Microsoft PowerPoint JEMS公開シンポジウム2（増村）HP用2.pptx

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こうごほがり
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1 ゲノム解析による経世代突然変異の検出国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部増村健一平成 28 年度日本環境変異原学会公開シンポジウム Interaction between Genes and Environment 大規模ゲノム解析データから見えてくるもの内因性 : 活性酸素など外因性 : たばこ紫外線環境食品中の発がん物質などがん遺伝性疾患進化体細胞生殖細胞不活化解毒変異原 ( 代謝活性化 ) 突然変異 DNA 修復複製の誤り DNA DNA 修復 DNA 損傷誤りのない DNA 複製細胞死 2 1

2 Wang et al., frontiers in Genetics 2015 ゲノム解析技術によってヒトの遺伝形質に関する研究が加速している 3 次世代シークエンサー (NGS) を用いたゲノム解析技術の進歩によってヒトゲノム配列の大規模解析が行われるようになった目的 : 疾患原因遺伝子変異の同定診断法治療法の開発新薬開発個別化医療の支援 > 近年の大規模ゲノムプロジェクト国際 1000 人ゲノムプロジェクト ( 2008~2015 日本人 1,070 人分の全ゲノム解析 ( 東北大学東北メディカルメガバンク機構 ) 2015 英国人の 10 万人ゲノムプロジェクト ( 2012~ アジア人の 10 万人ゲノムプロジェクト ( 2016~ 製薬バイオテクベンチャー企業の 10 万人ゲノムプロジェクトいろいろ (Human Longevity, Inc., Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Amgen Inc. etc.) > 臨床現場での利用遺伝子診断治療法の選択 4 2

3 遺伝子疾患の種類 (Wikipedia) 1 染色体異常症 2 単一遺伝子疾患 ( 常染色体劣性常染色体優性 X 連鎖 ) 3 多因子遺伝疾患ゲノム解析によって多くの単一遺伝子疾患の原因遺伝子が同定されてきている家族性遺伝病だけでなく孤発性の遺伝子疾患も大規模ゲノム解析で原因遺伝子の探索同定が可能稀少疾患から生活習慣病などの common disease まで解析対象多因子性疾患では個々の遺伝子の寄与度は異なる ( 複数の遺伝的因子環境因子の相互作用 ) 5 生殖細胞の遺伝子突然変異体細胞変異と異なり生殖細胞系列に生じた遺伝子突然変異は次世代個体に伝わるヒトゲノムの mutation rate はおよそ 1 x 10-8 塩基 / 世代 ( 世代あたり数 10 個の新たな変異が発生 ) 環境変異原によって生殖細胞に生じる遺伝子突然変異およびその次世代影響をどのように評価するか? 6 3

生殖細胞変異原性の評価通常は体細胞と同様の遺伝毒性試験 (in vitro, in vivo) で評価 < 理由 > 1) 既存のデータから体細胞で変異原性を示す変異原は生殖細胞でも変異原性ありとみなせる 2) 経世代の変異原性試験 ( 特定座位試験など ) が実施困難 < 異論 > 1) 既存データが不十分陽性物質に偏っている 2) 生殖細胞特有のメカニズム ( 減数分裂 DNA

4 生殖細胞変異原性の評価通常は体細胞と同様の遺伝毒性試験 (in vitro, in vivo) で評価 < 理由 > 1) 既存のデータから体細胞で変異原性を示す変異原は生殖細胞でも変異原性ありとみなせる 2) 経世代の変異原性試験 ( 特定座位試験など ) が実施困難 < 異論 > 1) 既存データが不十分陽性物質に偏っている 2) 生殖細胞特有のメカニズム ( 減数分裂 DNA 修復不活化 ) 生殖細胞の遺伝毒性試験優性致死試験精子細胞を用いる染色体異常試験コメット試験トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験など Report of the 2013 IWGT workshop on germ cell 7 assays Yauk et al. Mutation Research 2015 環境変異原によって生殖細胞に誘発された遺伝子突然変異の次世代影響をどのように評価するか? ゲノム解析の利用マウスに変異原物質を投与し生殖細胞突然変異および次世代個体ゲノムへの影響を全エキソーム解析を用いて測定した 8 4

