代表的な遺伝毒性試験 in vitro in vivo 変異原性試験遺伝子突然変異染色体異常インディケーター試験 DNA 付加体検出 DNA 損傷と致死 DNA 損傷と遺伝子発現 DNA 鎖切断 DNA 鎖切断染色体異常 DNA 損傷と修復生殖細胞遺伝毒性試験遺伝子突然変異細菌を用いる復帰突

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ひろきまきい
5 years ago
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を誘発する化学物質や物理的因子の性質遺伝毒性 Genotoxicity より広義の変異原性必ずしも娘細胞や次世代には伝わらない DNA や染色体の変化 ( 例えば DNA

1 資料 2- gpt delta マウスラット遺伝子突然変異試験 gpt delta マウス (C57BL/6J) gpt delta ラット (S.D., F344, Wistar-Hannover) 変異原性 Mutagenicity 娘細胞あるいは次世代に伝わる遺伝情報の変化 ( 例えば突然変異 ) を誘発する化学物質や物理的因子の性質遺伝毒性 Genotoxicity より広義の変異原性必ずしも娘細胞や次世代には伝わらない DNA や染色体の変化 ( 例えば DNA 損傷 ) も含め DNA や染色体の構造に変化を誘発する化学物質や物理的因子の性質遺伝毒性発がん物質の作用に閾値はないと言われるが本来は DNA と反応して変異原性を示す発がん物質には閾値がないとすべき 2

2 代表的な遺伝毒性試験 in vitro in vivo 変異原性試験遺伝子突然変異染色体異常インディケーター試験 DNA 付加体検出 DNA 損傷と致死 DNA 損傷と遺伝子発現 DNA 鎖切断 DNA 鎖切断染色体異常 DNA 損傷と修復生殖細胞遺伝毒性試験遺伝子突然変異細菌を用いる復帰突然変異試験哺乳類細胞を用いる遺伝子突然変異試験哺乳類培養細胞を用いる染色体異常試験小核試験 32 P ポストラベル法 Rec アッセイ SOS 試験アルカリ溶出法コメットアッセイ姉妹染色分体交換 (SCE) 試験不定期 DNA 合成 (UDS) 試験トランスジェニックマウスラット変異原性試験マウススポット試験ショウジョウバエ眼色復帰突然変異試験小核試験染色体異常試験 32 P ポストラベル法アルカリ溶出法コメットアッセイ姉妹染色分体交換 (SCE) 試験不定期 DNA 合成 (UDS) 試験マウス特定座位試験ショウジョウバエを用いる伴性劣性致死試験 ESTR 突然変異試験染色体異常優性致死試験遺伝性転座試験その他細胞形質転換試験 3 gpt delta トランスジェニックマウス変異検出系変異原 gpt delta マウス (C57BL/6J background) 組織 EG DNA (8 copies/haploid in chromosome 7) ゲノム DNA λ in vitro パッケージング EG ファージ EG red, gam chic 48 kb gpt アッセイ Spi アッセイ loxp gpt cat loxp 6 TG r 変異コロニー点突然変異 Nohmi et al., Environ. Mol. Mutagen., 28, (996) Nohmi et al., Mutat. Res., 455, 9 25 (2) Spi 変異プラーク欠失変異 4

3 大腸菌 gpt 遺伝子大腸菌 gpt 変異体は 6 thioguanine を用いてポジティブに選択できる (6 TG selection) 大腸菌 gpt 遺伝子のコード領域は 456 塩基対大腸菌 gpt 遺伝子が導入されたチャイニーズハムスター AS52 細胞は in vitro 遺伝毒性試験に汎用されている 5 gpt 点突然変異のスペクトル tandem bs complex deletions G:C to T:A - 線 ( 肝臓 ) deletions G:C to C:G G:C to T:A tandem bs G:C to A:T UVB ( 表皮 ) MMC ( 骨髄 ) deletions A:T to T:A G:C to A:T G:C to T:A G:C to A:T A:T to G:C G:C to T:A G:C to C:G A:T to T:A A:T to C:G 短い欠失 PhIP ( 小腸 ) ENU ( 骨髄 ) Untreated ( 表皮 ) Nohmi and Masumura, Adv. Biophysics, 38, 97 2 (24) Nohmi and Masumura, Environ. Mol. Mutagen., 45, 5 6 (25) タンデム塩基置換複雑な変異 6

4 Spi (Sensitive to P2 Interference) 選択法 λ ファージ野生型大腸菌 P2 溶原菌プラークプラークができない red, gam, chic P2 溶原菌 Spi - プラーク Nohmi et al., Environ. Mol. Mutagen., 34, 9 5 (999) 7 炭素線 ( Gy) 肝臓線 (5 Gy) 脾臓 Spi - 欠失変異のスペクトル UVB (.5 kj/m 2 ) 上皮 ( 皮膚 ) マイトマイシン C 骨髄 PhIP 大腸 APNH 肝臓 kb kb 2 bp kb - in runs - in non-runs Complex Others 無処理大腸 % 5 % % 8 Nohmi and Masumura, Environ. Mol. Mutagen., 45, 5 6 (25)

gam 遺伝子内の + 挿入とナンセンス変異 9 炭素線照射は Spi - 変異体頻度のみを有意に上昇させる gpt 突然変異体頻度 (x -6 ) 炭素線 gpt Spi - * * Spi

