研究成果報告書

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ひさともさどひら
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1 様式 C-19 科学研究費補助金研究成果報告書平成 21 年 5 月 25 日現在研究種目 : 若手研究 ( スタートアップ ) 研究期間 :7~8 課題番号 : 研究課題名 ( 和文 )GJ2 遺伝子優性阻害変異マウスの生後発育段階における外有毛細胞の細胞機能評価研究課題名 ( 英文 )Cellular function of outer hair cell during developmental stage in Gjb2 dominant-negative mutant mice 研究代表者成井裕弥 (NRUI YUY) 順天堂大学医学部助教研究者番号 : 研究成果の概要 : R75W トランスジェニックマウスにおいては生後どの周波数においても歪耳音響放射 (DPOE) の反応が確認されなかった R75W 変異で確認される特徴的な表現型としてコルチトンネルヌエル腔外有毛細胞を取り囲む空間の欠如と支持細胞によって外有毛細胞が圧迫されていることが確認された外有毛細胞の電気的運動性にも成長変化の差は認められなかった今回の研究により支持細胞の通常の成長が外有毛細胞の細胞機能に不可欠であることが確認された交付額 ( 金額単位 : 円 ) 直接経費間接経費合計 7 年度 1,, 1,, 8 年度 1,, 3, 1,5, 総計 2,, 3, 2,7, 研究分野 : 耳鼻咽喉科学科研費の分科細目 : 外科系臨床医学耳鼻咽頭科学キーワード : 非症候性遺伝性難聴 GJ2 遺伝子コネキシン 26 優性阻害変異マウス耳音響放射パッチクランプ 1. 研究開始当初の背景聴覚医学への分子生物学と分子遺伝学の応用は最先端の話題である最近のヒトの研究結果から原因不明の先天性難聴の半数以上が難聴遺伝子の異常によって発症していることが判明した遺伝子変異による難聴の本質的な発症原因の探求にはヒトの病態と類似した動物モデルを開発することが必須である我々の研究グループは世界に先駆けて開発した gjb2 遺伝子の優性阻害効果を示す変異体を作製し gap 結合の障害により蝸牛のコルチ器のイオン環境の変化に基づく二次的な有毛細胞の変性が難聴の原因であることを明らかにした (Hum Mol Genet

2 12: , 3) しかしながらマウスの聴覚の生後の成熟段階での gap 結合に障害に基づくコルチ器支持細胞の変性とそれに付随する二次的な外有毛細胞の変性の詳細な検討は未だなされていないのが現況であるそこでこの遺伝性難聴マウスモデルの発育過程での外有毛細胞の細胞機能を評価することを企画した 2. 研究の目的我々の研究グループが作製した gjb2 遺伝子の優性阻害効果を示すマウス変異体ではヒトの出生直後に相当する2 週齢でコルチリンパ液のイオン環境の変化によるコルチトンネルの消失が認められている同時に外有毛細胞の形態の異常を既に認めていたそこで生後直後から 2 週齢までの蝸牛の発育過程での詳細なコルチ器の三次元構築を薄切連続切片の組織学的観察とパーソナルコンピュータによる再構築作業により解析しイオン動態の障害を確認する外有毛細胞の細胞活性をマウスの歪成分耳音響放射 (DPOE) 専用測定機器を開発して確認するまた細胞膜電位の蛍光指示薬の負荷により支持細胞と有毛細胞の生物活性を in vivo 下で検討する同時にマウスの蝸牛から外有毛細胞を分離単離してパッチクランプ法を用いてその収縮能を in vitro 下で検討する以上の検討により gjb2 遺伝子によるコルチ器の支持細胞と外有毛細胞の変性過程と分子機序を解析できる 3. 研究の方法 (1) ヒトで証明された優性的阻害効果を持つミスセンス変異 R75WをCGプロモーターに組み込み各組織で変異 connex in26を発現させるようにするノックアウトマウスが胎生致死であることが知られているのでプロモーターと変異遺伝子の間にloxP 配列を挿入し変異体の発現がCre recombinaseで調節されるように設計する直鎖化したベクターを受精卵に注入し偽妊娠状態の雌子宮に戻すその結果得られたマウスをCre reco mbinaseを有するトランスジェニックマウスと交配し PCR, RT-PCR 法により内耳で変異遺伝子が発現している個体を選別する (2) 生後 1 日目から14 日目までのコルチ器の成熟段階の時期のマウスを用いて側頭骨の連続薄切切片を作成する顕微鏡にてすべての切片の画像を取り込みパーソナルコンピュータを用いてコルチ器を三次元的に再構築する正常とGjb2 変異マウスにおいてⅰ) 内外有毛細胞の体積 ⅱ) 支持細胞の体積 ⅲ) コルチトンネルの体積を計測比較して Gjb2 遺伝子変異のよるコルチ器のイオン動態と容積の変化に関しての評価を行う (3) マウス専用の DPOE 測定機器の開発を行うマウスの外耳道に使用できるサイズのアタッチメントの開発マウスの可聴域に合わせた音の入出力装置の構成音の入力後のコンピューターによる解析を行うシステムの構成及びプログラミングを施行する (4) 外有毛細胞の細胞収縮蛋白プレスチンの局在を免疫染色で評価する (5)Gjb2 変異マウスを深麻酔下に断頭し側頭骨よりCorti 器を摘出するは酵素処理後 Corti 器から単離する pat ch clamp softwareはjclampを用いパッチクランプ法 whole-cell modeで運動能 (prestin-dependent motility) と運動能の源泉であるモータータンパクの conformational changeを反映するcapaci tanceを測定する prestin-dependent mot ilityは CCDカメラ (Hamamatsu) にて

とりみ取り込みデジタル録画したものを画像解析ソフトDIS (Soll Techno logies) を用いて細胞長を経時的に自動測定するまた capacitance はtwo sin e voltage stimulus protocolにて測定する細胞外液内液はionic blocking so lutionとし浸透圧はglucoseで調整する 4.