5 The 8 weeks old male gpt delta mice were treated with weekly at 85 mg/kg b.w., i.p. for two weeks (week) : Pre-mating periods P() P() Vehicle S S : Mating periods S : Sacrifice ~24 M() G1 () S S 雄マウスに変異原物質 () を投与し 10 週後に無処理雌マウスと交配してG1 個体を得た 9 レポーター遺伝子を用いた遺伝子突然変異試験 (gpt delta マウス ) gpt Mutant frequency (x 10-6 ) Liver Sperm 88.4±25.4 * 44.7± ± ± ±1.7 * 0 ND Vehicle -treated male (n=5) -treated male (n=5) Untreated offspring of -treated father (n=24) 投与雄マウスの肝臓および精子において変異体頻度が増加した F1 個体の体細胞変異体頻度はバックグラウンド値であった 10 5

6 全エキソーム解析 85mg/kg 8 99 Vehicle 投与群と対照群の各 1 家族について全エキソームシークエンシングを行った各家族につき父母子 4 匹 ( 雌雄各 2) の計 6 匹を使用した 11 マウスゲノム DNA (3 Gbase) 断片化エキソン領域 (49.6Mb) を濃縮 (SureSelect Mouse All Exon Kit, Agilent) シークエンシング (Hiseq2000, Illumina)(100bp pair-end) マウスゲノム参照配列にマッピングマッピング後の平均カバレッジ 100 参照配列と比較して 1 塩基変異 (SNVs) の検出 SNVs の親子間比較を行い子で新規に見つかった変異 (de novo mutations) を抽出 ( トリオ解析 ) 変異候補の絞り込み Read depth 40 in all three mice (P, M and F1) Unique mutation only etc. fold-increase plot の作成 12 (performed by Beckman Coulter Genomics and Genaris Inc.) 6

7 次世代個体ゲノムの突然変異頻度 (de novo SNVs) Offspring No. of bases NGScalled mutation father mother sequenced in exon ID ID (depth 40) (depth 40) Sanger seqconfirmed mutation Confirmed mutation frequency (x10-8 base) Average SD 99_1 male ,621, _2 male ,301, _4 female ,273, _5 female ,590, ,786, Control 50_1 male ,874, _2 male ,904, _3 female ,743, _4 female ,877, ,399, NGS 解析によって検出された変異候補のうち投与群では83% (123/148) がサンガー法でも確認できた陰性対照群では疑陽性が多く 25%(3/12) がサンガー法で確認できた 13 次世代個体ゲノムの突然変異頻度 (de novo SNVs) Mutation frequency (x 10-8 base) Control (Offspring of control father) Confirmed mutation False positive (Offspring of -treated father) 投与父マウスの子ゲノムにおいて突然変異頻度は対照群の 17 倍に増加した 14 7

8 誘発突然変異スペクトルの特徴次世代個体ゲノム TGR ( 外来遺伝子 ) hprt ( 内在遺伝子 ) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Control NGS offspring (n=3) This study 1 NGS TGCE offspring offspring (n=123) (n=143) 2 TGR (gpt) bone marrow (n=60) 3 TGR (lacz) liver (n=25) 4 TGR (lacz) bone marrow (n=20) 5 TGR (laci) splenic lymphocytes (n=44) Ins. Del. 6 7 hprt hprt (cdna) (exon3) splenic splenic lymphocytes lymphocytes (n=31) (n=51) A:T to C:G A:T to T:A G:C to C:G G:C to T:A A:T to G:C G:C to A:T 1 Male F1 mice by crossing C57BL/6 x DBA/2 or C3H/He (Sakuraba et al., 2005) 2 Male BDF1 gpt delta mice (Masumura et al., 1999) 3 Female CD2F1 MutaTM mice (Mientjes et al., 1998) 4 Male CD2F1 MutaTM mice (Suzuki et al., 1997) 5 Male B6C3F1 Big Blue mice (Walker et al., 1996) 6 C57BL/6 mice (Dobrovolsky et al., 1999) 7 Male B6C3F1 mice (Walker et al., 1996) 15 全エキソーム解析で検出された de novo 変異のタイプ Control 99_1 99_2 99_4 99_5 total 50_1 50_2 50_3 50_4 total No. No. No. No. No. % No. No. No. No. No. % SYNONYMOUS_CODING NON_SYNONYMOUS_CODING FRAMESHIFT_CODING STOP_GAINED PRIME_UTR PRIME_UTR REGULATORY_REGION SPLICE_SITE INTRONIC INTERGENIC WITHIN_NON_CODING_GENE total

