F1 B9 A8 E11 C12 G10 F7 C3 E5 F6 G1 D2 H4 C11 E10 F12 G7 D8 H9 E1 C4 G2 F3 H6 D F10 G12 D7 H8 A9 B11 F5 G6 D1 H2 A4 B3 G9 F8 H11 D12 B10 A7 G4 F2 H3 D6 B5 A1 D11 H10 A12 B7 C8 E9 D3 H5 A6 B1 C2 E4 H7 D9 B8 A11 E12 C10 E7 C9 G8 F11 H12 D10 H1 D4 B2 A3 E6 C5 対する最適なサンプルプールガイドラインを定めていますこれらのユニークなインデックスの組み合わせによって二次解析時にミスアサインされたリードを除去することが可能となりますミスアサインリードは unaligned reads としてフラグされアライメントから除かれますユニークな dual index コンビネーション ( 表 2 3) を用いることは不正確なインデックスを伴うリードがバリアントコールまたは遺伝子発現カウントのアサインメントに確実に影響しないためのベストプラクティスです

まとめマルチプレックス法は NGS 技術の大きな進展と重要性を代表するものでありこれによってサンプル解析量の飛躍的な増加が実現しますしかしマルチプレックス法を用いた場合ライブラリー調製方法または使用するシーケンサーシステムに関わらずインデックスホッピングの可能性が存在しますインデックスホッピングは

5 まとめマルチプレックス法は NGS 技術の大きな進展と重要性を代表するものでありこれによってサンプル解析量の飛躍的な増加が実現しますしかしマルチプレックス法を用いた場合ライブラリー調製方法または使用するシーケンサーシステムに関わらずインデックスホッピングの可能性が存在しますインデックスホッピングはデマルチプレックス時に間違ったインデックスにシーケンスリードのアサインメントを引き起こす可能性がありそれによってミスアライメントおよびデータの品質にネガティブな影響を与える可能性がありますインデックスホッピングの検証の結果ほとんどのアプリケーションの解析結果に大きな影響を与えないことが示されていますインデックスホッピングの恒久的な解決方法は開発中ですが本書はインデックスホッピングを最小にするためのガイドラインとベストプラクティスを提供するものです参考文献 1. Illumina.An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology.2016.Accessed April Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.nucleic Acids Res.2012: Illumina.HiSeq X Series of Sequencing Systems.2016.Accessed April Illumina.Illumina Sequencing Technology.2010.Accessed April イルミナ株式会社東京都港区芝三田ベルジュビル22 階 Tel (03) Fax (03) jp.illumina.com 代理店本製品の使用目的は研究に限定されます販売条件 :jp.illumina.com/tc 2017 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, Design Studio, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Innium, iselect, MiSeq, Nextera, NextSeq, NovaSeq, NuPCR, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, TruSight, VeraCode, the pumpkin orange color, the Genetic Energy streaming bases design は Illumina, Inc. の商標または登録商標ですその他の会社名や商品名は各社の商標または登録商標です予告なしに仕様および希望販売価格を変更する場合があります Pub.No A-10MAY2017-JPN

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