27 DPOE threshold (khz) * * * * * * * * * 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 DPOE threshold (3kHz) * * * * * * * * * 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 23 24 25 26 27 (3) コルチ器の電顕像 (とC: 正常体

3 とりみ取り込みデジタル録画したものを画像解析ソフトDIS (Soll Techno logies) を用いて細胞長を経時的に自動測定するまた capacitance はtwo sin e voltage stimulus protocolにて測定する細胞外液内液はionic blocking so lutionとし浸透圧はglucoseで調整する 4. 研究成果 (1) マウス専用のDPOE 測定機器の開発以下の形状のアタッチメントの開発マウスの可聴域に合わせた音の入出力装置の構成音の入力後のコンピューターによる解析を行うシステムの構成及びプログラミングを試作した C DPOE threshold (8kHz) * * * * * * * * * DPOE threshold (khz) * * * * * * * * * DPOE threshold (3kHz) * * * * * * * * * (3) コルチ器の電顕像 (とC: 正常体とD: 変異体 ) R75W 変異で確認される特徴的な表現型としてコルチトンネルヌエル腔外有毛細胞を取り囲む空間の欠如と支持細胞によって外有毛細胞が圧迫されていることが確認される一方で外有毛細胞は細胞膜の直下にある表面下槽 (subsurface cistern) のような外側壁の構造もはっきり確認され通常どおりに成長していた C * * (2)DPOEの実測結果 R75Wトランスジェニックマウスにおいては生後どの周波数においても歪耳音響放射 (DPOE) の反応が確認されなかった IP M TC M OP IP * * DCs OP DCs D M M

4 (4) プレスチンの局在電位依存性のモータータンパクであるプレスチンの蛍光免疫染色を行うと R75Wトランスジェニックマウスおよびノントランスジェニックマウスの両方の外有毛細胞の外側壁にプレスチンの存在が認められた Prestin DPI Prestin DPI P12 Non-transgenic TC P12 (5) 急速単離された外有毛細胞のパッチクランプ法による電気的運動性の結果雑誌論文 ( 計 4 件 ) 1 Kudo T, Kure S, Ikeda K, Xia P, Katori Y, Suzuki M, Kojima K, Ichinohe, Suzuki Y, oki Y, Kobayashi T, Matsubara Y Transgenic expression of a dominant-negative connexin26 causes degeneration of the organ of Corti and non-syndromic deafness. Hum Mol Genet 12: Iizuka T, Kanzaki S, Mochizuki H, Inoshita, Narui Y, Furukawa M, Kusunoki T, Saji M, Ogawa K, Ikeda K.Noninvasive In Vivo Delivery of Transgene via deno-ssociated Virus into Supporting Cells of the Neonatal Mouse Cochlea. Human Gene Therapy 19(4): Inoshita, Iizuka T, Okamura HO, Minekawa, Kojima K, Furukawa M, Kusunoki T, Ikeda K. Postnatal development of the organ of Corti in dominant-negative Gjb2 transgenic mice. Neuroscience 156(4): Narui Y, Minekawa, Iizuka T, Furukawa M, Kusunoki T, Koike T, Ikeda K. Development of Distortion Product Otoacoustic Emissions in C57L/6J Mice. Int J udiol, in press 学会発表 ( 計 2 件 ) 1 Iizuka T, Kanzaki S, Mochizuki H, Inoshita, Narui Y, Furukawa M, Kusunoki T, Saji M, Ogawa K, Ikeda K.Noninvasive In Vivo Delivery of Transgene via deno-ssociated Virus into Supporting Cells of the Neonatal Mouse Cochlea. The 32 nd ssociation for Research Otolaryngology, 9. 2 Inoshita, Iizuka T, Okamura HO, Minekawa, Kojima K, Furukawa M,

5 Kusunoki T, Ikeda K. Postnatal development of the organ of Corti in dominant-negative Gjb2 transgenic mice. The 32 nd ssociation for Research Otolaryngology, 9. 図書 ( 計件 ) 産業財産権出願状況 ( 計件 ) 取得状況 ( 計件 ) その他 6. 研究組織 (1) 研究代表者成井裕弥 (NRUI YUY) 順天堂大学医学部助教研究者番号 : (2) 連携研究者

Untitled

Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 22(2008) 125. 遺伝性難聴病態マウスモデルの根本的治療池田勝久 Key words:gjb2, 遺伝性難聴, コルチ器, アデノ随伴ウイルス, アデノウイルス順天堂大学医学部耳鼻咽喉科緒言先天聾は 1,000 出生に1 人の頻度に発生し, その半数が遺伝性の原因である. 我々は日本人において GJB2 遺伝子変異の重要性を明らかにした 1). 内耳を直接生検することや侵襲的な生理学的検査は困難であり,