5 Spi - アッセイで検出される変異の種類大きな欠失変異 gam redb reda gam 遺伝子内の - フレームシフト転写の方向 gam, redb, reda は一本の mrna から連続して翻訳されるため gam 遺伝子のストップコドンの位置が変わると下流にある redb, reda の翻訳が進まず結果として gam, redb, reda 全ての機能が不活化する gam 遺伝子内の + 挿入とナンセンス変異 9 炭素線照射は Spi - 変異体頻度のみを有意に上昇させる gpt 突然変異体頻度 (x -6 ) 炭素線 gpt Spi - * * Spi - 突然変異体頻度 (x -6 ) X 線線非照射炭素線 X 線線非照射 * * P <.5 Masumura et al., Environ. Mol. Mutagen., 4, 27-25, 22

6 UVB 照射によって誘発される大きな欠失 λeg UVB (kj/m 2 ).3.5 kb aag c red gam aag tg tg taa taa.5 ggt ggt 2. gcct gcct c bp 93 bp bp 446 bp 5746 bp 595 bp 6244 bp 736 bp 2824 bp 27 + bp 7894 bp Horiguchi et al., Cancer Res., 6, , 2 UVB 照射による欠失変異誘発のメカニズム UVB ^ TC 光生成物 ^ TC DNA 複製鎖切断二重鎖 DNA 切断ヌクレアーゼによる消化短いホモロジー配列ライゲーション短いホモロジー配列なし短いホモロジー配列を持った欠失変異体ホモロジー配列を持たない欠失変異体 2

7 Spi - 変異体の - フレームシフトの多くは連続した塩基部分で起こる AAAAAA AAAAA mutants AAAAA AAAA 4 mutants GGGG GGG mutant CC C mutant tgcatc tgctc mutant cggcag cgcag mutant gam redb reda Frameshift Gam No RedAB 3 種特異的な発がん物質ラットにのみ発がん性を示す物質 Azobenzene* Bromoform* Chlorothalonil Chlorowax Cytembena* N,N -Diethylthiourea 3,3 -Dimethoxybenzidine-4,4 - diisocyanate* Dimethyl morpholinophosphoramidate 2,4-Dinitrotoluene* Malonaldehyde, Na salt Methyl carbamate Nickel subsulfide Nitrilotriacetic acid, 3Na, H2O N-Nitrosodiphenylamine Pivalolactone* * Ames positive マウスにのみ発がん性を示す物質 2-Aminobiphenyl HCl* Benzaldehyde Bis(2-chloro-- methylethyl)ether* Captan* Chlordane Chlorodibromomethane* 4-Chloro-o-toluidine HCl 5-Chloro-o-toluidine p,p -DDE Diethanolamine Di(2-ethylhexyl)adipate N-Methylolacrylamide Methylphenidate HCl 6-Nitrobenzimidazole* Ozone* Zearalenone 4

EG DNA を導入したトランスジェニックラットの樹立 Sprague-Dawley background Benzo[a]pyrene Mutant Frequency ( -6 ) 5 2.5. gpt Spi - 4.2 2.2.2.5 4.6 Chromosome 4q24-q3 62.5 25 Hayashi et al., Env. Mol. Mutagen.

8 EG DNA を導入したトランスジェニックラットの樹立 Sprague-Dawley background Benzo[a]pyrene Mutant Frequency ( -6 ) gpt Spi Chromosome 4q24-q Hayashi et al., Env. Mol. Mutagen., 4, 253, 23 (mg BP /kg) F344 gpt delta ラットを用いた in vivo 変異原性試験 Toyoda-Hokaiwado, Toxicol. Sci., 4, 7-78 (2) Male F344 gpt delta rat 7 week old 9 3 weeks Basal Diet Basal Diet (DEN) DEN (diethylnitrosamine) 2 mg/kg (i.p. once a week) 25 ppm 2,4-DAT 25 ppm 2,4-DAT 5 ppm 2,4-DAT 4 ppm 2,4-DAT 5 ppm 2,6-DAT The dose was reduced to 4 ppm at nine weeks after the initial treatments because of the toxicity 6

9 2,4-DAT はラットの肝臓に gpt 変異を誘発する *** 625.8± ± ±9.6 gpt mutant frequency ( -6 ) ±2.4 Basal Diet ±5.7 * ** ** 2,4-DAT 25 5 (ppm) 3.±.5 * 2,6-DAT DEN 5 ppm * ** *** P <.5 P <. P <. 7 2,4-DAT はラットの肝臓に Spi - 変異を誘発する ** 34.2± ±4.5 Spi - 突然変異体頻度 (X -6 ) ±2. Basal Diet ± ±4.8 ** 2,4-DAT 25 5 (ppm) ** 5.5±2.5 2,6-DAT DEN 5 ppm ** P <. 8