9 ゲノム解析によって生殖細胞突然変異の次世代影響を測定することが可能である再現性? 用量反応性? 全エキソーム解析 (3 用量群 ) Vehicle 10 mg/kg 30 mg/kg 85 mg/kg 中間用量 2 群を加えた全 4 家族 (24 匹 ) のエキソーム解析変異候補の絞り込み条件の改良 ( 疑陽性の低減 ) 17 Masumura et al., in press. Mutation frequency (x 10-8 /base) <4.8 0 mg/kg x2 10 mg/kg x2 次世代個体ゲノムの突然変異頻度 ( 全エキソーム解析 + サンガー法 ) * 30 mg/kg x2 * 85 mg/kg x2 (* p<0.05, Steel test) R² = Total dose of (mg/kg) 投与雄由来の子マウスゲノムにおいて突然変異頻度が用量依存的に増加した 18 Masumura et al., in press. 9

10 まとめ次世代個体の全エキソーム解析を行い germline の突然変異頻度を測定した投与雄由来の子マウスゲノムにおいて突然変異頻度が用量依存的に増加した得られた変異スペクトルは誘発変異の特徴 (A:T bp 塩基置換 ) を反映していた陰性対照群の突然変異頻度は低値でありエキソーム解析では検出限界以下データ量が大きい全ゲノム解析が必要ゲノム解析による変異検出法は変異原の次世代影響の測定に有効と考えられた今後 1 細胞シークエンスや 1 分子シークエンスなどの技術の進歩によって低頻度の体細胞変異 ( モザイク変異ランダム変異 ) の検出構造変異を含めた詳細な解析などが可能になると期待される 19 Acknowledgements Naomi Hokaiwado 1 Akiko Ukai 1 Masamitsu Honma 1 Yoichi Gondo 2 Takehiko Nohmi 3 1 Division of Genetics and Mutagenesis, National Institute of Health Sciences (NIHS), 2 RIKEN BioResource Center, 3 Biological Safety Research Center, NIHS Genaris, Inc. Beckman Coulter Genomics Takara Bio Inc. Grants-in-aid for JSPS KAKENHI ( ) 20 10

トランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異試験の開発改良 ( ) トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験は, 突然変異検出用のレポーター遺伝子をゲノム中に導入した遺伝子組換えマウスやラットを使用する in vivo 遺伝子突然変異試験である. 小核試験が染色体異常誘発性を検出

トランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異試験の開発改良 ( ) トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験は, 突然変異検出用のレポーター遺伝子をゲノム中に導入した遺伝子組換えマウスやラットを使用する in vivo 遺伝子突然変異試験である. 小核試験が染色体異常誘発性を検出トランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異試験の開発改良 (2014.03.25) トランスジェニック動物遺伝子突然変異試験は, 突然変異検出用のレポーター遺伝子をゲノム中に導入した遺伝子組換えマウスやラットを使用する in vivo 遺伝子突然変異試験である. 小核試験が染色体異常誘発性を検出する試験であるのに対して, 本試験は遺伝子突然変異を検出する試験であり, 遺伝毒性試験バッテリーにおいて有用な選択肢となる.