10 2,4-DAT によって誘発される Spi - 変異の多くはフレームシフトである No. Basal diet % SMF b (x -6 ) 5 ppm 2,4-DAT SMF No. % a (x -6 ) -bp frameshift GGGG GGG GGG GG GG G CCCC CCC CCC CC CC C C del. AAAAAA AAAAA AAAAA AAAA AAA AA AA A TTT TT Large deletion 2bps kb > kb Others Total a SMF; Specific Mutant Frequency. 9 まとめトランスジェニック遺伝子突然変異試験はマウスラットの全ての臓器組織で突然変異を検出でき変異を分子解析することができる変異検出系である gpt delta マウスラットで用いられている gpt アッセイは主に塩基置換変異などの点突然変異を検出し Spi - アッセイは主に欠失変異を検出する突然変異のメカニズムを知るためには gpt Spi - 変異体の分子解析が重要である gpt delta マウスは C57BL/6J を背景とし gpt delta ラットは S.D., F-344, Wistar-Hannover を遺伝的背景として樹立されている F344 ラットは発がん試験に汎用されているため F344 gpt delta ラットは試験化合物が発がんの標的臓器に突然変異を誘発するか否かを検討する際に有用である 2

11 発がん物質は遺伝毒性発がん物質と非遺伝毒性発がん物質に分類される遺伝毒性発がん物質非遺伝毒性発がん物質直接作用化学物質あるいは代謝物間接的な作用化学物質あるいは代謝物 DNA と直接反応する発がん物質 Ames 試験 + DNA 反応性の官能基 + ラットとマウスの両方に発がん性を示す複数の臓器に発がん性を示す DNAの構造や遺伝子発現に間接的に影響を与える発がん物質さまざまなメカニズたとえば細胞増殖細胞毒性ホルモン作用 DNAメチル化などにより発がんを促進する Ames 試験 DNA 反応性の官能基ラットあるいはマウスの一方の種の一臓器に発がん性を示す 2 遺伝毒性発がん物質の作用には閾値が存在しないと考えられている遺伝毒性発がん物質非遺伝毒性発がん物質発がんリスク発がんリスク閾値用量食品添加物農薬動物用医薬品としての ADI は設定されない ADI: 一日許容摂取量用量 ADI は NOAEL に基づいて設定される NOAEL: no observed adverse effect level ( 無毒性量 ) 22

12 異なった遺伝毒性試験は異なった事象を観察している DNA 付加体形成 32P ポストラベル法 C G X C G DNA 修復不定期 DNA 合成 (UDS) 試験 DNA 複製停止 SOS 試験 G X DNA 二重鎖切断コメットアッセイ点突然変異 Ames 試験 MLA/TK アッセイ TG 試験 A T 染色体異常染色体異常試験, 小核試験 23 遺伝毒性試験バッテリーの再構築これまでの組合せ ) Ames test 第二の選択肢 ) Ames test 2) in vitro CA or MLA 3) in vivo MN ICH S2(R) ICH = International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use 2) in vivo MN 3) Second in vivo assay 24

13 トランスジェニック (TG) マウス, ラット遺伝毒性試験による発がん物質の予測 No. of carcinogens 9 No. of positives 7 No. of negatives 2 Sensitivity (%) 78 No. of noncarcinogens 3 No. of negatives Specificity (%) 77 TG 試験で陰性となった発がん物質,2:3,4-diepoxybutane;,2-dichloroethane; TCDD; 5-bromo-2 -deoxyuridine; acrylonitrile; arsenite trioxide; carbon tetrachloride; di(2-ethylhexyl)phthalate; dimethylarsinic acid; d-limonene; heptachlor; hydrazine sulfate; methyl bromide; methyl clofenapate; metronidazole; nickel subsulfide; TPA; sodium saccharin; trichloroethylene TG 試験で陽性となった非発がん物質 4-AAF, acetic acid, sucrose Detailed review of transgenic rodent mutation assays I.B. Lambert et al., Mutat. Res., 59, -28 (25) 25

トランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異試験の開発改良 ( ) トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験は, 突然変異検出用のレポーター遺伝子をゲノム中に導入した遺伝子組換えマウスやラットを使用する in vivo 遺伝子突然変異試験である. 小核試験が染色体異常誘発性を検出

トランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異試験の開発改良 ( ) トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験は, 突然変異検出用のレポーター遺伝子をゲノム中に導入した遺伝子組換えマウスやラットを使用する in vivo 遺伝子突然変異試験である. 小核試験が染色体異常誘発性を検出トランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異試験の開発改良 (2014.03.25) トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験は, 突然変異検出用のレポーター遺伝子をゲノム中に導入した遺伝子組換えマウスやラットを使用する in vivo 遺伝子突然変異試験である. 小核試験が染色体異常誘発性を検出する試験であるのに対して, 本試験は遺伝子突然変異を検出する試験であり, 遺伝毒性試験バッテリーにおいて有用な選択肢となる.